弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中miR-193a-3p、miR-146b-5p的表达量及临床意义探究

目的:探讨分析弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)组织中miR-193a-3p、miR-146b-5p的表达量及临床意义。方法:选取DLBCL患者76例(纳入DLBCL组)及淋巴结反应性增生(RHL)患者70例(纳入RHL组),采用实时荧光定量PCR法检测所有患者淋巴组织中miR-193a-3p、miR-146b-5p的表达水平,并分析二者的表达水平与DLBCL临床特征的关系。结果:miR-193a-3p及miR-146b-5p在DLBCL组中的表达水平均低于RHL组(P<0.05),二者的表达水平与Ann-Arbo分期、国际预后指数(IPI)评分有关。miR-193a-3p、miR-146b-5p的表达水平与DLBCL的临床分期呈负相关,随着miR-193a-3p、miR-146b-5p表达水平的降低,DLBCL临床分期越高(P<0.05)。淋巴组织中miR-193a-3p、miR-146b-5p表达下调是DLBCL临床高分期的危险因子(OR>1,P<0.05)。结论:DLBCL组织中miR-193a-3p、miR-146b-5p表达水平下调,可能参与了DLBCL的发生、发展,二者的表达水平与DLBCL的临床分期有关,可作为DLBCL临床诊治的重要参考依据。

lncRNA CYTOR/miR-193b-3p/HMGB1轴调控T细胞急性淋巴细胞白血病细胞MOLT-4增殖与凋亡的作用研究

目的 探讨lncRNA CYTOR对T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞增殖和凋亡的影响及可能机制。方法 体外培养人正常骨髓基质细胞系HS-5和T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1),采用逆转录-实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测细胞中lncRNA CYTOR、miR-193b-3p和HMGB1 mRNA表达;采用蛋白质印迹(Western blot)法检测细胞中HMGB1蛋白表达。分别转染si-CYTOR、miR-193b-3p mimics、si-HMGB1及共转染si-CYTOR与anti-miR-193b-3p至MOLT-4细胞,以CCK-8法检测细胞增殖,以流式细胞术检测细胞凋亡,以Western blot法检测细胞Bax和Bcl-2、cleaved-caspase3蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA CYTOR与miR-193b-3p、miR-193b-3p与HMGB1的调控关系。结果 与HS-5细胞比较,T-ALL细胞系(CCRF-CEM、MOLT-4、CEM-C1)中lncRNA CYTOR、HMGB1 mRNA及其蛋白表达均升高,miR-193b-3p表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。下调lncRNA CYTOR、上调miR-193b-3p或下调HMGB1后,MOLT-4细胞增殖受到抑制,Bcl-2蛋白表达降低,凋亡率和细胞中Bax、cleaved-caspase3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。lncRNA CYTOR竞争性吸附miR-193b-3p,HMGB1是miR-193b-3p的靶基因。上调HMGB1表达可逆转lncRNA CYTOR对T-ALL细胞MOLT-4增殖和凋亡的作用。敲低miR-193b-3p可逆转lncRNA CYTOR对MOLT-4细胞增殖和凋亡的作用。结论 lncRNA CYTOR在T-ALL细胞系中表达上调,其可能通过竞争性吸附miR-193b-3p进而上调HMGB1的表达来促进T-ALL细胞增殖,并阻碍细胞凋亡,其有可能成为T-ALL治疗的分子靶点。

血清miR-193b-3p与动脉瘤性蛛网膜下腔出血病人不良预后的关系

目的探讨血清微小核糖核酸(miR)-193b-3p与动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)病人不良预后的关系。方法2019年1月1日至2021年12月1日前瞻性收集aSAH共159例,采用RT-PCR检测入院24 h内血清miR-193b-3p水平。发病90 d,采用GOS评分评估预后,其中4~5分为预后良好,1~3分为预后不良。结果159例中,预后良好153例,预后不良56例(35.2%),其中死亡39例。ROC曲线分析显示,入院24 h内血清miR-193b-3p水平预测aSAH不良预后的曲线下面积为0.912(95%CI 0.870~0.954),最佳截断值为0.62,灵敏度和特异度分别为75.7%和94.6%。入院24 h内血清miR-193b-3p水平与入院时Hunt-Hess分级呈明显负相关(r=-0.384,P<0.001),与入院时Fisher分级呈明显负相关(r=-0.200,P=0.011),与入院时GCS评分呈明显正相关(r=0.409,P<0.001)。多因素logistic回归分析显示,入院24 h内血清miR-193b-3p≥0.62是aSAH病人预后不良的独立危险因素(OR=3.148;95%CI 1.017~5.167;P<0.001)。结论本文结果提示入院24 h内血清miR-193b-3p作为非侵入性生物标志物,不仅可以用于评估aSAH病人的病情严重程度,还可以在早期用于预测病人的预后。

CircNRIP1调节miR-193b-3p/STMN1轴对胃癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探究CircNRIP1调节miR-193b-3p/STMN1轴对胃癌细胞AGS顺铂(DDP)耐药的影响。方法:培养AGS与AGS/DDP细胞,比较两种细胞增殖抑制率以及CircNRIP1、mi R-193b-3p、STMN1表达情况;将AGS/DDP细胞分为AGS/DDP组、sh NC组、sh CircNRIP1组、sh CircNRIP1+inhibitor NC组、sh CircNRIP1+mi R-193b-3p inhibitor组,测定各组AGS/DDP细胞增殖抑制率、凋亡率、侵袭能力以及STMN1蛋白水平;测定mi R-193b-3p与CircNRIP1、STMN1靶向关系。结果:与AGS细胞比较,AGS/DDP细胞CircNRIP1、STMN1 m RNA与蛋白水平升高,细胞增殖抑制率、miR-193b-3p降低(P<0.05);与AGS/DDP组相比,sh CircNRIP1组细胞增殖抑制率、凋亡率、mi R-193b-3p升高,侵袭细胞数、CircNRIP1、STMN1 m RNA与蛋白减少(P<0.05);与sh CircNRIP1组相比,sh CircNRIP1+miR-193b-3p inhibitor组细胞增殖抑制率、凋亡率、miR-193b-3p降低,侵袭细胞数、CircNRIP1、STMN1 m RNA与蛋白升高(P<0.05);miR-193b-3p与CircNRIP1、STMN1均存在靶向关系。结论:沉默AGS/DDP细胞中CircNRIP1表达,可靶向mi R-193b-3p/STMN1抑制AGS/DDP细胞增殖、侵袭,促进AGS/DDP细胞凋亡,实现AGS/DDP细胞对DDP耐药的逆转。

长链非编码RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p调控信号通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)通过调控微小RNA-1-3p(miR-1-3p)的表达对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养正常胰腺细胞系hTERT-HPNE与胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3,将胰腺癌PaTu8988细胞按照随机数字表法分为si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG siRNA)、si-con组(转染siRNA Control)、miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、miR-con组(转染miR-1-3p阴性对照)、si-MIR4435-2HG+an⁃ti-miR-1-3p组(共转染MIR4435-2HG siRNA与miR-1-3p抑制剂)、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con组(共转染MIR4435-2HG siR⁃NA与miR-1-3p抑制剂的阴性对照),同时将未经任何处理的细胞作为NC组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测细胞中MIR4435-2HG与miR-1-3p的表达;双荧光素酶报告基因检测MIR4435-2HG与miR-1-3p的相互作用。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析敲低MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白的表达。结果MIR4435-2HG在胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常胰腺细胞;MIR4435-2HG可特异性结合miR-1-3p并调控其表达活性;敲低MIR4435-2HG与上调miR-1-3p表达后,可抑制胰腺癌PaTu8988细胞增殖,明显减弱细胞迁移及侵袭能力[其中NC组、miR-con组、si-MIR4435-2HG组增殖活性分别为48 h:(1.21±0.10)、(1.18±0.12)、(0.86±0.09),细胞迁移数量分别为(90.56±9.16)、(88.56±8.91)、(26.49±2.10),细胞侵袭数量分别为(160.79±16.12)、(155.09±15.49)、(69.23±7.10),均P<0.05],下调PaTu8988细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的表达;抑制miR-1-3p表达可促进胰腺癌PaTu8988细胞增殖、迁移及侵袭。结论敲低LncRNA MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-1-3p表达并抑制PI3K/Akt信号通路活化而降低细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达,进而减弱胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

抑制miRNA-291b-3p表达对H9C2细胞胰岛素信号通路活性的影响

目的本文探讨抑制miRNA-291b-3p表达在大鼠心肌细胞胰岛素抵抗中的作用,并分析其可能的作用机制。方法 1构建miR-291b-3p mimics和inhibitor腺病毒载体,感染H9C2细胞48h,分析miR-291b-3p水平、AKT/GSK信号通路活性和糖原水平的变化。2TNF-α刺激心肌细胞24h后,再用miR-291b-3p inhibitor腺病毒载体感染H9C2细胞24h,检测AKT/GSK信号通路活性和细胞糖原水平,验证TNF-α通过影响miR-291b-3p表达水平导致心肌细胞胰岛素抵抗。结果 1miR-291b-3p inhibitor腺病毒感染H9C2细胞48h,miR-291表达水平降低,AKT/GSK信号通路活性升高,心肌细胞糖原水平降低;2低表达miR-291b-3p能够逆转TNF-α引起的AKT/GSK通路活性和糖原水平降低。结论低表达miR-291b-3p可促进AKT/GSK信号通路活性,并改善TNF-α引起的胰岛素抵抗。

miR⁃27b⁃3p通过靶向SSRP1调控骨肉瘤细胞的生长

目的:探究miR⁃27b⁃3p对骨肉瘤(osteosarcoma,OS)细胞生长的影响及其潜在的分子机制。方法:①采用实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)分析miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤细胞系中的表达;②CCK⁃8实验、集落形成实验及流式细胞术检测miR⁃27b⁃3p以及SSRP1对骨肉瘤细胞生长的影响;③使用在线数据库预测miR⁃27b⁃3p的靶基因并进行筛选,使用双荧光素报告酶实验测定miR⁃27b⁃3p与结构特异性识别蛋白1(structure⁃specific recognition protein⁃1,SSRP1)的关系;④干扰效率以及过表达效率使用Western blot实验验证。结果:①miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤细胞和临床样本中低表达,过表达miR⁃27b⁃3p会抑制骨肉瘤细胞的生长;②生物信息学分析和双荧光素报告酶实验证实SSRP1为miR⁃27b⁃3p的靶基因,SSRP1表达受miR⁃27b⁃3p的直接调控;③干扰SSRP1的表达会抑制骨肉瘤细胞的增殖,促进凋亡;④过表达SSRP1会部分逆转miR⁃27b⁃3p对骨肉瘤细胞生长的抑制效应。结论:miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤细胞中低表达,通过靶向SSRP1从而影响骨肉瘤细胞的生长。miR⁃27b⁃3p可能是骨肉瘤的一个潜在的分子靶点,靶向miR⁃27b⁃3p/SSRP1轴可能成为骨肉瘤治疗的新策略。

LncRNA MIR4697HG通过靶向miR-193a-3p调控HMGA2表达促进胶质瘤的发生发展

目的研究长链非编码RNA(LncRNA)MIR4697HG是否通过靶向微小RNA-193a-3p(miR-193a-3p)并调控HMGA2表达影响胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。方法实时荧光定量-聚合酶链反应(qPCR)和Western印迹检测正常星形胶质细胞HA、胶质瘤细胞U-251MG中LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白表达。生物信息学预测和双荧光素酶活性检测分析MIR4697HG与miR-193a-3p、miR-193a-3p与HMGA2的靶向关系。在U-251MG细胞中转染si-MIR4697HG或miR-193a-3p,观察其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响。噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达。共转染si-MIR4697HG与anti-miR-193a-3p,或共转染si-MIR4697HG与pcDNA-HMGA2,观察其在U-251MG细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。结果与HA细胞比较,胶质瘤细胞U-251MG中LncRNA MIR4697HG、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白表达量明显升高(P<0.05),而miR-193a-3p表达量明显降低(P<0.05)。LncRNA MIR4697HG靶向调控miR-193a-3p表达,miR-193a-3p靶向调控HMGA2表达。低表达LncRNA MIR4697HG明显降低U-251MG细胞中HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达量、细胞存活率、细胞迁移数量、细胞侵袭数量(P<0.05),提高miR-193a-3p表达量(P<0.05)。高表达miR-193a-3p明显减少HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达量、细胞存活率、细胞迁移数量和细胞侵袭数量(P<0.05)。敲减miR-193a-3p可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移、侵袭、HMGA2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的制作用。高表达HMGA2可部分逆转MIR4697HG低表达对U-251MG细胞增殖、迁移、侵袭、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的抑制作用。结论LncRNA MIR4697HG通过靶向miR-193a-3p调控HMGA2表达促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR⁃30b⁃5p通过下调MKRN3表达抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探讨miR⁃30b⁃5p在食管癌细胞中的表达及对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响机制。方法收集2016年1月至2020年12月就诊于安徽省第二人民医院手术治疗的70例食管癌患者的肿瘤和癌旁组织,检测miR⁃30b⁃5p的表达水平。qRT⁃PCR检测食管癌细胞株中miR⁃30b⁃5p的表达水平。将miR⁃30b⁃5p mimics转染至TE⁃13和ECA109细胞中,检测转染后各组细胞中miR⁃30b⁃5p及MKRN3表达水平。根据细胞增殖实验,Transwell及裸鼠成瘤实验检测食管癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。双荧光素酶实验验证miR⁃30b⁃5p的靶基因。蛋白印迹实验探索miR⁃30b⁃5p对食管癌影响的分子机制。结果miR⁃30b⁃5p在食管癌细胞和食管癌组织中相较于正常上皮细胞和癌旁组织表达显著下降(P<0.05)。细胞增殖实验显示,miR⁃30b⁃5p mimics组增殖率显著低于NC组(P<0.05);Transwell实验结果显示,miR⁃30b⁃5p mimics组迁移率及侵袭率显著低于NC组(P<0.05);双荧光素酶实验显示MKRN3是miR⁃30b⁃5p的直接靶基因。Western blot检测JAK/STAT信号通路蛋白发现,miR⁃30b⁃5p mimics组蛋白低于NC组(P<0.05)。结论miR⁃30b⁃5p在食管癌中呈现低表达,miR⁃30b⁃5p通过下调MKRN3表达抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

miR-214-3p对缺糖缺氧再灌注诱导PC12细胞凋亡的作用及机制

目的探讨miR-214-3 p对缺糖缺氧再灌注诱导PC12细胞凋亡的作用及机制。方法利用数据库TargetScan 7.2预测miR-214-3 p和B淋巴细胞瘤因子2样蛋白2(BCL2L2)之间的结合位点;选取人胚肾293T细胞共转染分为BCL2L2 mRNA 3′UTR野生型荧光素酶报告载体+miR-214-3 p mimic(wt+mimic)组、BCL2L2 mRNA 3′UTR野生型荧光素酶报告载体+mimic negative control(wt+NC)组、BCL2L2 mRNA 3′UTR突变型荧光素酶报告载体+miR-214-3 p mimic(mut+mimic)组及BCL2L2 mRNA 3′UTR突变型荧光素酶报告载体+mimic NC(mut+NC组),检测4组293T细胞荧光素酶的发光活性;肾上腺嗜铬神经细胞瘤12(PC12)细胞转染miR-214-3 p mimic(mimic组)、miR-214-3 p mimic NC(mimic NC组)、miR-214-3 p inhibitor(inhibitor组),miR-214-3 p inhibitor NC(inhibitor NC组),采用蛋白免疫印迹法检测BCL2L2蛋白表达;PC12细胞作为对照(Control组),用缺氧缺糖(OGD/R)处理PC12细胞构建缺血再灌注细胞模型(OGD/R组),用miR-214-3 p mimic转染PC12细胞,然后用OGD/R处理PC12细胞(OGD/R+mimic组),采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测Control组和OGD/R组miR-214-3 p及BCL2L2 mRNA表达,采用蛋白免疫印迹法检测Control组、OGD/R组及OGD/R+mimic组裂解胱天蛋白水解酶3(Cleaved-caspase3)、B淋巴细胞瘤-2相关X(Bax)及B淋巴细胞瘤因子2(Bcl2)的蛋白表达。结果数据库Targetscan 7.2预测结果表明,miR-214-3 p与BCL2L2的3′UTR区之间存在结合位点;荧光素酶报告基因实验结果表明,wt+mimic组荧光素酶活性低于wt+NC组,mut+mimic组和mut+NC中荧光素酶活性无明显差异;mimic NC组BCL2L2的蛋白表达高于mimic组,inhibitor NC组BCL2L2的蛋白表达低于inhibitor组(P<0.05);与Control组比较,OGD/R组PC12细胞中BCL2L2 mRNA和蛋白表达水平降低、miR-214-3 p mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);OGD/R组Cleaved-caspase-3和Bax表达分别高于Control组、低于OGD/R+mimic组,但Bcl2表达分别低于Control组、高于OGD/R+mimic组(P<0.05)。结论过表达miR-214-3 p可靶向结合并下调BCL2L2的表达,从而加速PC12细胞的凋亡。

长链非编码RNA ZFAS1通过miR-193b-3p影响胶质瘤顺铂敏感性研究

目的 研究长链非编码RNA锌指结构反义转录本1(ZFAS1)在胶质瘤细胞中对顺铂敏感性的作用及其潜在机制。方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验分析敲低ZFAS1对胶质瘤细胞顺铂敏感性,分为sh-NC组(转染sh-NC慢病毒质粒)、sh#1组(转染sh-ZFAS1-1慢病毒质粒)、sh#2组(转染sh-ZFAS1-2慢病毒质粒)。双荧光素酶实验验证ZFAS1与miR-193b-3p之间的相互作用,分为ZFAS1-WT+NC inhibitor组(转染ZFAS1野生型质粒和NC inhibitor)、ZFAS1-WT+miR-193b-3p inhibitor组(转染ZFAS1野生型质粒和miR-193b-3p inhibitor)、ZFAS1-Mut+NC inhibitor组(转染ZFAS1突变型质粒和NC inhibitor)、ZFAS1-Mut+miR-193b-3p inhibitor组(转染ZFAS1突变型质粒和miR-193b-3p inhibitor)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)和原位末端标记(TUNEL)实验分析ZFAS1/miR-193b-3p影响胶质瘤细胞对顺铂敏感性,分为空白对照组(0μg·mL^(-1)顺铂处理U251细胞)、0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh-NC+NC inhibitor组(0.5μg·mL^(-1)顺铂处理共转染sh-NC慢病毒质粒和NC inhibitor的U251细胞)、0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+NC inhibitor组(0.5μg·mL^(-1)顺铂处理共转染sh-NC慢病毒质粒和NC inhibitor的U251细胞)和0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+miR-193b-3p inhibitor组(0.5μg·mL^(-1)顺铂处理共转染sh-ZFAS1-1慢病毒质粒和miR-193b-3p inhibitor的U251细胞)。结果 sh-NC组、sh#1组和sh#2组的ZFAS1的表达水平分别为1.00±0.17、0.48±0.06和0.68±0.08。ZFAS1-WT+NC inhibitor组、ZFAS1-WT+miR-193b-3p inhibitor组、ZFAS1-Mut+NC inhibitor组、ZFAS1-Mut+miR-193b-3p inhibitor组的荧光活性分别为1.00±0.10、1.45±0.11、1.02±0.09和0.97±0.13。空白对照组、0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh-NC+NC inhibitor组、0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+NC inhibitor组、0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+miR-193b-3p inhibitor组的72 h增殖率分别为(100.00±14.13)%、(96.62±9.82)%、(60.56±6.08)%和(78.64±7.22)%;72 h凋亡率分别为(9.52±1.11)%、(10.12±1.34)%、(16.08±1.52)%和(12.22±1.19)%。空白对照组与0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh-NC+NC inhibitor组比较,0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+NC inhibitor组与0.5μg·mL^(-1)顺铂+sh#1+miR-193b-3p inhibitor组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 本研究揭示了ZFAS1在胶质瘤中对顺铂敏感性的重要作用,并阐明了其通过调控miR-193b-3p影响药物敏感性的机制。

星形胶质细胞源性外泌体miR-193b-3p靶向TRPM2改善脑微血管内皮细胞氧糖剥夺/再氧合损伤的机制研究

目的通过构建体外氧糖剥夺/再氧合(OGD/R)模型,探讨脑缺血再灌注过程中星形胶质细胞(AS)源性外泌体对脑微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法(1)通过双荧光素酶报告基因检测确定miR-193b-3p对抑制瞬时受体电位M2型通道(TRPM2)的调控作用。采用miR-193b-3p模拟物/阴性序列转染bEnd.3细胞后进行OGD/R造模(分别为OGD/R+miR-193b-3p模拟物组及OGD/R+miR-193b-3p阴性序列组),通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞miR-193b-3p表达、Western blotting实验检测TRPM2、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达,采用流式细胞术检测细胞凋亡率。(2)从C57BL/6乳鼠大脑皮层提取AS并鉴定。通过CCK-8法确定AS造模时间并通过超高速离心法提取AS培养基中的外泌体,采用电镜、粒径和标志蛋白进行鉴定,采用RT-qPCR法检测AS及其外泌体中miR-193b-3p含量。随后采用miR-193b-3p抑制序列转染AS后提取低表达miR-193b-3p的外泌体,与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育(OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组);采用miR-193b-3p阴性序列转染AS后提取外泌体,与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育(OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组);正常外泌体与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育为OGD/R+AS外泌体组。通过RT-qPCR法检测各组细胞miR-193b-3p表达,通过Western blotting实验检测TRPM2、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达,采用流式细胞术检测凋亡率,采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果(1)双荧光素酶报告基因检测显示miR-193b-3p可结合TRPM2 mRNA,且转染miR-193b-3p模拟物后TRPM2蛋白表达明显减少,与OGD/R组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与OGD/R组相比,OGD/R+miR-193b-3p模拟物组细胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达明显降低,Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。提示miR-193b-3p可改善OGD/R过程中由TRPM2介导的bEnd.3细胞凋亡和紧密连接减少。流式细胞术进一步验证了上述结论,表现为与OGD/R组(21.34%)比较,OGD/R+miR-193b-3p模拟物组细胞凋亡率(13.93%)明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)研究中提取的外泌体呈脂质双层杯状、粒径主要在126.5 nm左右,外泌体标志蛋白Cal为阴性、CD81和SG101为阳性,提示外泌体提取成功。造模后,AS及其外泌体中miR-193b-3p含量均降低,与Control组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步研究发现,与OGD/R组比较,OGD/R+AS外泌体组及OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组中miR-193b-3p表达明显升高,TRPM2、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达明显降低,ZO-1、Claudin-5和Bcl-2表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞上述蛋白表达无明显改变,组间差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞术凋亡检测结果与之一致,表现为与OGD/R组(18.22%)相比,OGD/R+AS外泌体组、OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组细胞组细胞凋亡率(14.09%、13.79%)明显降低,差异有统计均意义(P<0.05);而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞凋亡率(18.41%)无明显改变,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞划痕实验显示,与OGD/R组(13.55%)相比,OGD/R+AS外泌体组、OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组细胞迁移能力(43.01%、40.59%)明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05);而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞迁移能力无明显改变(16.26%),差异无统计学意义(P>0.05)。结论AS源性外泌体可通过miR-193b-3p远距离抑制脑微血管内皮细胞上的TRPM2蛋白表达,改善OGD/R造成的脑微血管内皮细胞损伤,进而改善OGD/R损伤。

甲状腺癌组织中C-kit、miR-193b-3p的表达及临床意义

目的:探究甲状腺癌组织中C-kit、miR-193b-3p的表达及临床意义。方法:收集2020年1-7月首都医科大学附属北京积水潭医院甲状腺癌患者术中切除的甲状腺癌组织、癌旁组织标本103例。采用免疫组织化学法(IHC)检测C-kit蛋白表达,采用qRT-PCR法检测miR-193b-3p的相对表达水平;采用Spearman分析C-kit与miR-193b-3p在癌组织中表达相关性;采用Kaplan-Meier法分析C-kit和miR-193b-3p表达与患者预后之间的关系;采用多因素Cox分析影响患者预后的因素。结果:与癌旁组织相比,甲状腺癌组织中的miR-193b-3p的相对表达量及C-kit阳性表达率显著降低(P<0.05);且TNM分期、淋巴结转移以及分化程度不同的甲状腺癌患者的miR-193b-3p、C-kit表达差异均具有统计学意义(P<0.05);在癌组织中C-kit和miR-193b-3p表达呈正相关(P<0.05);甲状腺癌组织中miR-193b-3p高表达患者3年生存率(90.57%)高于低表达患者(70.00%);C-kit阳性表达患者3年生存率(93.1%)高于阴性表达患者(75.68%);且C-kit、miR-193b-3p为影响甲状腺癌患者预后不良的保护因素(P<0.05)。结论:在甲状腺癌组织中,C-kit、miR-193b-3p表达降低,对甲状腺癌患者的预后具有敏感性,可作为诊断标志物应用。

动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者高压氧治疗后血清miR-193b-3p水平及其意义

目的探讨动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)患者高压氧治疗后血清miR-193b-3p水平的变化及其意义。方法选择2019年1月至2020年9月商丘市第一人民医院急诊科收治的176例aSAH患者作为研究对象,根据治疗90 d后患者的改良Rankin量表评分(mRS)将其分为预后良好组(n=128)和预后不良组(n=48)。采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-193b-3p相对表达水平;用Logistic回归分析aSAH患者预后的风险因素;用受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-193b-3p诊断aSAH患者预后的价值;用限制性立方样条拟合Logistic回归分析miR-193b-3p与aSAH患者预后的量效关系。结果预后良好组患者治疗前后血清miR-193b-3p的相对表达水平均高于同期预后不良组(P<0.05),治疗后2组患者血清miR-193b-3p的相对表达水平均明显降低(P<0.05)。治疗后miR-193b-3p诊断aSAH预后的ROC曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异度分别为0.818、68.75%和85.94%。Hunt-HessⅢ~Ⅳ级、脑血管痉挛、高格拉斯哥昏迷评分(GCS)和高C反应蛋白(CRP)水平是aSAH预后的独立危险因素(P<0.05),治疗后miR-193b-3p相对表达水平高是aSAH预后的独立保护因素(P<0.05)。治疗后miR-193b-3p与aSAH预后呈非线性关系(P<0.05)。结论aSAH患者高压氧治疗后血清miR-193b-3p相对表达水平明显降低,与aSAH预后不良有关。

miR-193a-3p对弥漫大B细胞淋巴瘤细胞恶性生物学行为的影响

目的观察miR-193a-3p对弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)细胞增殖、迁移和细胞周期的影响,探讨miR-193a-3p靶向调控髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,MCL-1)的机制。方法DLBCL患者80例,同期诊治反应性增生淋巴结患者46例,取活检淋巴结组织,采用实时荧光定量PCR法检测miR-193a-3p相对表达量,比较DLBCL患者与反应性增生淋巴结患者、不同临床病理特征DLBCL患者淋巴结组织miR-193a-3p相对表达量。取对数生长期人淋巴内皮细胞HLEC及DLBCL细胞系HBL1、OCI-LY8、OCI-LY10、SU-DHL-4细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-193a-3p相对表达量。选择低表达miR-193a-3p的HBL1细胞,随机分为对照组、转染组和MCL-1过表达组,对照组转染NC mimic,转染组转染miR-193a-3p mimic,MCL-1过表达组转染miR-193a-3p mimic及MCL-1过表达质粒。采用实时荧光定量PCR法检测转染48 h时对照组、转染组miR-193a-3p相对表达量及3组MCL-1 mRNA相对表达量,采用Western blot法检测3组转染48 h时MCL-1蛋白相对表达量,采用MTS法检测3组转染48 h后培养48 h时细胞增殖的吸光度(optical density,OD)值,采用流式细胞术检测3组转染48 h时细胞周期,采用Transwell小室试验检测3组转染48 h后培养12 h时细胞迁移。应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-193a-3p靶向调控MCL-1。结果DLBCL患者淋巴结组织miR-193a-3p相对表达量(0.87±0.54)低于反应性增生淋巴结患者(1.58±0.66)(P<0.05)。DLBCL患者淋巴结组织miR-193a-3p相对表达量在Ki-67阳性率>60%(0.76±0.43)、有结外侵犯(0.79±0.44)、Ann Arbor分期Ⅲ~Ⅳ期(0.78±0.48)、国际预后指数评分3~5分(0.60±0.46)者分别低于Ki-67阳性率≤60%、无结外侵犯、Ann Arbor分期Ⅰ~Ⅱ期、国际预后指数评分0~2分者(0.94±0.36、1.01±0.30、0.99±0.42、1.04±0.53)(P<0.05),不同年龄、性别DLBCL患者淋巴结组织miR-193a-3p相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。OCI-LY10、OCI-LY8、SU-DHL-1、HBL1细胞miR-193a-3p相对表达量(2.90±0.71、2.21±0.23、1.38±0.34、0.78±0.17)均低于HLEC细胞(6.13±0.29)(P<0.05),HBL1细胞低于OCI-LY10、OCI-LY8、SU-DHL-1细胞(P<0.05)。转染组miR-193a-3p相对表达量(1.01±0.06)高于对照组(0.47±0.08)(P<0.05)。转染组MCL-1 mRNA(0.54±0.04)及蛋白(0.23±0.03)相对表达量均低于MCL-1过表达组(0.72±0.06、0.40±0.05)和对照组(1.00±0.03、1.04±0.06)(P<0.05),MCL-1过表达组低于对照组(P<0.05)。转染组细胞增殖OD值(0.65±0.09)低于MCL-1过表达组(0.78±0.10)和对照组(1.07±0.08)(P<0.05),G2/M期细胞比率[(30.83±2.16)%]高于MCL-1过表达组[(27.43±2.64)%]和对照组[(22.82±2.53)%](P<0.05),细胞穿膜数目[(18.33±7.35)个]少于MCL-1过表达组[(38.67±6.84)个]和对照组[(64.33±8.62)个](P<0.05);MCL-1过表达组细胞增殖OD值低于对照组,G2/M期细胞比率高于对照组,细胞穿膜数目少于对照组(P<0.05)。TargetScan 7.2软件预测显示MCL-1的启动子区与miR-193a-3p具有结合位点,miR-193a-3p+MCL-1-wt组荧光素酶活性(0.36±0.08)低于NC+MCL-1-wt组(1.00±0.03)(P<0.05),miR-193a-3p+MCL-1-mut组荧光素酶活性(0.94±0.16)与NC+MCL-1-mut组(1.00±0.05)比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论miR-193a-3p表达降低与DLBCL恶性进展相关,miR-193a-3p负调控MCL-1抑制DLBCL细胞增殖、迁移,使细胞周期阻滞在G2/M期。

3种microRNAs在良性前列腺增生与前列腺癌组织中的表达及临床意义

目的研究microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子在良性前列腺增生(BPH)与前列腺癌(PCa)组织中的表达及临床意义。方法纳入50例BPH和50例PCa患者,取其病灶组织,采用反转录PCR法(RT-PCR)检测组织中microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子表达水平,并分析其与PCa临床特征的关系。结果 microRNA-4286在PCa组织中明显高于BPH,而microRNA-193a-3p和-27b表达则明显降低(P<0. 05)。microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子在PCa组织中表达与肿瘤临床分期和Gleason评分密切相关(P<0. 05)。结论 microRNA-4286、-193a-3p和-27b分子可作为诊断PCa的重要分子标志物。

miR-27b-3p通过靶向PLK2促进乳腺癌细胞的辐射抵抗

目的研究miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗的影响。方法通过检索基因表达(GEO)数据库,筛选分析miR-27b-3p在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达水平。利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同乳腺癌细胞系中的表达水平。通过细胞克隆形成、免疫荧光和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)检测技术评价miR-27b-3p对乳腺癌细胞辐射抵抗作用。采用荧光素酶报告基因技术确定miR-27b-3p的靶基因PLK2,并在乳腺癌细胞中进一步验证miR-27b-3p的辐射抵抗作用。结果与正常乳腺组织和细胞相比,miR-27b-3p在乳腺癌组织(t=2.99,P<0.01)和乳腺癌细胞中表达水平显著上调(t=21.21、32.88,P<0.05)。尤其在抗辐射细胞MCF-7R中升高更加明显(t=25.63,P<0.05)。过表达miR-27b-3p增强了MCF-7细胞的克隆形成能力(t=10.32,P<0.05),且随着辐照剂量的增加,miR-27b-3p对MCF-7增殖能力的保护效应逐渐凸显(t=8.77、8.26、8.03,P<0.05);干扰miR-27b-3p则抑制MCF-7R细胞克隆形成数(t=40.00,P<0.05),且随着辐照剂量的增加,进一步削弱了MCF-7R细胞的增殖能力(t=8.54、8.32、8.23,P<0.05)。报告基因实验结果表明,PLK2是miR-27b-3p的直接靶标。过表达PLK2抑制了miR-27b-3p介导的乳腺癌细胞辐射抵抗(MCF-7:t=9.66,P<0.05;MCF-7R:t=6.42,P<0.05)。结论miR-27b-3p可通过靶向PLK2提高乳腺癌细胞的辐射抗性。

亚慢性铝暴露致大鼠认知障碍ALKBH5/PTEN/AKT信号通路机制

目的探讨麦芽酚铝暴露对miR-193a-3p、去甲基化酶AlkB同源蛋白5(ALKBH5)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)和蛋白激酶B(AKT)的影响,以及miR-193a-3p是否通过调控ALKBH5/PTEN/AKT信号通路参与铝致认知障碍的机制。方法将无特定病原体级健康雄性SD大鼠随机分为对照组和低、中、高剂量组,每组8只。3个剂量组大鼠分别予浓度为10.00、20.00和40.00μmol/kg体质量的麦芽酚铝溶液腹腔注射染毒,对照组大鼠予等体积0.9%氯化钠溶液;每周连续染毒5 d,持续3个月。染毒结束后,以新物体识别实验检测大鼠学习记忆能力,以实时荧光定量聚合酶链反应法检测大鼠海马组织中miR-193a-3p和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的mRNA相对表达水平,以蛋白质印迹法检测大鼠海马组织中ALKBH5、PTEN和AKT2蛋白的表达。结果高剂量组大鼠辨别指数和偏好指数分别低于对照组和低剂量组(P值均<0.05)。高剂量组大鼠海马组织中miR-193a-3p和Bcl-2 mRNA相对表达水平分别低于对照组和低剂量组(P值均<0.05),Bax mRNA相对表达水平分别高于对照组和低剂量组(P值均<0.05),Caspase-3 mRNA相对表达水平分别高于其他3组(P值均<0.05)。高剂量组大鼠海马组织中ALKBH5蛋白相对表达水平低于对照组(P<0.05),PTEN蛋白相对表达水高于对照组和低剂量组(P值均<0.05),AKT2蛋白相对表达水平低于对照组和低剂量组(P值均<0.05)。结论亚慢性铝暴露可抑制大鼠海马组织中miR-193a-3p的表达,从而破坏ALKBH5/PTEN/AKT通路,影响正常的神经元稳态和细胞功能;此机制可能在铝诱导的认知障碍过程中发挥重要作用。