miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

lncRNA MIR17HG调节miR-214-3p/RNF38信号轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)人类微小RNA17簇宿主基因(MIR17HG)调节微小RNA(miR)-214-3p/环指蛋白38(RNF38)信号轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法收集2022年5月至2023年10月于本院行手术切除的46例肝癌患者的癌组织及癌旁组织,检测lncRNA MIR17HG、miR-214-3p和RNF38的表达。体外培养HepG2、Bel-7402、SMMC-7721、HL-7702细胞,并比较lncRNA MIR17HG、miR-214-3p和RNF38的表达,选择Bel-7402细胞继续研究,随机分为sh-NC组、sh-MIR17HG组、anti-NC组、anti-miR-214-3p组和Bel-7402组。探究各组Bel-7402细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,蛋白质印迹法分析RNF38、半胱天冬酶-3(caspase-3)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白表达,双荧光素酶验证lncRNA MIR17HG与miR-214-3p以及miR-214-3p与RNF38的关系。结果肝癌组织中lncRNA MIR17HG、RNF38的mRNA表达较高,miR-214-3p的mRNA表达较低,RNF38的蛋白阳性表达率较高(P<0.05)。细胞SMMC-7721、HepG2、Bel-7402中lncRNA MIR17HG mRNA、RNF38 mRNA和RNF38蛋白表达高于HL-7702细胞,miR-214-3p mRNA表达低于HL-7702细胞(P<0.05)。与Bel-7402组、sh-NC组比较,sh-MIR17HG组OD 450nm值、克隆细胞数、侵袭细胞数、迁移细胞数和RNF38、MMP2、Bcl-2、MMP9表达减少,凋亡率和caspase-3表达增加(P<0.05);与sh-MIR17HG组、anti-NC组比较,anti-miR-214-3p组OD 450nm值、克隆细胞数、侵袭细胞数、迁移细胞数和RNF38、MMP2、Bcl-2、MMP9表达增加,凋亡率和caspase-3表达减少(P<0.05)。lncRNA MIR17HG与miR-214-3p以及miR-214-3p与RNF38分别存在靶向关系。miR-214-3p+WT-MIR17HG组荧光素酶活性低于miR-NC+WT-MIR17HG组(P<0.05),miR-214-3p+WT-RNF38组荧光素酶活性低于miR-NC+WT-RNF38组(P<0.05)。结论lncRNA MIR17HG可能通过调控miR-214-3p/RNF38轴促进肝癌细胞的恶性生物学行为。

CircRNA-Tbpl1海绵吸附miR-214-3p调控自噬在低氧性肺动脉高压血管重塑中的作用及其机制

目的 探讨CircRNA-Tbpl1通过海绵吸附miR-214-3p调控自噬在低氧性肺动脉高压(HPH)血管重塑中的作用,并分析其机制。方法 12只8周龄C57BL/6雄性小鼠根据随机数字表法分为两组:对照组和HPH组,每组6只,通过低氧构建HPH模型小鼠,观察两组小鼠血流动力学差异,HE染色检测肺组织病理学改变,蛋白免疫印迹(Western blot)检测选择性自噬接头蛋白(p62)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)和重组人自噬效应蛋白(Beclin-1)水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CircRNA-Tbpl1和miR-214-3p表达水平。分离小鼠原代肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)并进行高、低氧分组培养,低氧处理PASMCs,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞活性,Western blot检测自噬相关蛋白表达,qRT-PCR检测CircRNA-Tbpl1的相对表达水平。通过转染和自噬诱导剂雷帕霉素干预,分析CircRNA-Tbpl1与PASMCs自噬的相关性。通过共转染shCircRNA-Tbpl1和miR-214-3p抑制物,分析CircRNA-Tbpl1/miR-214-3p对低氧诱导的PASMCs自噬和细胞增殖活性的影响。结果 与对照组小鼠比较,HPH组小鼠的右心室收缩压(RVSP)[(39.50±3.69)mmHg比(21.00±3.42)mmHg,P<0.01]、右心室肥厚指数(RVHI)[(0.43±0.05)比(0.24±0.03),P<0.01]显著增加,且HPH组小鼠肺血管出现明显的中膜肥大和外膜增生,肺血管重塑。同时,HPH组小鼠的肺组织中LC3Ⅱ、Beclin-1表达水平显著上调,p62表达下调,CircRNA-Tbpl1水平[(2.99±0.28)比(1.00±0.15),P<0.01]升高,miR-214-3p水平[(0.49±0.28)比(1.00±0.11),P<0.01]降低。与高氧组比较,低氧组PASMCs细胞增殖活力[(152.02±7.81)%比(100.00±2.08)%,P<0.05]增加,LC3Ⅱ和Beclin-1表达水平上调,p62表达下调,CircRNA-Tbpl1水平[(2.84±0.34)比(1.00±0.12),P<0.01]升高,而miR-214-3P水平[(0.52±0.07)比(1.00±0.15),P<0.01]降低。此外还发现,下调CircRNA-Tbpl1可抑制低氧诱导的PASMCs自噬,减弱细胞增殖活性[(70.23±7.30)%比(100.00±4.56)%,P<0.05]。双荧光素酶报告基因检测结果显示,CircRNA-Tbpl1海绵吸附miR-214-3p。与sh-NC组比较,sh-CircRNA-Tbpl1组的自噬水平减弱,细胞增殖活力降低[(71.13±8.17)%比(100.00±5.32)%,P<0.05]。与sh-CircRNA-Tbpl1+miRNA-NC组比较,sh-CircRNA-Tbpl1+miR-214-3p抑制物组的自噬水平升高,细胞增殖活力增强[(85.78±5.37)%比(69.80±6.34)%,P<0.05]。结论CircRNA-Tbpl1可能通过海绵吸附miR-214-3p抑制低氧诱导的自噬,从而缓解HPH血管重塑。

奥美拉唑抑制miR-214-3p介导自噬提高上皮性卵巢癌细胞对顺铂的敏感性

目的 探讨奥美拉唑(omeprazole, OME)能否通过抑制自噬提高人卵巢上皮性癌(卵巢癌,EOC)细胞对顺铂的敏感性及其可能机制。方法 原位杂交及免疫组化检测卵巢癌组织中miR-214-3p及自噬标记物p62表达;Pearson相关分析探讨R-214-3p和p62在EOC组织中表达量的相关性;CCK-8法检测各组细胞顺铂半数抑制浓度(IC50);实时定量PCR(qRT-PCR)分析miR-214-3p及多药耐药基因-1(MDR1)表达;蛋白质印迹法检测p62及耐药蛋白p-gp表达。结果 在43例卵巢癌患者的样本中,23例(53.5%)miR-214-3p表达阳性,26例(60.5%)p62表达阳性,miR-214-3p在铂相对耐药EOC中表达低于铂敏感EOC(P<0.05);相反,p62在铂相对耐药EOC中表达明显高于铂敏感EOC(P<0.01)。miR-214-3p和p62在卵巢癌中表达呈负相关(r=-0.387,P=0.005);OME(150μmol/L)预处理后,OV2008及C13K细胞对顺铂IC50均有不同程度降低,尤以顺铂耐药株C13K更为显著(P<0.01)。与空白对照组C13K及OV2008细胞比较,顺铂作用后,C13K及OV2008细胞中miR-214-3p相对表达下降,MDR1基因在mRNA及蛋白水平表达均升高,p62蛋白表达升高(均P<0.01);相反,OME(150μmol/L)预处理可使C13K及OV2008细胞对顺铂敏感性增加,细胞中miR-214-3p相对表达明显升高、MDR1在蛋白及mRNA水平表达降低、p62蛋白表达下降(均P<0.05)。结论 OME预处理可提高卵巢癌细胞对顺铂敏感性,其机制与抑制miR-214-3p介导的自噬有关。

仙茅苷调节lncRNA KCNQ1OT1/miR-214-5p轴对骨质疏松大鼠骨代谢的影响王勤俭张攀张睿昕李泊泊

目的探讨仙茅苷调节长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)/miR-214-5p轴对骨质疏松大鼠骨代谢的改善作用。方法SD大鼠分为对照组、模型组、仙茅苷组、pcDNA组、pcDNA-KCNQ1OT1组、仙茅苷+sh-NC组、仙茅苷+sh-KCNQ1OT1组。ELISA法检测血清中骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平;三点弯曲实验检测股骨最大位移、最大载荷;Micro-CT检测骨微结构变化;HE染色检测股骨病理变化;qRT-PCR检测股骨中lncRNA KCNQ1OT1、miR-214-5p表达;验证lncRNA KCNQ1OT1与miR-214-5p的关系。结果与对照组比较,模型组骨小梁结构紊乱,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达降低,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达升高(P<0.05);与模型组比较,仙茅苷组骨小梁排列间隙变小,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达升高,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达降低(P<0.05);与pcDNA组比较,pcDNA-KCNQ1OT1组股骨组织病理损伤有所缓解,OCN、ALP水平、股骨最大位移、最大载荷、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨体积分数及lncRNA KCNQ1OT1表达升高,TNF-α、IL-6水平、miR-214-5p表达降低(P<0.05);sh-KCNQ1OT1逆转了仙茅苷对骨质疏松症大鼠炎症反应及骨生物力学性能的改善作用以及成骨促进作用;lncRNA KCNQ1OT1靶向调控miR-214-5p。结论仙茅苷可能通过调控lncRNA KCNQ1OT1/miR-214-5p轴改善骨质疏松症大鼠骨代谢。

IS患者血清lncRNA PVT1、miR-214水平与继发性癫痫的相关性分析

目的 探讨缺血性脑卒中(IS)患者血清长链非编码RNA变异性浆细胞瘤异位1 (lncRNA PVT1)、微小RNA-214 (miR-214)水平与继发性癫痫的相关性。方法 选取2018年6月至2021年6月眉山心脑血管病医院神内八科收治的280例IS患者作为研究对象,根据患者1年内是否发生继发性癫痫,分为单纯IS组(212例)和继发性癫痫组(68例),根据癫痫的严重程度分为轻度癫痫组(19例),中度癫痫组(33例),重度癫痫组(16例)。另选取同时期来眉山心脏血管病医院神经八科体检的150例健康者作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法测定所有受试者血清lncRNA PVT1、miR-214水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清中白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)水平;经Pearson法分析lncRNA PVT1与miR-214的相关性,及两者与IL-1 β、IL-6、TNF-α的相关性;采用多因素Logistic回归分析影响IS患者是否发生继发性癫痫的有关因素。结果 与对照组比较,单纯IS组和继发性癫痫组患者血清lncRNAPVT1水平明显升高,血清miR-214水平明显降低(P<0.05);与单纯IS组比较,继发性癫痫组患者血清lncRNA PVT1水平明显升高,血清miR-214水平明显降低(P<0.05)。与轻度癫痫组比较,中度癫痫组和重度癫痫组患者血清lncRNA PVT1水平明显升高,血清miR-214水平明显降低(P<0.05);与中度癫痫组比较,重度癫痫组患者血清lncRNA PVT1水平明显升高,血清miR-214水平明显降低(P <0.05)。继发性癫痫组患者血清lncRNA PVT1与IL-1 β、IL-6、TNF-α均呈正相关(P <0.05),血清miR-214与IL-1 β、IL-6、TNF-α均呈负相关(P <0.05),血清lncRNA PVT1与miR-214水平也呈负相关(P <0.05)。多因素Logistic回归分析表明,IL-1 β、IL-6、TNF-α、lncRNA PVT1及miR-214均与IS患者继发性癫痫的发生有关(P <0.05)。结论lncRNA PVT1水平升高及miR-124水平降低与IS患者继发性癫痫的发生有关,可作为评估IS患者发生继发性癫痫的血清标志物。

miR-214-3p在骨质疏松大鼠弓状核表达变化中的初步研究

目的研究miR-214-3p在骨质疏松大鼠弓状核的表达,初步揭示其在骨质疏松发生发展中的作用。方法将4月龄雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组,每组6只,实验组行切除卵巢手术,对照组行假手术,常规饲养8周。应用苏木精-伊红染色法和骨形态计量学检测大鼠胫骨干骺端骨密度;生物信息学分析弓状核miR-214-3p作用的靶基因;荧光定量聚合酶链反应法测定大鼠弓状核阿黑皮素原mRNA表达水平以及弓状核、血清miR-214-3p表达水平;免疫组织化学染色法测定大鼠下丘脑弓状核阿黑皮素原表达强度。结果与对照组比较,实验组大鼠胫骨干骺端骨小梁数量、骨小梁厚度和骨小梁面积百分比均明显减小(均P<0.01),骨小梁分离度明显升高(P<0.01);实验组弓状核miR-214-3p表达水平升高(P<0.05),同时血清miR-214-3p表达水平明显升高(P<0.01);生物信息学分析显示miR-214-3p与阿黑皮素原具有良好的靶向关系;与对照组相比较,实验组弓状核阿黑皮素原mRNA的表达水平降低(P<0.05),弓状核阿黑皮素原蛋白表达强度明显降低(P<0.01)。结论骨质疏松大鼠弓状核miR-214-3p表达水平升高,可通过其自身或调控阿黑皮素原影响骨质疏松的发生发展。

miR-214-5p调控MFG-E8表达参与主动脉瓣膜间质细胞成骨样分化

目的研究乳脂球表皮生长因子8(milk fat globule-epidermal growth factor 8,MFG-E8)对主动脉瓣膜间质细胞(aortic valve interstitial cells,AVICs)成骨样分化的影响,并寻找调控其表达的微小RNA(microRNA,miRNA),探讨其在钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)发病机制中的作用。方法收集因CAVD行主动脉瓣置换手术患者的钙化瓣膜标本及因扩张型心肌病行心脏移植手术患者的非钙化瓣膜标本,通过免疫组织化学染色及Western blot实验检测MFG-E8在钙化瓣膜及非钙化瓣膜中的表达;分离AVICs进行体外培养,通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默MFG-E8及成骨培养液(osteogenic medium,OM)干预,研究MFG-E8在AVICs成骨样分化中的作用;TargetScanHuman网站预测调控MFG-E8表达的miRNA并对其功能进行检测;real-time PCR检测miRNA在钙化及非钙化瓣膜中的表达差异。结果与非钙化瓣膜相比,钙化瓣膜中MFG-E8表达显著上调;以siRNA沉默MFG-E8显著抑制了OM诱导的AVICs成骨样分化;miR-214-5p可影响MFG-E8表达从而调控AVICs成骨样分化;相较于非钙化瓣膜,钙化瓣膜中miR-214-5p表达显著下调。结论miR-214-5p通过调控MFG-E8表达参与主动脉瓣膜间质细胞成骨样分化,在CAVD发病机制中可能发挥重要作用。

circZMIZ1调节miR-214-3p/GPX4轴对前列腺癌细胞铁死亡的影响

目的:探究circZMIZ1对前列腺癌(PCa)细胞铁死亡的影响及分子机制。方法:比较人正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)和PCa细胞系(22Rv1、VCaP、PC3和DU145)中circZMIZ1、miR-214-3p以及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA和蛋白表达;通过双荧光素酶报告基因、RNA pull-down和RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验验证PC3细胞中circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的调控关系。PC3细胞转染si-NC、si-circZMIZ1、inhibitor-NC、miR-214-3p inhibitor后,检测细胞中circZMIZ1、miR-214-3p和GPX4的表达、细胞增殖、LDH活性、细胞凋亡以及细胞内亚铁离子(Fe2+)含量和丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平,细胞内活性氧(ROS)水平。构建PCa裸鼠皮下移植瘤模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、GPX4、circ‑ZMIZ1、miR-214-3p表达情况。结果:与RWPE-1细胞相比,PCa细胞系(22Rv1、VCaP、PC3和DU145)中circZMIZ1、GPX4 mRNA和GPX4蛋白水平升高,miR-214-3p水平降低(P<0.05)。circZMIZ1可以靶向结合PCa细胞中的miR-214-3p,GPX4是miR-214-3p的靶标。敲低circZMIZ1可上调miR-214-3p表达,降低GPX4表达,抑制PC3细胞增殖,促进LDH释放,诱导细胞凋亡,且敲低circZMIZ1可增加细胞内Fe2+含量和提高MDA、ROS水平,降低GSH水平(均P<0.05);下调miR-214-3p可减弱敲低circZMIZ1对PC3细胞铁死亡的影响(均P<0.05)。裸鼠移植瘤结果显示,敲低circZMIZ1可抑制裸鼠体内肿瘤生长,并上调miR-214-3p、降低肿瘤组织Ki-67和GPX4表达(均P<0.05),该作用被miR-214-3p下调减弱。结论:敲低circZMIZ1可能通过miR-214-3p/GPX4轴诱导PCa细胞铁死亡。

血清miR-214、miR-143在急性髓性白血病中的表达水平及与疾病复发的关系

目的探讨急性髓性白血病(AML)患者血清微小RNA(miR)-214、miR-143的表达水平,并分析二者与AML治疗后复发的关系。方法选取2019年1月—2021年4月四川大学华西医院血液内科治疗的AML患者94例作为研究对象(AML组),根据AML患者治疗后1年内是否复发分为AML缓解亚组60例和AML复发亚组34例,另选择同期医院健康体检者50例作为健康对照组。采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-214、miR-143表达水平;Spearman等级相关分析AML患者血清miR-214、miR-143表达与治疗后复发的关系,多因素Logistic回归分析AML患者复发的影响因素,受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-214、miR-143水平预测AML患者治疗后复发的效能。结果AML组患者血清miR-214表达水平高于健康对照组,miR-143表达水平低于健康对照组(t/P=7.024/<0.001,7.191/<0.001);复发亚组AML患者血清miR-214表达水平高于缓解亚组,miR-143表达水平显著低于缓解亚组(t/P=2.940/0.004,6.596/<0.001);复发亚组AML患者WBC高于缓解亚组,Hb、PLT水平低于缓解亚组(t/P=3.788/<0.001,2.093/0.039,2.974/0.004);AML患者复发与血清miR-214表达呈正相关(r/P=0.584/<0.001),与血清miR-143表达呈负相关(r/P=-0.428/<0.001);多因素Logistic回归分析显示,WBC高、miR-214高为AML患者复发的危险因素[OR(95%CI)=1.647(1.062~2.555)、1.392(1.031~1.879)],Hb高、PLT高、miR-143高是其保护因素[OR(95%CI)=0.839(0.805~0.991)、0.714(0.514~0.992)、0.768(0.606~0.974)];ROC曲线分析显示,血清miR-214、miR-143及二者联合预测AML复发的曲线下面积为0.765、0.900、0.939,二者联合预测AML复发的效能优于单项指标预测(Z/P=3.318/0.002,2.342/0.019)。结论AML患者血清miR-214表达上调,miR-143表达下调,二者对预测AML患者复发具有较好的效能。

miR-214/SOX4调控前列腺癌细胞的迁移和侵袭

目的探究miR-214是否通过靶向SOX4影响前列腺癌(PC)迁移与侵袭,为PC治疗提供潜在的治疗靶标。方法利用肿瘤基因组图谱数据库分析SOX4在癌及癌旁组织中的表达。用RT-qPCR和Western blotting方法检测了SOX4在前列腺癌细胞和正常前列腺细胞中的表达水平。用miR-214 mimics转染PC-3和DU145细胞,使miR-214过表达,并观察其对细胞功能的影响。结果PC组织和前列腺癌细胞系(PC3、DU145、22Rv1)中SOX4的表达水平上调,miR-214的表达下调。过表达的miR-214显著抑制癌细胞侵袭及迁移。结论miR-214通过负性调节SOX4的表达而发挥抑癌作用。SOX4可能是PC治疗的潜在靶点。

骨髓间充质干细胞外泌体源性miR-214-3p调控IKBKB基因促进宫颈癌细胞焦亡

目的探究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMMSC)外泌体源性miR-214-3p调控B细胞κ轻肽基因增强子抑制因子激酶β(inhibitor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell kinase beta,IKBKB)对宫颈癌细胞的影响。方法采用生物信息学方法分析宫颈癌组织中异常表达的微RNA,最终选择miR-214-3p作为目的基因,并确定其下游靶基因IKBKB;检测宫颈癌患者的癌组织及癌旁组织中miR-214-3p、IKBKB的表达情况;提取并鉴定BMMSC外泌体,干预外泌体中miR-214-3p的表达水平,构建IKBKB过表达质粒,将改造后的外泌体及质粒分别转染至宫颈癌HeLa细胞,测定转染后不同组别宫颈癌细胞焦亡相关指标。结果生物信息学和实验检测均发现miR-214-3p在宫颈癌组织和细胞中低表达,而在BMMSC外泌体中高表达,且BMMSC源性外泌体可显著提高宫颈癌细胞中miR-214-3p的表达水平;IKBKB基因是miR-214-3p的下游靶点,在宫颈癌组织和细胞中高表达;高表达miR-214-3p可促进宫颈癌细胞焦亡,过表达IKBKB基因后宫颈癌细胞的焦亡水平显著降低。结论BMMSC分泌的外泌体通过携带miR-214-3p调控IKBKB促进宫颈癌细胞焦亡。

血管内皮细胞来源外泌体miR-214对H_(2)O_(2)诱导血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨血管内皮细胞来源外泌体miR-214对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的血管内皮细胞损伤的影响。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),并转染miR-214抑制物(in-miR-214)及其阴性对照(in-miR-NC),分离并鉴定外泌体,同时检测miR-214表达。再次培养HUVEC,分为正常对照组(Control组)、氧化损伤组(H_(2)O_(2)组)、空白外泌体+氧化损伤组(exo NC+H_(2)O_(2)组)、in-miR-NC外泌体+氧化损伤组(exo in-miR-NC+H_(2)O_(2)组)和in-miR-214外泌体+氧化损伤组(exo in-miR-214+H_(2)O_(2)组)。qRT-PCR检测细胞中miR-214表达水平;MTT和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡;划痕愈合实验检测细胞迁移;Western blot检测细胞增殖、凋亡、迁移相关蛋白水平。结果成功从HUVEC细胞中分离出外泌体,且转染in-miR-214可抑制外泌体中miR-214表达(P<0.05)。H_(2)O_(2)诱导后,HUVEC细胞增殖活力和划痕愈合率降低,凋亡率增高;同时,细胞中miR-214表达水平增高,Cyclin D1、PCNA、Bcl2、MMP2和MMP9蛋白水平降低,Bax蛋白水平增高(P<0.05)。添加HUVEC外泌体和外泌体来源的in-miR-214可部分削弱H_(2)O_(2)对HUVEC细胞的损伤,且后者的效果要明显优于前者(P<0.05)。结论HUVEC来源外泌体通过低表达miR-214保护HUVEC免受H_(2)O_(2)诱导的细胞损伤。

幽门螺杆菌感染的胃癌组织中miR-214和PTEN的表达及意义

目的研究miR-214和磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)在幽门螺杆菌(HP)感染的胃癌组织中的表达及意义。方法选取2016年6月—2019年6月在徐州市第一人民医院接受治疗的HP感染的胃癌患者66例为研究对象。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测胃癌组织和癌旁组织中miR-214水平。采用免疫组化法测定胃癌组织和癌旁组织中PTEN表达水平。分析miR-214和PTEN表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系。术后随访,探究miR-214和PTEN表达水平与患者预后的关系。结果与癌旁组织相比,胃癌组织miR-214表达水平较高(P<0.05),PTEN阳性表达率较低(P<0.05)。miR-214、PTEN与TNM分期、有无远处转移有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤直径无关(P>0.05)。miR-214与PTEN呈显著负相关(P<0.05)。miR-214高表达胃癌患者平均生存时间显著短于miR-214低表达胃癌患者(P<0.05),PTEN阴性胃癌患者平均生存时间显著短于PTEN阳性胃癌患者(P<0.05)。结论HP感染的胃癌组织中miR-214呈高表达,PTEN阳性表达率低,miR-214和PTEN表达与HP感染的胃癌患者预后情况密切相关。

LINC00963通过miR-214-5p/SEMA4C调控结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨基因间长链非编码RNA00963(LINC00963)对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及分子机制。方法:通过LncBase Predicted v.2预测LINC00963和miR-214-5p的调控关系并通过双荧光素酶实验进行验证,StarBase v3.0预测LINC00963和SEMA4C相关性。常规培养结直肠癌细胞系HCT116、SW480,将结直肠癌细胞分为si-nc组、si-LINC00963组、miR-nc组、miR-214-5p mimic组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测LINC00963、miR-214-5p和SEMA4C的表达水平,细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖,划痕和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。Western blot法检测细胞中SEMA4C蛋白表达水平。结果:通过LncBase Predicted v.2预测发现LINC00963和miR-214-5p存在结合位点,StarBase v3.0显示LINC00963和SEMA4C呈正相关,双荧光素酶报告实验显示LINC00963与miR-214-5p存在相互作用。在HCT116、SW480细胞转染24 h后,与si-nc组比较,si-LINC00963组结直肠癌细胞增殖活力、划痕愈合力和侵袭细胞的数量均减弱,细胞中miR-214-5p表达增高,SEMA4C的mRNA和蛋白表达水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);将miR-214-5p mimic同样转染至HCT116、SW480细胞24 h后,与miR-nc组比较,miR-214-5p mimic组miR-214-5p表达增高,SEMA4C的mRNA和蛋白表达水平显著下降,结直肠癌细胞增殖活力、划痕愈合力和侵袭细胞的数量均减弱,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:LINC00963在结直肠癌中呈现高表达,下调其表达可增加miR-214-5p的表达,降低SEMA4C的表达,从而抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。

复方七芍降压片通过miR-214治疗高血压大鼠左心室肥厚实验研究

目的:从miR-214角度探讨复方七芍降压片对高血压大鼠血压以及左心室肥厚的影响。方法:采用无创大鼠尾动脉血压测定系统实时监测大鼠血压变化;采用超声心动仪测定大鼠心脏结构;观察大鼠心脏大体形态及心指数、左心室质量指数;采用苏木精-伊红染色法(HE)染色检测大鼠心肌组织病理情况;采用放射免疫法及酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠心室肥厚血清学指标及心肌和血浆血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)表达变化;采用RT-PCR检测复方七芍降压片干预后肥大心肌细胞miR-214的变化情况。结果:血压结果显示复方七芍降压片能改善高血压大鼠血压;超声心动结果显示复方七芍降压片能改善高血压大鼠心脏功能;病理学结果显示复方七芍降压片能改善高血压大鼠心室肥厚情况;放射免疫法及ELISA结果显示复方七芍降压片能够降低大鼠血清型前胶原(PC Ⅲ)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸(HA)及心肌和血浆AngⅡ表达,RT-PCR结果显示复方七芍降压片抑制肥大心肌细胞miR-214表达,以上结果差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:复方七芍降压片可能通过抑制miR-214表达改善高血压大鼠的血压及心室肥厚水平。

miR-214-5p靶向FGFRL1对甲状腺癌细胞TPC-1增殖、侵袭和迁移影响

目的探讨微小RNA-214-5p(miR-214-5p)靶向成纤维细胞生长因子受体样1(FGFRL1)调控甲状腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法2019年1~5月收集来自榆林市第一医院的47例甲状腺癌患者的癌组织及其癌旁组织,体外培养甲状腺癌BCPAP、TPC-1、SW1736细胞和正常甲状腺HT-ori3细胞,采用qRT-PCR法检测miR-214-5p与FGFRL1的表达;免疫组化检测甲状腺癌组织中FGFRL1阳性率;miR-214-5p模拟物/抑制剂(mi R-214-5p mimics/anti-miR-214-5p)及阴性对照(mi R-con/anti-miR-con)、FGFRL1小干扰RNA(si-FGFRL1)及其阴性对照(si-con)、miR-214-5p mimics与pcDNA-con、miR-214-5p mimics与FGFRL1过表达载体(pcDNA-FGFRL1)转染至TPC-1细胞;采用甲基噻唑基四唑(MTT)与Transwell迁移及侵袭实验分别检测miR-214-5p、FGFRL1对TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因实验验证miR-214-5p与FGFRL1的关系。结果与癌旁组织比较,甲状腺癌组织中miR-214-5p的表达量降低,FGFRL1的表达量升高,FGFRL1阳性率升高,差异均有统计学意义(P<0.05);甲状腺癌细胞中miR-214-5p表达水平低于正常甲状腺细胞,而FGFRL1表达水平高于正常甲状腺细胞,差异均有统计学意义(P<0.05);转染miR-214-5p mimics后,TPC-1细胞存活率降低,迁移及侵袭细胞数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);转染anti-miR-214-5p后,TPC-1细胞存活率升高,迁移及侵袭细胞数增多,差异均有统计学意义(P<0.05);敲减FGFRL1可明显抑制TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭,差异均有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证明miR-214-5可靶向结合FGFRL1;FGFRL1过表达可逆转上调miR-214-5p表达对TPC-1细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论miR-214-5p通过靶向FGFRL1而减弱甲状腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

葛根素通过调控miR-214抑制脊髓损伤后神经元炎症反应及凋亡的实验研究

目的探讨葛根素是否通过介导miR-214抑制过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导的脊髓神经元炎症反应及凋亡。方法体外培养大鼠脊髓神经元细胞,以H_(2)O_(2)刺激构建脊髓神经元损伤模型,实验分为:Con组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+Pue组、H_(2)O_(2)+Pue+anti-miR-NC组和H_(2)O_(2)+Pue+anti-miR-214组。实时荧光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测各组miR-214的表达,CCK-8法检测细胞活性,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,试剂盒检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,酶联免疫吸附测定法分析肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白印迹法(Western blot)检测裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved caspase-3)表达水平。结果与Con组相比,H_(2)O_(2)组细胞活性、SOD活性和miR-214的表达显著降低,细胞内ROS水平、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+Pue组细胞活性、SOD活性和miR-214的表达明显升高,细胞内ROS水平、TNF-α、IL-1β和IL-6的含量、凋亡率、Cleaved caspase-3的表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);抑制miR-214能够逆转葛根素对H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元细胞的损伤保护作用。结论葛根素能够通过上调miR-214的表达抑制H_(2)O_(2)诱导的脊髓神经元细胞凋亡和炎症反应,对脊髓神经元细胞损伤起保护作用。

微小RNA-214靶向调控PTEN对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制研究

目的:探讨微小RNA-214(miR-214)靶向调控第10号染色体丢失性磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)对成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化的影响及机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为miR-124 mimic组(转染miR-124 mimic)、miR-124 NC组(转染miR-124 NC)、pcDNA3.1-PTEN组(转染pcDNA3.1-PTEN)、miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组(转染miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN)。采用在线生信预测miR-124和PTEN靶向结合位点,通过双荧光素酶报告基因进行验证。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-124和PTEN mRNA表达。采用CCK-8法检测细胞增殖。采用碱性磷酸酶活性测定检测细胞分化能力。采用茜素红染色和骨钙素水平测定检测细胞的矿化。采用Werstern blot检测PTEN、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)水平。结果:与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组野生型PTEN的荧光素酶活性降低(均P<0.05)。与miR-124 NC组比较,miR-124 mimic组miR-124及p-PI3K、p-AKT蛋白表达升高,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平降低,而pcDNA3.1-PTEN组则相反(均P<0.05)。与miR-124 mimic组比较,miR-124 mimic+pcDNA3.1-PTEN组p-PI3K、p-AKT蛋白表达降低,PTEN mRNA和蛋白、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ和OPN蛋白、细胞矿化率和骨钙素水平升高(均P<0.05)。结论:miR-214通过靶向下调PTEN蛋白表达激活PI3K/AKT信号通路,从而调控成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化。

虎杖苷对ApoE^(-/-)小鼠肝脏miR-214表达水平及肝功能的影响

目的研究虎杖苷(PD)对Apo E-/-小鼠肝脏mi R-214及肝功能的影响。方法采用高脂饲料喂养雄性Apo E-/-小鼠,建立小鼠AS模型。将Apo E-/-小鼠随机分为4组(n=10),即模型组(Model)、辛伐他汀组(Simvastatin)、PD低剂量组(PDL)、PD高剂量组(PDH),另设10只同龄C57BL/6J小鼠为正常对照组。连续给药12周后取血,检测小鼠血糖、血脂、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、肝脏T-SOD及MDA等指标,HE染色观察肝组织病理切片,实时荧光定量PCR检测mi R-214水平。结果模型组小鼠血糖和血清中TC、TG、LDL-C、ALT和AST,以及肝脏中MDA较正常对照组显著增高(P<0.01),血清中HDL-C和肝脏中TSOD、mi R-214则显著降低(P<0.01),肝切片可见细胞内充满大小不一脂滴,大部分肝细胞呈现脂肪变性;与模型组相比,PD高剂量组能显著降低小鼠空腹血糖、血清TC、TG、LDL-C、AST、ALT以及肝脏中的MDA(P<0.05),并且能够显著升高血清HDLC和肝脏mi R-214及T-SOD(P<0.05);PD高、低剂量组小鼠肝细胞脂肪变性与模型组相比均有所减轻。结论 PD能降低AS小鼠血糖、血脂,并保护肝功能,其机制可能主要与PD升高肝脏mi R-214水平,调节T-SOD与MDA等氧化应激指标有关。