MDPV和MDGPV母源抗体对MDPV-MDGPV二联活疫苗抗体水平影响的研究

为明确番鸭细小病毒(MDPV)和番鸭小鹅瘟病毒(MDGPV)母源抗体对免疫MDPV-MDGPV二联活疫苗(下称“二联活疫苗”)番鸭抗体水平的影响,本研究将二联活疫苗分别免疫1日龄不同母源抗体水平的雏番鸭,并设非免疫对照组,分别于免疫前和免疫后不同时间点连同非免疫对照组同时采血,采用乳胶凝集抑制试验(LPAI)分别测定各组雏番鸭血清中MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体效价。并按雏番鸭母源抗体高低分组即:MDPV母源抗体阴性组(<1 log2,A组)、MDPV低母源抗体组(1 log2~3 log2,B组)、MDPV高母源抗体组(4 log2~6 log2,C组)、MDGPV母源抗体阴性组(<1 log2,D组)、MDGPV低母源抗体组(1 log2~3 log2,E组)和MDGPV高母源抗体组(4 log2~6 log2,F组),根据LPAI抗体检测结果分析各免疫组抗体水平变化和非免疫对照组母源抗体消长规律。结果显示:免疫二联活疫苗均可诱导1日龄雏番鸭产生不同水平的LPAI抗体,免疫后7 d(7 dpi)MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体均100%阳性,随后逐渐升高至28 dpi达峰值;其中,7 dpi~28 dpi母源抗体阴性组(A组和D组)的MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体快速升高且明显高于母源抗体阳性组(B组、C组、E组和F组);1 dpi~5 dpi母源抗体阳性组(B组、C组、E组和F组)因母源抗体未衰减,其MDPV LPAI和MDGPV LPAI效价均高于母源抗体阴性组(A组和D组)。非免疫对照组番鸭母源抗体消长分析结果显示不同母源抗体衰减期存在差异,随着日龄增长母源抗体逐渐下降,低母源抗体组(1 log2~3 log2)和高母源抗体组(4 log2~6 log2)分别在8日龄和15日龄时均有80%左右番鸭MDPV LPAI和MDGPV LPAI抗体转为阴性。上述结果表明低母源抗体对1日龄雏番鸭二联活疫苗抗体的产生无明显影响,而高母源抗体对番鸭抗体峰值有一定影响,建议高母源抗体雏番鸭可适当推迟至5日龄免疫。本研究为该二联活疫苗免疫程序的制定提供了科学依据。

策划药物MDPV的研究进展

针对目前出现较多的"浴盐"中的主要成分甲卡西酮类设计药物MDPV的理化性质、药理作用、代谢、检验方法等进行综述,着重介绍了该药物的薄层色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法等鉴定方法的操作、条件与结果等,为公安机关在该类药物的分析与鉴定方面提供一定的帮助。

GPV·MDPV和FAdV-4三重PCR检测方法的建立

[目的]为快速地鉴别鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)和禽腺病毒血清4型(FAdV-4)3种病毒,建立一种特异强、敏感高、重复性好的三重PCR检测方法。[方法]根据Genbank登录的MDPV、GPV和FAdV-4的基因序列,设计3对特异性引物,以提取的核酸为模板,进行PCR特异性、敏感性和重复性试验。[结果]采用所建立的方法能够扩增出GPV、MDPV和FAdV-4特异性片段,且不能检出鸭黄病毒(DFV)、鸭I型肝炎病毒(DVH-Ⅰ)和禽呼肠孤病毒(ARV);GPV、MDPV和FAdV-4核酸模板的最低检测量分别为20、2、2 pg;对8份阳性临床病料进行检测,可见MDPV、GPV和FAdV-4的检出率均为100%。[结论]建立的三重PCR检测方法能够对MDPV、GPV和FAdV-4这3种病毒进行快速、准确的诊断。

策划药物MDPV的检验

本文建立了策划药物亚甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)的气相色谱-质谱(GC-MS)联用、液相色谱-质谱(LCMS)联用分析方法。利用GC-MS联用、LC-MS联用分析技术对MDPV进行分析,得到MDPV的GC-MS分析主要特征离子及LC-MS联用分析分子离子峰、二级质谱碎片峰、三级质谱碎片峰,并对各特征离子及碎片峰进行了归属研究,得到了MDPV的GC-MS联用、LC-MS联用分析的质谱裂解规律及特征离子。

毒品MDPV的检验

MDPV（3,4-Methyl—enedioxypyrovaIerone）化学名为亚甲基二氧吡咯戊酮，分子式为C16H21NO3，其分子量为275g／mol，熔点为238-239℃，结构式见图1。根据纯度不同为白色或浅黄色粉末。MDPV属于去甲肾上腺素，多巴胺重吸收抑制剂（NDRI），药理作用类似甲基苯丙胺，具有中枢兴奋作用，长期或大量服用MDPV可以形成依赖性。本世纪初在欧洲出现MDPV的滥用，

番鸭细小病毒病研究进展

番鸭细小病毒病是由番鸭细小病毒(MDPV)引起的,以腹泻、气喘以及胰脏出血、坏死等为主要症状的急性传染病,目前已成为当前危害我国养鸭业高质量发展最为严重的传染病之一。为深入了解MDPV,做好疫病防控,重点对番鸭细小病毒病的病原学、流行病学、诊断方法、疫苗研究进展及防控等方面的最新研究成果进行综述,以期为从业者正确认知MDPV提供较为系统的内容,也为番鸭细小病毒病的有效防治提供信息支持。

番鸭细小病毒和鹅细小病毒广东株VP1基因的克隆与序列分析

参考GenBank中的MDPVFM株和GPVB株全基因序列 ,设计并合成一对引物 ,分别对MDPVGD株和GPVGD株的结构蛋白基因 (VP1)进行PCR扩增 ,并克隆到pMD18_T载体 ,筛选到重组质粒并测序。通过对MDPVGD株和GPVGD株的VP1基因的核苷酸序列分析 ,这两种病毒VP1基因大小均为 2 199bp ,核苷酸序列同源性为 87% ,而位于VP1基因上的VP2至VP3基因起始密码子之间的核苷酸序列的差异较大 ,同源性仅为 6 4 %。另外对MDPVGD株和GPVGD株与各地方毒株的VP1和VP3基因核苷酸序列的同源性比较 。

高效液相色谱法同时测定三种卡西酮类精神活性物质

目的建立Methylone、4-MEC和MDPV的高效液相色谱检测方法。方法采用HPLC—DAD分析方法。分析柱：ZORBAX Eclipse XDB—C18色谱柱（150mm×4．6mm，3．5μm）。流动相为缓冲液（三氟乙酸和0．005mol／L的三氟乙酸铵．pH3．5）和乙腈，梯度洗脱，流速1mL／min，检测波长280nm。结果Methylone、4-MEC和MDPV在0．01～3mg／mL浓度范围内线性关系良好，R^2分别为0．9999、0．9999和0．9998，日内与日间保留时间和峰面积的相对标准偏差（RSD）均〈5％．检出限分别为0．16μg／mL、0．3μg／mL和0．7μg／mL，平均回收率均在98％以上。结论本方法峰形好，分离度好，线性范围良好，回收率高，适用于疑似违禁品中Methylone、4-MEC和MDPV的定量分析。

基于生物信息学预测的番鸭细小病毒和鹅细小病毒免疫交叉反应研究

通过生物信息学软件开展了基于表位预测的番鸭细小病毒（MDPV）和鹅细小病毒（GPV）免疫交叉反应研究。番鸭细小病毒非结构蛋白线性抗原表位预测结果表明：AA248~252、503~509和545~554可能是线性表位优势区域,与已知的鹅细小病毒非结构蛋白线性抗原表位区进行比较,可能具有交叉反应性的区段为AA503~509。番鸭细小病毒衣壳蛋白线性抗原表位预测结果表明：肽段AA27~33、39~50、67~75、111~115、149~155、260~264、321~325、426~430、448~452、485~489、521~525、540~544和685~691等区域可能是线性表位优势区域,与已知的鹅细小病毒衣壳蛋白线性抗原表位区进行比较,可能具有交叉反应性的区段为AA321~325、426~430、540~544和685~691。

番鸭和鹅细小病毒PCR鉴别方法的建立

根据基因库中番鸭细小病毒 (MDPV)FM株和鹅细小病毒 (GPV)的 B株的基因序列设计了 3个引物 PVC、MDPVdn、GPVdn,分别用 MDPV-DNA、GPV-DNA、MDPV 尿囊液、GPV尿囊液、鸭瘟病毒尿囊液、传染性喉气管炎病毒尿囊液和无离子水对照 ,以 PVC/ GPVdn和 PVC/ MDPVdn特异引物在同一条件下进行PCR扩增 ,产物经 1 0 g/ L的琼脂糖凝胶电泳分析。在 PVC/ GPVdn系统中 ,MDPV-DNA、MD-PV尿囊液、DP、IL T和无离子水对照无条带 ,其余样品均出现约 460 bp的条带 ,在 PVC/ MD-PVdn系统中 ,只有 MDPV-DNA、MDPV-GPV混合 DNA、MDPV尿囊液中出现约 90 0 bp的条带 ,其余无特异性核酸带 ,对 MDPV-DNA的敏感性达 0 .5pg,对 MDPV尿囊液敏感性为 1 0 0 0EL D50 / 5μL ,对 GPV-DNA的敏感性为 0 .5pg,对 GPV尿囊液敏感性为 1 0 EL D50 / 5μL。分别将不同时间提取 0 .5ng/ μL MDPV-DNA、0 .5ng/μL GPV-DNA、MDPV尿囊液、GPV尿囊液和无离子水对照样 ,以 PVC/ GPVdn和 PVC/MDPVdn特异引物进行 PCR扩增 3次 ,结果稳定。表明该 PCR检测技术可灵敏。

番鸭细小病毒NS2原核表达载体的构建

根据已发表的番鸭细小病毒(MDPV)核苷酸序列设计并合成1对引物,对MDPV非结构蛋白NS2基因进行扩增。所获得的PCR产物与预期片段大小相符,约1.4 kb。将该片段直接与pMD18-T载体连接,转化入感受态大肠杆菌DH5α中增殖。在对所提质粒进行快速鉴定、PCR扩增及BamHI酶切线性化初步鉴定的基础上,经限制性内切酶BamHI和SalI进行双酶切鉴定。将克隆产物pMD18-T-NS2与原核表达载体pET-32a分别用BamHI和SalI双酶切后,回收目的片段进行定向连接,并转化入感受态大肠杆菌DH5α中。对所获得的重组质粒分别经BamHI单酶切、BamHI和SalI双酶切,证实含有目的基因,且基因插入方向正确,成功构建了含有MDPV NS2非结构蛋白基因的原核表达载体,为高效原核表达及研制更为有效的基因工程疫苗打下了基础。

雏番鸭细小病毒病病毒分离鉴定

采集以腹泻、呼吸困难为主要症状的雏番鸭肝、脾病料 ,接种 14d龄非免疫番鸭胚 ,80 %胚在 3～ 7d死亡 ,胚体呈弥漫性充血、出血。接种番鸭胚成纤维原代细胞 72h可见细胞圆缩、聚团等变化。收集尿囊液及细胞培养物 ,以番鸭细小病毒 (Muscovyducklingparvovirus ,MDPV)阳性血清进行聚苯乙烯乳胶凝集 ,病料培养物均呈阳性反应 ,提取病料接种的尿囊液及细胞基因组DNA ,用自行设计引物PCR扩增到与设计相符的 60 0bp片段 ,经酶切鉴定 ,结果表明克隆到的片段为雏番鸭细小病毒特异性片段 。

鹅细小病毒与番鸭细小病毒PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank上登录的鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的基因序列,针对两种病毒非结构蛋白(NS)和VP1基因序列的相同区段,分别设计两对引物GPV U.L-1和MDPV U.L-1,以GPV-GZ1株的鹅胚尿囊液和MDPV的番鸭胚尿囊液提取核酸作为模板,分别建立了检测GPV和MDPV的PCR方法。特异性试验结果显示,引物GPV U.L-1仅特异性扩增出GPV-GZ1和GPV-GZ2株分子长为622 bp核酸片段,引物MDPVU.L-1仅特异性扩增出MDPV分子长为624 bp核酸片段,而对DPV、GPMV的核酸扩增结果均为阴性;敏感性试验结果显示,建立的PCR方法能检测到0.144 pg的GPV核酸和28.8 pg的MDPV核酸。结果表明,建立的PCR方法特异性强、敏感性高,可用于GPV或MDPV临床感染病例的鉴别诊断。

番鸭细小病毒NS2基因的克隆和序列分析

本研究参考GenBank发表的MDPVFM株全基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR技术扩增出MDPVS1株NS2基因,目的片段长约1.3 kb,将目的片段克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和分析,结果表明,MDPVS1株NS2基因全长1357 bp,编码451个氨基酸,与国外已发表的MDPVFM株相比核苷酸序列同源性为99.26%,推导氨基酸序列同源性为98.23%。

番鸭细小病毒病实验室诊断方法的研究进展

番鸭细小病毒病由番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）引起,以1~3周龄雏番鸭为易感的一种急性传染性、高死亡率的病毒病。番鸭细小病毒病一般可根据临床症状和剖检病理变化及其流行病学等情况作出初步诊断。然而在染病番鸭表现出非典型症状时很容易与番鸭的鹅细小病毒感染、雏鸭病毒性肝炎等疾病混淆,容易误诊。因此,对该病的确诊主要依靠血清学或病原学等实验室诊断方法。文章从血清学和分子生物学诊断方法两个方面综合阐述了番鸭细小病毒检测方法的研究进展。

鸭瘟病毒和番鸭细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

为建立一种能同时鉴别鸭瘟病毒(DPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的双重PCR方法,根据DPV UL6基因和MDPV NS-VP1基因分别设计并合成两对特异性引物,通过对双重PCR反应的引物浓度和退火温度优化,建立了能快速检测DPV和MDPV的双重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。结果表明:设计的两对特异性引物均能扩增出目的条带,其大小分别约为376 bp和624 bp;优化引物浓度组合为:DPV引物1.0μmol/L,MDPV引物2.5μmol/L,最佳退火温度为52.4℃。DPV和MDPV的核酸最低检出量分别为4 pg和173 pg,建立的双重PCR分别对鹅细小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸭疫里默氏杆菌、沙门菌、大肠杆菌、葡萄球菌、鸭源巴氏杆菌核酸扩增结果均呈阴性;对实验室保存的9份临床病料检测结果DPV检出率33.3%(3/9),MDPV检出率55.6%(5/9)。综上所述,建立的双重PCR方法特异性强、敏感性和稳定性较好,为DPV和MDPV的临床病料检测提供了技术支撑。

液相色谱-串联质谱法测定策划药物MDPV及其代谢物

目的：建立日益流行的策划药物亚甲二氧吡咯戊酮（MDPV）及其体外代谢产物的液相色谱-质谱（LC-MS）联用测定方法。方法：采用Thermo Gold ODS色谱柱（150 mm×2.1 mm,5μm）,以0.1 mmol·L^-1醋酸铵-甲酸缓冲溶液（p H 4.5）为流动相A,甲醇为B进行梯度洗脱（0～1 min,10%B;1～6 min,10%B→90%B;6～14 min,90%B）,流速0.20 mL·min^-1;采用电喷雾离子化源,正离子检测方式,全离子扫描、选择反应监测扫描模式检测并鉴定MDPV及其代谢产物。结果：在大鼠肝微粒体S9组分中鉴定得到MDPV的4种体外代谢产物。结论：所建立的方法用于策划药物及其代谢物的分析,不仅可以节省分析时间、减少实验成本,而且具有高效、灵敏和选择性好等特点。

小体积液相萃取-GC/MS法检验尿液中的MDPV

目的建立小体积液相萃取-GC/MS法检验尿液中的MDPV分析方法。方法将添加MDPV标准品的尿液调p H值为9,采用小体积二氯甲烷进行提取,有机相直接进行GC/MS分析。结果 MDPV的线性范围为0.05μg/m L-0.20μg/m L(R2=0.9965),检出限为0.02μg/m L,提取回收率高于85%,精密度小于10%。结论本文建立的方法操作简单、灵敏、快速、经济,适用于吸毒检验工作中尿液中MDPV的检验。