MEMBRANE STABILIZATION ACTION OF METALLOTHIONEIN ON RAT HEPATIC LYSOSOMES

It is known that the synthesis of metallothionein (MT) is significantly augmented under stress conditions such as intoxication, infection, trauma, inflammation and radiation injury.

内源性抗氧化剂金属硫蛋白对慢性间歇性乏氧引起的心肌损害的保护性作用及机制研究

目的明确慢性间歇性乏氧(CIH)条件下,锌及萝卜硫素(SFN)是否可通过上调金属硫蛋白(MT)在心肌中的表达对CIH所致的心肌损伤发挥保护性作用并探讨其机制。方法8周龄雄性昆明小鼠,随机分为对照组、CIH组、CIH+N.S组、锌防护组、SFN防护组,除对照组外全部暴露于CIH环境下构建CIH引起的心肌损害模型,同时防护组及生理盐水组分别给予硫酸锌(5 mg/kg)、SFN(0.5 mg/kg)、同等体积的0.9%氯化钠溶液。8周后利用超声心动图、天狼猩红染色、免疫组化及免疫印迹等方法检测小鼠心脏结构及功能,心肌组织中胶原纤维、MT、核因子E2相关因子2(Nrf2)及蛋白激酶B(Akt)等细胞因子的表达等。结果CIH组与对照组相比,小鼠心室扩张,心功能降低,心肌纤维化程度增加,差异有统计学意义(P<0.05);硫酸锌及SFN防护组与CIH组相比,小鼠心室扩张、心功能降低、心肌纤维化程度均减轻,差异有统计学意义(P<0.05);硫酸锌及SFN防护组与CIH组相比,小鼠心肌组织中MT、Nrf2及Akt2的表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CIH可导致小鼠心肌损伤,锌及SFN对CIH所致的心肌损伤有保护性作用,这可能与上调MT、Nrf2及Akt2的表达有关。

金属硫蛋白在心肌细胞保护中与抗氧化酶的关系

目的 :探讨金属硫蛋白 (MT)在心肌细胞缺氧 /复氧损伤 (H/R)和预缺氧 (HPC)保护中与抗氧化酶的关系。方法 :建立培养的乳鼠心肌细胞缺氧 /复氧模型 ,检测HPC、锌诱导、外源MT和MT抗体等处理下 ,心肌细胞MT含量变化及抗氧化酶 (SOD ,CAT ,GSHpx)活力的相应变化。 结果 :HPC和锌诱导组MT含量及抗氧化酶的活力均显著高于H/R组P <0 .0 5、P <0 .0 1) :外源MT处理后SOD活力显著高于对照组 (P <0 .0 1) ,CAT和GSHpx活力虽然显著低于对照组但显著高于H/R组 (P <0 .0 1) ;使用MT抗体后 ,酶活力最低。结论 :MT参与HPC的心肌细胞保护作用 。

模拟急性高原低氧对妊娠大鼠及其胎儿、新生儿肝细胞与溶酶体的影响

低气压舱模拟海拔8000m24h。观察对不同期妊娠大鼠、胎儿及新生儿肝溶酶体酶血清转氨酶、肝糖原、蛋白质和总脂水平的影响。证明:22天孕鼠肝细胞及其溶酶体损伤程度比16天孕鼠和非孕鼠严重;对16天和22天胎儿鼠肝溶酶体无明显影响,显示了胎儿肝溶酶体低氧下的高稳定性和母体对胎儿的保护作用;新生儿鼠肝细胞溶酶体对低氧的耐受性明显高于孕鼠与非孕鼠。低氧使孕鼠、胎儿、和新生儿鼠肝细胞糖原含量明显降低。新生儿诞生后肝糖原贮备极度消耗,低氧加剧这种作用。随着胎儿发育,肝蛋白质含量渐增,低氧导致全肝蛋白质量减少。无论孕鼠与非孕鼠,低氧造成肝总脂水平增高。

低氧诱导金属硫蛋白对甲状腺乳头状癌上皮间质转化的影响

目的研究低氧诱导金属硫蛋白(metallothioneins,MTs)对甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法以人甲状腺乳头状癌NPA细胞为研究模型,将其分为正常氧组(21%O2)、低氧组(5%O2)和MTs-siRNA干扰低氧组,Western blot、RT-PCR方法检测各组细胞MTs、上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)和间质细胞波形蛋白(Vimentin)的表达,Transwell/Matrigel方法检测各组细胞侵袭转移细胞数。结果低氧可诱导NPA细胞表达MTs,并伴随有EMT标志性分子E-cadherin表达的下调和Vimentin表达的升高,侵袭细胞数由正常氧组15.6±2.8增加到40.3±5.1,迁移细胞数由25.1±5.6增加到48.7±7.6,均有统计学差异(P<0.01);MTs靶向干扰可有效抑制低氧诱导的MTs蛋白表达,同时E-cadherin表达回升,Vimentin表达下降,侵袭细胞数仅增加到25.7±4.2,迁移细胞数仅增加到35.5±5.4,与低氧组比较均有统计学差异(P<0.05)。结论低氧所诱导表达的MTs对人PTC细胞发生EMT有促进作用,MTs靶向干扰可使EMT受到部分抑制。

急性低压缺氧对大鼠脂质过氧化反应和锌代谢的影响

为观察急性低压缺氧对大鼠脂质过氧化（ＬＰＯ）反应和锌代谢的影响、膳食补锌防护ＬＰＯ的作用及急性低压缺氧对肝脏金属硫蛋白（ＭＴ）的诱导作用，对ＬＰＯ在急性缺氧病理中的作用和急性低压缺氧诱导肝ＭＴ的生理意义进行了初步探讨。ＳＤ种雄性大鼠，给予正常锌（４ｌｍｇ／ｋｇ）或高锌（１５０ｍｇ／ｋｇ）饲料，去离子水，喂养两周后开始实验。低压缺氧暴露在地面环境模拟舱中进行，模拟高度５５００ｍ（大气压力５０．６１ｋｐａ），暴露２４ｈ。ＬＰＯ反应的强弱根据组织中丙二醛（ＭＤＡ）含量的高低判定，锌代谢的观察指标为血清锌，肝细胞浆锌和ＭＴ的水平。低压低氧暴露２４ｈ使正常锌组大鼠所有被检组织ＭＤＡ含量显著升高；使高锌组大鼠心脏和血清ＭＤＡ的含量显著升高，大脑和肺的ＭＤＡ升高不明显；高锌组大鼠肺ＭＤＡ的含量明显低于正常锌组。结果表明，在急性低压缺氧条件下，大鼠ＬＰＯ反应增强，体锌分布改变，肝ＭＴ诱导合成增加，膳食补锌能不同程度地增强大鼠某些组织防护ＬＰＯ的能力。

异丙酚预处理对缺氧/复氧后培养海马神经元金属硫蛋白-3蛋白表达的影响

目的:本研究观察异丙酚对培养海马神经元缺氧复氧后损伤反应的影响及金属硫蛋白-3(metallothionein-3,MT-3)在其中的作用。方法:培养7～10d海马神经元,以不同浓度的异丙酚(50,150,250μmol/L)预处理后24h后,制备缺氧4h后复氧24h模型(H/R),Western blot法检测MT-3蛋白表达水平;以MT-3特异性siR-NA沉默MT-3表达后,采用MTT法观察异丙酚对H/R海马神经元存活率的影响。结果:在H/R条件下,异丙酚可浓度依赖性促进MT-3的蛋白表达。以MT-3siRNA抑制MT-3蛋白表达后,异丙酚提高神经元存活率的作用消失。结论:异丙酚具有神经元保护效应,这一作用可能与其上调MT-3的蛋白表达有关。

大脑皮层神经元膜蛋白构象改变的ESR研究

采用马来酰亚胺标记完整的大脑皮层细胞，观察由低氧引起的ＥＳＲ谱线的变化及脑细胞脂质过氧化程度，低氧引起细胞过氧化物生成增加，膜蛋白构象改变．金属硫蛋白（１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ）能明显抑制过氧化反应，具有一定的抗氧化作用．并对实验的分子机理进行了简要的讨论．

不同发育年龄大鼠肝细胞及其溶酶体对急性低氧的应答

人工低压舱内模拟高原低氧24h,并与2300m对照组比较,观察不同发育年龄大鼠SGOT活力,肝溶酶体总酸性磷酸酶、非沉淀酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶活力及肝重、肝细胞糖原、蛋白和总脂含量的变化。在海拔5000m高度,10天鼠各酶活力、570天鼠总酸性磷酸酶和芳基硫酸酯酶活力明显升高;35和75天鼠各酶活力未见显著变化;在海拔8000m高度,各年龄组鼠上述各酶活力均显著升高。随着海拔高度的升高,各组大鼠肝重呈不同程度的下降,肝细胞糖原含量非常明显地减少,35和75天鼠8000m组全肝蛋白含量下降明显,10、35、75天鼠肝细胞总脂累积。上述结果综合分析表明:低氧致使大鼠肝细胞损伤属一普遍性效应,新生期和老年期大鼠肝细胞耐低氧能力不及幼年期和成年期大鼠。

炎症性肠病中MT、NF-κB及HIF-1α表达的相关性

目的研究金属硫蛋白(MT)、核因子-κB(NF-κB)及缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在炎症性肠病患者的结肠组织及外周血中的表达及临床意义。方法收集2017-062018-06郑州大学第二附属医院住院的炎症性肠病患者结肠组织活检石蜡包埋标本及血清样本,其中UC患者30例,CD患者30例,30例结肠癌手术切除癌旁结肠组织作为组织对照,30例健康志愿者血清标本作为血清对照。分别采用免疫组织化学SABC检测结肠黏膜中MT和NF-κB的表达,ELISA检测外周血血清HIF-1α的含量。结果 MT、NF-κB在各组结肠组织中的表达差异均有统计学意义,HIF-1α在各组外周血血清中的表达差异有统计学意义(P <0. 01)。其中,MT的表达UC组及CD组低于对照组,NF-κB及HIF-1α的表达UC及CD组高于对照组。MT与NF-κB呈负相关(r=-0. 792,P <0. 01); MT与HIF-1α呈负相关(r=-0. 746,P <0. 01); NF-κB与HIF-1α呈正相关(r=0. 814,P <0. 01)。结论 MT表达与NF-κB及HIF-1α表达之间具有相关性,MT表达变化可能影响NF-κB及HIF-1α的表达参与炎症性肠病的发病过程。

肝豆状核变性细胞溶酶体内外铜及铜结合蛋白的分布

研究肝豆状该变性（HLD）的病理机制。以培养的皮肤成纤维细胞为模型，利用电镜X射线显微分析技术研究HLD不同等位基因组成及不同病程患者溶酶体内外铜、硫分布，并进行定量分析。结果：HLD早期患者细胞中溶酶体外的铜含量高于溶酶体内，而随病程延长，铜逐渐呈现溶酶体内分布的特点，且溶酶体外铜含量和硫含量呈正相关。杂合子和对照组溶酶体内外铜含量无显著差异。结论：溶酶体外存在含硫的铜结合蛋白，它和铜的结合降低了游离铜的毒性。细胞膜的铜转运ATP酶的缺陷可能是导致HLD一系列病理变化的根本原因。

低氧暴露经FoxO1介导的蛋白质分解途径降低肌管直径

高原/低氧环境诱导骨骼肌萎缩被认为是一个多系统多器官相互作用的结果,但该过程中低氧对肌细胞的直接作用机制并不明确。本研究拟观察低氧暴露对骨骼肌蛋白质分解相关途径蛋白质的影响,并探究低氧影响肌管直径改变的可能机制。将骨骼肌细胞(L6细胞)分化成肌管后,在1%氧浓度下暴露0 h、6 h、12 h和24 h,使用免疫荧光(IF)观察肌球蛋白重链(myosin)水平,计算肌管直径的改变;Western印迹检测肌球蛋白、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、叉头框蛋白O1(FoxO1)、泛素蛋白酶途径(MuRF1和Atrogin1)和自噬溶酶体途径相关蛋白质(p62、Beclin1、LC3)的水平;IF检测LC3并计算积分光密度值(IOD)。结果发现,低氧干预后,6 h和12 h肌管直径显著减小,同时6 h肌球蛋白的水平显著降低(P<0.05);6 h HIF-1α和FoxO1蛋白质水平显著增加(P<0.05);与0 h相比,低氧干预各时长MuRF1含量都显著增加(P<0.05),Atrogin1水平无显著性变化;与0 h相比,低氧干预各时长p62水平均显著降低,6 h Beclin1水平和LC3 IOD值显著升高,LC3Ⅱ/Ⅰ比值在6 h显著增加,在12 h和24 h显著降低(P<0.05)。本研究提示,低氧暴露(1%氧浓度)诱导L6骨骼肌细胞肌管直径减小,可能机制是HIF-1α调控FoxO1介导的泛素蛋白酶途径和自噬溶酶体途径相关蛋白质造成。

金属硫蛋白介导附子多糖对缺氧复氧心肌细胞的保护

目的:以金属硫蛋白为着眼点,探讨附子多糖对缺氧复氧后心肌细胞的保护机制。方法:建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,将乳鼠心肌细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组、附子多糖组。缺氧/复氧组给予心肌细胞缺氧3 h后复氧6 h;附子多糖组分别给予10.0,1.0,0.1 g.L-1的附子多糖预处理心肌细胞24 h后再予缺氧3 h后复氧6 h。ELISA检测金属硫蛋白的含量,流式细胞仪检测细胞的凋亡率,测定心肌细胞内丙二醛(MDA)的含量和细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量。结果:与缺氧/复氧组相比较,附子多糖可以呈剂量依赖形式地增加金属硫蛋白的合成,减少MDA的生成与LDH的的释放,抑制心肌细胞凋亡,在10.0 g.L-1时作用达到峰值。结论:附子多糖对于缺氧复氧心肌细胞损伤具有保护效应,其机制与附子多糖促进金属硫蛋白的合成,对抗氧化应激损伤,抑制心肌细胞凋亡有关。

金属硫蛋白对慢性间断缺氧所致肾脏损伤的保护作用

目的观察慢性间断缺氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）导致。肾脏损伤的可能机制及金属硫蛋白（metallothionein，MT）是否对其具有保护作用。方法8～10周龄的雄性MT-1过表达（MT．TG）小鼠及其野生型（wT）小鼠各12只，随机数字法分为模拟对照组（n=6）及CIH组（n=6），进行8周缺氧-再氧合模型实验。CIH处理方案为20．9％0：与8％0：吸入氧浓度分数（F．O：）交替进行，30次/h，12h/d，最低氧饱和度变化维持在60％-70％。实验终点采用硫代巴比妥酸比色法测定肾脏组织脂质过氧化产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，并用组织病理学及Western印迹方法检测肾脏损伤及信号通路蛋白的表达情况。结果与模拟对照组比较，wTCIH组肾脏组织纤维化程度及促纤维生长因子结缔组织生长因子（CTGF）、1型纤溶酶原激活物抑制物（PAI-1）蛋白表达显著增加（P〈0．01），而MT-TGCIH组无明显变化。与模拟对照组比较，WTCIH组肾脏组织脂质过氧化产物MDA（也是细胞氧化损伤的指标）显著增加（P〈0．01），而MT．TGCIH组无明显变化。与模拟对照组比较，wTCIH组。肾脏组织缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、转化生长因子131（TGF-β1）蛋白表达及Smad2磷酸化水平显著增加（P〈0．01），而MT-TGCIH组无明显变化。与模拟对照组比较，wTCIH组肾脏组织抗氧化物质MT蛋白表达显著减少（P〈0．01），而MT．TGCIH组无明显变化。结论CIH导致肾脏损伤与氧化应激及氧化损伤有关。CIH可能通过上调肾脏组织的HIF-1α表达，启动TGF-β1-Smad2信号传导通路，最终导致肾脏组织纤维化。抗氧化物质MT对CIH导致的肾脏损伤有保护作用，其可能的机制是MT的抗氧化作用抑制了CIH引起的肾脏组织HIF-1α表达上调，从而抑制了TGF-β1-Smad2信号传导通路。

上皮细胞间质转型相关分子在人甲状腺乳头状癌中的表达及其意义

目的研究上皮细胞间质转型(EMT)相关分子金属硫蛋白(MT)、低氧诱导因子-1α(HIF-1α)和锌指转录因子Snail在人甲状腺乳头状癌中的表达及其意义。方法用免疫组化SP法,检测79例甲状腺乳头状癌及12例结节性甲状腺肿中MT、HIF-1α及Snail的表达情况。结果 79例甲状腺乳头状癌中,MT、HIF-1α和Snail的阳性率分别为56.96%,92.41%,53.16%,且三者的阳性表达对于TNM分期及淋巴结转移均具有显著性差异(P<0.05)。MT与Snail的表达呈显著正相关(P=0.0004),MT与HIF-1α呈显著正相关(P=0.0450),Snail与HIF-1α呈显著正相关(P=0.0008)。结论推测MT、HIF-1α和Snail是针对甲状腺乳头状癌侵袭转移的早期发现及其预后评估的潜在分子标记物。

色素上皮衍生因子和金属硫蛋白2A在心肌细胞缺氧损伤中的作用研究

目的探究色素上皮衍生因子(PEDF)和金属硫蛋白2A(MT2A)在心肌细胞缺氧损伤中的作用。方法采用随机数字表法将20只健康C57 B/6小鼠分为4组,以酶消化法分离出心肌细胞并经MT2A处理后,A组常氧(95%空气+5%CO2)培养,B组、C组、D组均低氧(94%N2+1%O2+5%CO2)培养,其中C组过表达PEDF⁃MT2A,D组采用siRNA阻断PEDF⁃MT2A表达。应用DHR123标记后流式细胞仪检测细胞内活性氧自由基(ROS)表达,Western blotting检测心肌细胞氧化应激丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)分子通路、纤维化基质金属蛋白酶(MMPs)/基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMPs)及收缩功能Ca^(2+)⁃ATP酶mRNA表达水平。结果与A组相比,B、C、D组MT2A蛋白表达明显下降,其反应条带的校正灰度值分别为A组的35.33%、92.06%和49.16%;B组ROS,MAPK信号传导通路相关蛋白ERK、JNK、p38表达水平及Ca^(2+)⁃ATP酶mRNA表达水平较A组明显下降,Ca^(2+)荧光强度减弱,MMPs/TIMPs比值明显升高(P<0.05);C组仅ROS、MMPs/TIMPs比值表达水平较A组明显下降(P<0.05);D组ERK、JNK、p38表达水平及MMPs/TIMPs比值均显著高于A、B组(P<0.05)。与C组相比,D组ROS,MAPK信号传导通路相关蛋白ERK、JNK、p38表达水平及Ca^(2+)⁃ATP酶mRNA表达水平明显下降,Ca^(2+)荧光强度减弱,MMPs/TIMPs比值明显升高(P<0.05);结论PEDF可通过与MT2A的作用,调节相关分子通路,影响心肌细胞氧化应激、纤维化、收缩功能。