基于马立克病病毒Meq蛋白单克隆抗体的免疫组化诊断方法的建立

为了对临床上马立克病(MD)准确诊断,研究利用杆状病毒表达系统表达马立克病病毒(MDV)强毒株Meq重组蛋白免疫小鼠,利用杂交瘤技术研制MDV Meq蛋白特异性单克隆抗体,并以此为基础建立MD诊断方法。结果显示:试验成功制备了4株Meq蛋白特异性单克隆抗体,分别命名为MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10;Western blot结果证明这些单克隆抗体不仅能与体外表达的Meq蛋白反应,而且能识别MD肿瘤细胞系MSB-1中的Meq蛋白和MD肿瘤组织细胞中的Meq蛋白;以Meq蛋白单克隆抗体成功建立免疫组化诊断MD的方法,该方法特异性强,结果稳定,易观察判定。研究表明,试验制备了4株Meq蛋白单克隆抗体(MDV-Meq-1D6、MDV-Meq-1D10、MDV-Meq-6B3、MDV-Meq-6D10),基于此建立的免疫组化MD诊断方法为临床MD鉴别诊断提供技术支撑。

马立克病病毒meq基因缺失毒株HN302Δmeq的构建及致病性分析

马立克病(MD)是由马立克病病毒(MDV)感染引起的一种重要的家禽免疫抑制病与肿瘤病,严重危害世界养禽业。随着MDV持续进化及毒力增强,急需研发新型高效的MD疫苗以加强该病的有效防控。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以MDV变异株HN302为亲本毒株,成功构建了meq基因缺失的毒株HN302Δmeq,经过PCR扩增鉴定及测序分析,证实meq基因缺失且传代稳定。间接免疫荧光试验(IFA)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析均证实HN302Δmeq感染鸡胚成纤维细胞(CEF)中无meq基因表达,并且meq基因的缺失不影响其他病毒基因的表达。利用RT-qPCR分析HN302Δmeq在CEF中的体外增殖曲线,结果显示meq基因的缺失不影响MDV体外复制。1日龄SPF鸡攻毒试验结果显示,与亲本毒株HN302相比,HN302Δmeq对宿主无致病性,其诱导的MD发病率、死亡率和肿瘤发生率均为0,且未观察到明显的免疫器官萎缩。上述数据表明,HN302Δmeq的毒力明显丧失,具备继续作为疫苗候选株开展相关研究的可能性。本研究成功构建了MDV变异株HN302的meq基因缺失毒株,为后续MDV的致病机制及新型疫苗研究奠定了基础。

鸡马立克病毒meq基因克隆及遗传进化分析实验设计

该文设计了一个涉及兽医传染病学、兽医分子生物学等兽医学科专业的探索性实验——鸡马立克病毒meq基因克隆及遗传进化分析实验。实验内容包括通过全自动核酸提取仪、荧光定量PCR仪对鸡组织病料中马立克病毒核酸进行检测,在确定病毒核酸阳性的基础上通过分子生物学手段扩增特征毒力基因meq序列,通过与Genbank已报道的30多株参考毒株序列进行比对,分析该病例马立克病毒的分子特征及遗传进化特点。该实验可锻炼学生的实验动手能力,加深对兽医学相关内容的理解,激发对专业知识的兴趣。

一例鸡马立克氏病的诊断及其病毒Meq基因序列分析

为确定四川省乐山市某蛋鸡场病鸡的发病原因,该试验采用临床剖检、PCR方法对发病鸡进行诊断,并对病毒Meq基因全序列进行PCR扩增、测序和序列分析。剖检结果为病鸡心脏、肝脏和脾脏表面均有白色结节,PCR鉴定结果为马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)阳性。MDV Meq基因全序列长度均为1020bp,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%~99.9%和98.8%~100%,与MDV参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~99.8%和95.9%~99.4%。4个Meq测序序列存在4个新的氨基酸突变位点,均具有D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A氨基酸突变位点,符合MDV强毒株的序列特征。系统发育树显示4株乐山市分离毒株测序序列与近年国内大部分参考毒株聚在同一分支上,亲缘关系较近,未形成明显的地理分支,乐山MDV样品132bp重复序列的拷贝数及Meq基因的变异均符合MDV强毒株的序列特征,且存在新的氨基酸突变。

4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析

根据鸡马立克氏病病毒（MDV）GA株Meq基因序列，设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物，利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段，进行克隆测序，对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析。序列比较显示，不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守，它们相互间氨基酸序列的同源性在96．5％～99．7％之间。4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变；3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变，这两处点突变是国内近几年分离株所特有的，国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化。分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性，但是这些规律性还有待进一步研究。

潜伏期马立克氏病病鸡血清型病毒L-meq、meq基因的比较及遗传分析

从潜伏期感染马立克氏病病毒(MDV)鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得MDV的L-meq、meq基因,将其插入pMD18-T克隆载体,经测序并进行了序列分析。结果表明,L-meq、meq基因同源性很高,L-meq中只有180bp与meq不同。但是采用同样的方法在发病期病鸡淋巴组织中却只能获得MDV的meq基因。为了进一步研究发病期L-meq基因消失的原因,试验对L-meq、meq基因的氨基酸序列的结构域进行了分析。结果表明,L-meq基因中含有9个PRR(proline-rich-reapts)区域,meq中含有6个PRR区域,从而推断PRR区域可能与基因的转录激活及调控病毒DNA复制的功能有关,该180bp插入序列也许能解释初期感染MDV不致瘤的原因,同时也意味着L-meq基因对于潜伏期的维持是必要的。

马立克氏病病毒不同致病型meq基因的比较研究

为了研究马立克氏病病毒 (MDV)的 meq基因与不同毒株致病性的关系 ,应用PCR技术扩增了不同致病型MDV毒株的meq基因 ,测定和比较了它们的核苷酸和氨基酸序列。这些毒株包括 :国际通用I型疫苗毒CV1988/Rispens株和中国特有的疫苗毒 814株、强毒GA株 (vMDV)、特超强毒 6 48A株 (vv +MDV)以及 6个广西分离到的野毒株。结果发现 ,MDV不同致病型的meq基因序列相对比较保守 ,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均在 95 .6 %～ 99.7%。但是 ,与所有测试的致病性MDV毒株相比 ,二个I型疫苗毒CV1988/Rispens株和 814株均在阅读框的核苷酸序列中缺失第 5 75～ 5 77位 3个碱基(CAC) ,导致一个氨基酸 (脯氨酸 )的缺失。该缺失性突变恰恰位于 meq基因的多脯氨酸功能区的一个重复序列 (EELCAQLC STPPPPI)之中。该缺失性突变与一个疫苗毒株失去致肿瘤性是否有关 。

马立克氏病病毒MEQ蛋白单克隆抗体的制备及应用研究

基因表达与病毒感染细胞及致瘤能力之间关系的阐明 ,将有助于我们对马立克氏病病毒 (MDV) meq基因功能的了解 .该研究利用通过杆状病毒载体在昆虫细胞系 SF9上高度表达的 MEQ蛋白免疫 BALB/ c小鼠 ,然后收获其免疫脾细胞与肿瘤细胞系 SP2 / 0通过 PEG于体外融合 .获得的杂交瘤细胞被克隆并通过与MDV感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)做免疫荧光试验 (FA) ,进行其分泌抗 MEQ单克隆抗体 (Mc Ab)能力的筛选 .获得 4株稳定产生抗 MEQ蛋白 Mc Ab的杂交瘤细胞 ,其中 3 G1 2 E6通过 FA和免疫酶组化技术能够检测到 MDV致瘤株感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中表达的 meq基因产物 .研究的结果首次发现 ,MDV致瘤株 GA、RB1 B感染的 CEF及自然 MD肿瘤细胞中均有 meq基因的表达 ,但在弱毒疫苗株 CVI988感染的 CEF和免疫鸡组织细胞中则未检测到 MEQ.作者认为这是由于 meq基因在致瘤株中表达水平高 ,而在非致瘤株中表达水平低所致 ,这可能是决定 MDV毒力 (virulence)或致瘤性(oncogenicity)的关键因素之一 .

马立克氏病病毒致瘤相关基因meq在不同病变组织中的变化

以MSB-1肿瘤细胞建立的马立克氏病为病理模型,利用PCR技术扩增不同病变组织中的meq基因,构建meq基因重组阳性质粒,测定和比较它们的核苷酸和氨基酸序列。结果显示,与L-meq(1 200 bp)和标准株GA的meq(1 020 bp)比较,MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因(1 197 bp)、羽髓meq基因(1 017 bp)分别相应缺失3个碱基(CCA);MSB-1细胞和脾脏肿瘤组织的meq基因具有与L-meq相同的180 bp插入序列;氨基酸序列也发生相应变化。结果表明,meq基因在不同病变组织中的核苷酸序列发生了变化,这种变化可能与马立克氏病病毒的致瘤机制有关。

Ⅰ型马立克氏病强弱毒株Meq基因的克隆与序列分析

[目的]为获得MDV-1强弱毒株Meq基因序列的差异。[方法]根据GENE BANK登录的马立克氏病毒Meq基因序列,设计一对引物,采用PCR技术对MDV-I型国内商用CVI988/Rispens疫苗株和参考强毒京-1(BJ-1)株的Meq基因进行了扩增,并将扩增产物提纯后克隆到pcDNA3.1(+)上,进行酶切鉴定及测序验证。[结果]CVI988疫苗株和BJ-1强毒株的Meq基因开放阅读框(ORF)长度分别为1200和1197bp。通过与国际标准强毒GA株Meq基因进行比较,BJ-1株和CVI988株Meq基因中分别有一段180和177bp的插入序列,第211位核苷酸由G变为T,导致第71位氨基酸由丙氨酸A变为丝氨酸S;同时,CVI988株Meq基因第228位核苷酸由A变为G,导致第77位氨基酸由赖氨酸K变为谷氨酸E。此外,与BJ-1株相比,CVI988株Meq基因在576～578bp之间缺失3个碱基(ACC),并导致第193位脯氨酸P的缺失,该突变发生在一个多脯氨酸重复区域内。[结论]MDV-1强弱毒株Meq基因序列存在明显差异,为从其分子水平进行区分及生物学功能的研究奠定了基础。

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒（MDV）广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,Meq基因序列全长为1 020bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。

马立克氏病病毒meq基因缺失株细菌人工染色体序列自我敲除的分子鉴定

本试验旨在对缺失meq基因的马立克氏病病毒（MDV）感染性克隆基因组中细菌人工染色体（BAC）序列的自我敲除进行分子鉴定。将含有表达cre重组酶真核表达盒的SC9—1重组质粒通过转染鸡胚成纤维细胞（CEF）拯救SC9—1重组病毒。将SC9—1重组病毒在CEF细胞上进行连续传代培养，利用病毒表达的cre重组酶在传代过程中逐步敲除病毒的BAC序列。分别提取1～10代不同代次SC9—1重组病毒的DNA作为模板，利用BAC序列特异性引物对病毒基因组中的BAC进行PCR检测。利用针对BAC序列gpt基因的特异性检测引物，以MDV保守基因pp38作为内参，对不同代次病毒基因组中BAc序列进行荧光定量PCR的检测。利用PCR扩增SC9—1病毒敲除BAC序列后基因组中残留loxp位点两端序列，通过测序分析进一步验证BAC序列的敲除。利用BAC序列特异性引物对不同代次病毒基因组中BAC序列的检测结果显示，1～5代病毒DNA均能扩增出600bp的特异性目的条带，证实病毒的基因组中含有BAC序列。6～10代病毒DNA均不能扩增出特异性目的条带，证实病毒基因组中没有BAC序列。荧光定量PCR结果显示，病毒基因组中的BAC序列随着病毒的传代逐渐减少，直至第6代已经完全检测不到BAC序列。在病毒BAC序列敲除的过程中，对每代病毒BAC序列敲除后残留loxp位点序列进行PCR测序鉴定，结果显示BAC序列敲除后基因组中仅留下一个loxp位点，序列同源性均在99．7％以上。结果表明，利用cre／loxp系统将病毒在CEF细胞上连续6代传代培养可将MDVmeq基因缺失株SC9—1的BAC序列完全敲除掉，且同源重组酶敲除BAC序列具有高度一致性。

马立克氏病病毒meq基因功能研究

从马立克氏病病毒(MDV)不同致病型毒株meq基因序列、meq基因产物及其细胞内表达特性和meq蛋白生物学功能的研究探讨马立克氏病病毒致瘤基因meq功能。完成了648A、CVI988/Rispens、814、广西地方毒株G2、N、0093、0095、0297、0304共9个MDV毒株meq基因的序列测定。MDV不同致病型毒株的。meq基因序列相对比较保守,它们相互间核苷酸和氨基酸序列的同源性均很高;与所有7个致瘤的MDV毒株相比,在2个MDV-1弱毒疫苗CVl988/Rispens株和814株发现有二个特征性位点突变;此外,还在其ORF中首次发现含15个氨基酸残基(EELCAQLCSTPPPPI)的2个重复和含6个氨基酸残基(PPICTP)的4个重复,全分布在MEQ蛋白C-端的转录激活域内。MEQ蛋白的表达仅局限于感染细胞的核内,而且随感染时间增加,具有从核质向核仁和核膜转移趋向;Western Blotting和免疫沉淀试验证实重组杆状病毒感染细胞裂解物中有大小约为60 kD的特异带。利用表达的MEQ蛋白产物免疫BALB/c小鼠,获得的杂交瘤细胞被克隆并与MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)做免疫荧光试验(FA),获得4株稳定产生抗MEQ蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞,其中3G12E6单克隆抗体能够检测到MDV致瘤株感染的CEF及自然MD肿瘤细胞中表达的meq基因产物,而CVl988/Rispens感染的细胞则未检测到。发现细?

马立克氏病病毒河南分离株Meq基因的克隆与序列分析

【目的】了解马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）河南分离株Meq基因的分子特性,为中原地区MDV流行情况提供较详细的信息,为更好地防控MD奠定基础。【方法】应用PCR方法分别扩增了17株MDV河南省野毒分离株的Meq基因片段,克隆测序后,将各毒株Meq基因序列与vv＋MDV 648A株、vvMDV RBIB株、vMDV GA株、mMDV疫苗株CVI988株和814株的Meq基因序列进行比对分析。【结果】17株分离株中除HNGS201和HNLC503的Meq基因扩增产物较预期稍大外,其余15个的片段长度为1 020bp,与预期长度相符;MDV河南分离株之间及其与参考毒株Meq基因的核苷酸同源性为99.0%～100%,部分毒株Meq基因的氨基酸序列有10个位点的氨基酸存在规律性突变;MDV河南分离株和参考株共组成3个进化分支,其中强毒株GA、RB1B和648A位于一个分支,分离株HNGS201、HNLH304、HNLC503与mMDV毒株CVI988和814位于同一分支,其余14株分离株位于另一个较大的分支。【结论】河南省可能流行着不同毒力的MDV,一些mMDV毒株的Meq蛋白存在59个或60个氨基酸的插入。

鸡MDV meq基因对鸡胚成纤维细胞p53基因表达的影响

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR的方法检测了鸡马立克氏病病毒(MDV)meq基因对鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF)p53基因表达的影响,并用本室改进的TRAP法测定了端粒酶活性。结果显示,meq基因激活了CEF中原癌基因p53的表达,并且48 h的表达量是72 h的18.8倍;在对CEF和转染前后48、72 h的细胞端粒酶活性测定时也发现,端粒酶活性在转染后48 h是转染后72 h的16倍。流式细胞仪检测发现meq基因使S期细胞比例较转染前有所上升,进一步印证了meq基因是MDV中致瘤的主要因素。

阴极电泳涂料的制备及MEQ值的测定

采用封闭的甲苯二异氰酸酯作为固化剂合成了环氧树脂阴极电泳涂料,讨论了基料树脂的合成条件,最终确定了合成树脂的反应条件为:温度80℃,反应时间为2h,并采用了简便的方法测定了槽液的MEQ值,在150v下电泳3m in,得到外观平整,综合性能优良的漆膜。

miR-M7-5p靶向调控马立克病病毒原癌基因meq的表达

马立克病病毒(MDV)基因组编码数十个miRNA,并且可能在MDV的感染及致病过程中发挥重要作用。此前研究发现,MDV-1编码的miR-M7-5p在病毒感染宿主发病的过程中具有高水平表达特征,为探讨miR-M7-5p对MDV可能具有的自我调控作用,利用生物信息学方法对MDV编码的蛋白基因进行了扫描分析,预测发现了10个潜在的miR-M7-5p结合靶点,其中包括MDV的原癌基因meq。双荧光报告试验表明miR-M7-5p与meq基因的3′-UTR在体外能够相互作用,qRT-PCR进一步证实miR-M7-5p在体内能够下调meq基因mRNA的转录。结果表明,miR-M7-5p能够自我调控病毒原癌基因meq的表达,在MDV致瘤过程中可能发挥重要作用。

MDV中meq基因对CEF细胞chTERT,chTR表达影响的研究

利用TaqMan探针技术,采用实时荧光相对定量RT-PCR方法检测了MDV中meq基因对鸡胚成纤维细胞(CEF)的端粒酶催化亚单位基因(chTERT)、端粒酶RNA亚基(chTR)表达水平的影响,并用TRAP法测定了端粒酶活性,用流式细胞仪检测了细胞周期的变化.实验结果表明,转染48 h后chTERT表达水平为转染后72 h的16倍,chTR表达水平在转染前后基本不变;转染48 h后CEF细胞的相对端粒酶活性是转染72 h后的12倍;在转染后72 h S期细胞的百分比较未转染细胞显著增加.

马立克氏病病毒L-meq基因的原核表达及多克隆抗体的制备

从潜伏期感染马立克氏病病毒的鸡淋巴组织中提取基因组DNA,采用梯度PCR的方法获得了马立克氏病病毒的L-meq基因,与NCBI数据库已发表的序列(AB091109)相比,同源性达99%。将L-meq基因片段定向克隆到原核高效表达载体pET-28a中,构建pET-28a-L-meq重组质粒。将重组质粒转化受体菌Rosetta中,以IPTG对其进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,结果表明L-meq基因在E.coli Rosetta中得到了正确表达,薄层扫描分析表明,表达蛋白占细菌总蛋白的18.8%,将表达蛋白进行初步的纯化,制备了L-MEQ蛋白的多克隆抗体。用ELISA方法对多克隆抗血清进行鉴定,结果表明其纯化的重组的L-MEQ蛋白具有良好反应原性和特异性。