miR⁃148a⁃3p靶向DLL4基因影响婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡

目的探讨miR⁃148a⁃3p靶向Delta样配体4(DLL4)对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)、蛋白质印记(Western blot)检测miR⁃148a⁃3p、DLL4在血管瘤组织、正常皮肤组织中的表达。将血管瘤内皮细胞分为miR⁃NC、miR⁃148a⁃3p、si⁃NC、si⁃DLL4、miR⁃148a⁃3p+pcDNA、miR⁃148a⁃3p+pcDNA⁃DLL4组。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法、流式细胞术检测细胞活力和凋亡。双荧光素酶报告实验和Western blot确定miR⁃148a⁃3p和DLL4的调控关系。结果与正常皮肤组织比较,血管瘤组织中miR⁃148a⁃3p表达降低,DLL4表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达miR⁃148a⁃3p或抑制DLL4后,血管瘤内皮细胞活力降低,凋亡率增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与过表达miR⁃148a⁃3p比较,过表达DLL4可逆转miR⁃148a⁃3p对血管瘤内皮细胞增殖、凋亡的影响,差异有统计学意义(P<0.05)。miR⁃148a⁃3p靶向负调控DLL4表达。结论本研究表明miR⁃148a⁃3p通过靶向DLL4可抑制血管瘤内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,是婴幼儿血管瘤的潜在治疗靶点。

LncRNA SNHG14/miR⁃148a⁃3p/PODXL轴在瘢痕疙瘩形成过程中的分子机制

目的探讨LncRNA SNHG14/miR⁃148a⁃3p/PODXL轴在瘢痕疙瘩形成过程中的分子机制。方法qRT⁃PCR法与Western blot法分别检测正常皮肤组织、瘢痕疙瘩组织中SNHG14、miR⁃148a⁃3p、PODXL的表达量;Pearson法分析瘢痕疙瘩组织中SNHG14与miR⁃148a⁃3p的相关性,以及miR⁃148a⁃3p与PODXL的相关性;体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,si⁃NC、si⁃SNHG14分别转染入瘢痕疙瘩成纤维细胞;MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell小室实验分别检测细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭;双荧光素酶报告基因实验检测SNHG14与miR⁃148a⁃3p的靶向关系,以及miR⁃148a⁃3p与PODXL的靶向关系;Western blot法检测ProcollagenⅠ、α⁃SMA、Col1蛋白表达量。结果与正常皮肤组织比较,瘢痕疙瘩组织中SNHG14与PODXL的表达量升高(P<0.05),miR⁃148a⁃3p的表达量降低(P<0.05);SNHG14与miR⁃148a⁃3p呈负相关(r=-0.8031,P<0.001),miR⁃148a⁃3p与PODXL呈负相关(r=-0.8559,P<0.001),SNHG14与PODXL呈正相关(r=0.7241,P<0.001);转染si⁃SNHG14可明显降低PODXL的表达量,促进miR⁃148a⁃3p的表达,并可降低细胞活力、克隆形成、迁移及侵袭能力,ProcollagenⅠ、α⁃SMA、Col1蛋白水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);SNHG14可靶向调控miR⁃148a⁃3p,miR⁃148a⁃3p可靶向调控PODXL。结论干扰SNHG14表达可通过调控miR⁃148a⁃3p/PODXL轴而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭及胶原蛋白合成。

SLC9A3-AS1调控miR-148a-3p/ROCK1信号轴影响肾癌细胞生物学功能

目的检测lncRNA SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)组织与肾癌细胞中的表达水平,探讨其促进肾癌细胞恶性生物学行为的机制。方法应用GEPIA2在线软件(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析TCGA数据库中SLC9A3-AS1在ccRCC组织中的表达水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SLC9A3-AS1在不同肾癌细胞系、24例ccRCC组织与癌旁正常肾脏组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Transwell小室迁移实验检测敲低SLC9A3-AS1表达对肾癌细胞增殖与迁移的影响;应用蛋白质免疫印迹法检测增殖与迁移相关信号通路蛋白的表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证SLC9A3-AS1与miR-148a-3p/ROCK1轴的靶向调控关系。结果GEPIA2软件分析结果显示,相较正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在肾透明细胞癌组织中表达显著上调(P<0.01)。qRT-PCR结果显示,相较癌旁正常肾脏组织,SLC9A3-AS1在24例ccRCC组织中表达显著上调(P<0.01);相较永生化肾小管上皮细胞,SLC9A3-AS1在4种肾癌细胞系中表达均显著上调,以786-O细胞最为显著(P<0.01)。干扰SLC9A3-AS1表达,可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力,上调E-cadherin的蛋白表达水平,而下调N-cadherin、MMP2的蛋白表达水平(均P<0.05);过表达miR-148a-3p可显著抑制786-O细胞的增殖与迁移能力(P<0.01)。双荧光素酶报告基因检测结果表明,SLC9A3-AS1可特异性结合miR-148a-3p,后者进一步靶向结合ROCK1 mRNA的3′UTR区域;过表达miR-148a-3p可明显下调ROCK1 mRNA的表达水平,敲低miR-148a-3p表达则产生相反的效应;敲低SLC9A3-AS1表达可显著下调786-O细胞中ROCK1 mRNA与蛋白的表达水平(P<0.01);下调miR-148a-3p表达可部分逆转SLC9A3-AS1沉默对786-O细胞增殖与迁移的抑制作用(P<0.05)。结论SLC9A3-AS1在ccRCC中通过调控miR-148a-3p/ROCK1轴发挥促癌作用,有望成为ccRCC的一个新的分子标志物。

基于miR-148a-3p/SMAD2轴探讨当归多糖对高糖诱导RGC凋亡的影响

目的探究当归多糖(APS)对高糖诱导视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的影响,及其基于微小RNA-148a-3p/Smad家族成员2(miR-148a-3p/SMAD2)轴的作用机制。方法将分别转染miR-148a-3p模拟物(mimics)、miR-148a-3p抑制剂(inhibitor)及其对照品mimics-NC、miR-NC的RGC,分为对照组(CG)、模型组(MG)、APS低剂量(APS-L)组、APS高剂量(APS-H)组、APS-H+miR-148a-3p对照品组(APS+miR-NC)、APS-H+miR-148a-3p抑制剂组(miR-148a-3p inhibitor),分别以相应的高糖和APS处理,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-148a-3p和SMAD2 mRNA表达水平,检测细胞活力、凋亡情况和氧化应激指标水平,Western Blot法检测SMAD2蛋白表达水平,双荧光素酶实验检测miR-148a-3p和SMAD2的靶向关系。结果(1)miR-148a-3p/SMAD2表达:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组中miR-148a-3p表达水平均高于MG组(t_(APS-L)=6.564、t_(APS-H)=10.542、t_(APS-H+miR-NC)=9.945,均P=0.000),SMAD2 mRNA表达水平低于MG组(t_(APS-L)=4.147,P=0.004;t_(APS-H)=6.464、t_(APS-H+miR-NC)=6.586,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组miR-148a-3p表达水平低于APS-H+miRNC组(t=7.558,P=0.000),SMAD2 mRNA表达高于APS-H+miR-NC组(t=4.513,P=0.001),差异均有统计学意义。(2)细胞活力和凋亡率:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组细胞活力高于MG组(t_(APS-L)=8.105、t_(APS-H)=11.509、t_(APS-H+miR-NC)=11.996,均P=0.000),细胞凋亡率低于MG组(t_(APS-L)=8.729、t_(APS-H)=15.690、t_(APS-H+miR-NC)=14.709,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组细胞活力低于APS-H+miR-NC组(t=10.212,P=0.000),细胞凋亡率高于APS-H+miR-NC组(t=12.247,P=0.000),差异均有统计学意义。(3)氧化应激:APS-L组、APS-H组、APS-H+miR-NC组乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)均低于MG组(LDH:t_(APS-L)=11.257、t_(APS-H)=18.770、t_(APS-H+miR-NC)=18.364,均P=0.000;MDA:t_(APS-L)=11.121、t_(APS-H)=17.139、t_(APS-H+miR-NC)=17.768,均P=0.000),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)均高于MG组(SOD:t_(APS-L)=9.408、t_(APS-H)=14.833、t_(APS-H+miR-NC)=13.240,均P=0.000;GSH:t_(APS-L)=5.616、t_(APS-H)=12.080、t_(APS-H+miR-NC)=12.642,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组LDH和MDA均高于APS-H+miR-NC组(t_(LDH)=15.121、t_(MDA)=14.613,均P=0.000),SOD和GSH均低于APS-H+miR-NC组(tSOD=12.278、tGSH=8.912,均P=0.000),差异均有统计学意义。。(4)凋亡蛋白:APS-L组、APS-H组和APS-H+miR-NC组SMAD2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)表达低于MG组(SMAD2:t_(APS-L)=4.565、t_(APS-H)=8.042、t_(APS-H+miR-NC)=7.390,均P=0.000;Bax:t_(APS-L)=4.916、t_(APS-H)=8.763、t_(APS-H+miR-NC)=8.336,均P=0.000;Caspase-3:t_(APS-L)=4.214、t_(APS-H)=10.201、t_(APS-H+miR-NC)=9.536,均P=0.000),B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达高于MG组(t_(APS-L)=3.713,P=0.001;t_(APS-H)=10.108、t_(APS-H+miR-NC)=10.314,均P=0.000);APS-H+miR-148a-3p inhibitor组SMAD2、Bax、Caspase-3表达均高于APS-H+miR-NC组(t_(SMAD2)=5.651、t_(Bax)=6.840、t_(Caspase-3)=8.205,均P=0.000),Bcl-2表达低于APS-H+miR-NC组(t=9.283,P=0.000),差异均有统计学意义。(5)靶向关系:miR-148a-3p与SMAD2的3'非翻译区存在结合位点。miR-148a-3p mimics和野生型SMAD2共转染组荧光素酶活性低于mimics-NC和野生型SMAD2共转染组,差异有统计学意义(t=12.781,P=0.000)。结论当归多糖可能通过上调miR-148a-3p、下调SMAD2,改善高糖诱导的RGC凋亡和氧化应激损伤。

右美托咪定通过上调miR-148a-3p抑制焦亡改善老年大鼠术后认知功能障碍

目的 探索右美托咪定对老年大鼠术后认知功能障碍(POCD)的改善作用及其具体机制。方法 18月龄SPF雄性SD大鼠共98只,选取18只作为正常对照组,另80只使用七氟烷+肝叶切除手术建立POCD模型。模型建立成功后,随机分为模型组、模型+生理盐水组、模型+右美组、模型+右美+阿替美唑组,每组20只,探讨右美托咪定对各组老年大鼠POCD的作用。随后,从模型组和模型+右美组中各选取4只,给予miR-148a-3p模拟物或抑制剂,进一步研究右美托咪定改善POCD的机制。结果 七氟烷麻醉+肝叶切除手术导致了大鼠术后认知功能显著下降、神经炎症和焦亡发生增加、海马突触可塑性和miR-148a-3p表达降低(P<0.05);右美托咪定可改善术后认知功能以及上述病理变化(P<0.05);阿替美唑组可显著降低右美改善认知功能的效果(P<0.05);miR-148a-3p模拟物可模拟出右美托咪定对POCD的保护效果,并抑制焦亡,miR-148a-3p抑制剂则可降低右美托咪定的保护效果,并促进焦亡的发生(P<0.05);FMR1可能是miR-148a-3p的下游作用靶点。结论 右美托咪定在能够改善认知功能障碍的同时,还能够改善麻醉手术大鼠海马的突触可塑性、神经炎症,并可能通过上调miR-148a-3p表达抑制焦亡的发生,FMR1可能是miR-148a-3p的下游作用靶点。

miR-148a-3p对软骨细胞炎性和凋亡的影响及其机制

目的研究miR-148a-3p对软骨细胞炎症因子、细胞凋亡和软骨细胞表型的影响。方法2周龄大耳兔处死后提取原代软骨细胞。为了探究炎症对软骨细胞相关标志物及其胞内miR-148a-3p表达水平的影响,建立IL-1β-诱导的OA细胞模型,软骨细胞分为control组和IL-1β组。为了探究miR-148a-3p对软骨细胞相关标志物及细胞凋亡相关因子表达水平的影响,软骨细胞分为blank组、IL-1β组、IL-1β+NC组、IL-1β+mimics组、IL-1β+inhibitor组。qRT-PCR检测IL-1β、SOX9、COL-Ⅱ、ACAN、MMP-13 mRNA水平;采用免疫蛋白印迹法检测软骨相关标志物MMP-13、COL-Ⅱ、ACAN、SOX9以及细胞凋亡相关因子Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白的表达水平。采用ELISA法检测细胞上清中IL-6和IL-10的含量。结果①与control组比较,IL-1β组细胞MMP-13蛋白表达升高(P<0.05),COL-Ⅱ和ACAN蛋白表达降低(P<0.05);miR-148a-3p表达水平升高(P<0.0001);②与blank组比较,IL-1β组细胞上清液IL-6水平升高,IL-10水平降低(P<0.05);MMP-13 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),COL-Ⅱ和ACAN mRNA和蛋白表达降低(P<0.05)。与IL-1β组比较,IL-1β+mimics组细胞上清液IL-6水平、MMP-13 mRNA和蛋白、Bax、Caspase-3蛋白表达升高(P<0.05);上清液IL-10水平、SOX9、COL-Ⅱ、ACAN mRNA和蛋白,以及Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。IL-1β+inhibitor组和IL-1β组间上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论IL-1β诱导体外软骨细胞中miR-148a-3p表达上调,可导致软骨细胞炎症性改变、细胞凋亡、软骨细胞表型改变和细胞外基质(ECM)降解。

miR-148a-3p调控EGFR抑制涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭和转移

目的:研究miR-148a-3p对涎腺腺样囊性癌SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移的影响及相关分子机制。方法:将miR-148a-3p模拟物和抑制剂,靶向EGFR的siRNA以及相应对照转染SACC-LM细胞。生物信息学手段分析预测miR-148a-3p的潜在靶基因;qRT-PCR检测miR-148a-3p和EGFR的mRNA表达;Western blot实验检测EGFR的蛋白表达。CCK-8、划痕和Transwell分别用于检测SACC-LM细胞的增殖、迁移和侵袭能力;双荧光素酶报告基因检测miR-148a-3p与EGFR之间的直接靶向关系;SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。结果:过表达或抑制miR-148a-3p可以显著抑制或促进SACC-LM细胞的增殖、侵袭和转移(P<0.05);生物信息学分析和双荧光素酶实验显示miR-148a-3p可靶向调控EGFR的表达(P<0.001);下调EGFR可以显著抑制SACC-LM细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P<0.05),并可部分逆转miR-148a-3p抑制剂对这些能力的促进作用(P<0.05)。结论:涎腺腺样囊性癌细胞中miR-148a-3p的下调导致其靶基因EGFR的异常高表达,从而促进了涎腺腺样囊性癌细胞的增殖、侵袭和转移。

热性惊厥患儿血清miR-148a-3p HMGB125(OH)D水平与癫痫发作的相关性

目的探讨热性惊厥患儿血清微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、25-羟维生素D(25(OH)D)水平与癫痫发作的相关性。方法回顾性分析2018-01—2022-03南阳市中心医院收治的122例热性惊厥患儿,根据热性惊厥患儿预后结局是否发生癫痫,分为热性惊厥癫痫组36例和热性惊厥非癫痫组86例,同期选择55例未发生惊厥的呼吸道感染仅发热的患儿为对照组,比较3组患儿的血清miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D水平。收集3组患儿临床资料进行多因素Logistic回归分析,绘制ROC曲线分析miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D对热性惊厥患儿癫痫发作的预测价值。结果热性惊厥癫痫组的血清miR-148a-3p表达量、HMGB1水平高于热性惊厥非癫痫组、对照组[(2.26±0.57)vs(1.71±0.43)vs(1.50±0.38);(7.45±1.87)μg/L vs(6.70±1.58)μg/L vs(5.33±1.29)μg/L;均P<0.05],血清25(OH)D水平低于热性惊厥非癫痫组、对照组[(26.83±6.79)μg/L vs(34.24±8.56)μg/L vs(42.16±4.15)μg/L;P<0.05]。惊厥类型、惊厥持续时间、退热后脑电图结果、miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D与癫痫发作存在相关关系(P<0.05)。miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D预测热性惊厥患儿癫痫发作的灵敏度为83.33%、77.78%、72.22%,特异度为74.42%、68.60%、63.95%。结论血清miR-148a-3p、HMGB1、25(OH)D水平与热性惊厥患儿癫痫发作有一定相关性,可作为临床辅助诊断标志物。

miR-148b-3p调控瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖的机制研究

目的分析miR-148b-3p对瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞增殖的影响。方法通过Real-time PCR分析人瘢痕疙瘩来源成纤维细胞(HKF)和正常人成纤维细胞(NFs)中miR-148b-3p和SPARC的表达水平。通过Western blot检测细胞中富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARC)蛋白表达水平。利用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法和平板克隆形成分析miR-148b-3p和SPARC对HKF增殖的影响。使用在线分析软件预测miR-148b-3p的靶基因,随后构建荧光素酶报告基因质粒,通过荧光素酶报告基因法分析miR-148b-3p与靶基因的靶向结合位点。结果miR-148b-3p在HKF中低表达,SPARC在HKF中高表达。在HKF细胞中转染miR-148b-3p能够下调SPARC的表达,并抑制细胞增殖。在线分析软件预测miR-148b-3p能够靶向结合SPARC的3′-UTR;双荧光素酶报告基因的结果进一步证实miR-148b-3p能够靶向作用于SPARC的3′-UTR。在转染miR-148b-3p的HKF中再转染SPARC真核表达质粒,能够抵消miR-148b-3p的作用,恢复细胞增殖能力。结论miR-148b-3p通过靶向作用于SPARC的3′-UTR,抑制其表达,抑制HKF增殖。

乳腺癌患者血清微小RNA-135b、微小RNA-148a-3p、微小RNA-186-5p表达水平及其与新辅助化疗效果相关性研究

目的:探讨乳腺癌患者血清微小RNA-135b(miR-135b)、miR-148a-3p、miR-186-5p表达水平及其与新辅助化疗效果的相关性。方法:选取116例乳腺癌患者为病例组,均接受新辅助化疗,以21 d为1个周期,共化疗8个周期,根据化疗反应将患者分为耐药组(32例)和敏感组(84例),另选128例体检健康女性为对照组。比较病例组和对照组,耐药组和敏感组血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p表达水平。采用Pearson相关性分析血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p水平间的相关性。乳腺癌患者化疗效果的影响因素采用Logistic回归分析。血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p对乳腺癌患者化疗耐药的预测价值通过受试者工作特征(ROC)曲线分析。结果:与对照组比较,病例组miR-135b、miR-148a-3p水平升高,血清miR-186-5p水平降低(均P<0.05)。耐药组血清miR-135b、miR-148a-3p水平高于敏感组,血清miR-186-5p水平低于敏感组(均P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,血清miR-135b与miR-148a-3p呈正相关,与miR-186-5p呈负相关,血清miR-148a-3p与miR-186-5p呈负相关(均P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p是乳腺癌患者化疗效果的影响因素(均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-135b、miR-148a-3p、miR-186-5p联合预测化疗耐药的曲线下面积(AUC)高于三者单独预测AUC(均P<0.05)。结论:乳腺癌患者血清miR-135b、miR-148a-3p水平呈高表达,血清miR-186-5p水平呈低表达,三者水平变化与新辅助化疗效果有关,且三者联合检测对患者新辅助化疗耐药的预测价值更高。

微小RNA-148a-3p靶向核心1β13-半乳糖基转移酶1增强肺腺癌细胞的放疗敏感性的研究

目的探讨微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)在肺腺癌中的表达及临床意义,分析miR-148a-3p靶向蛋白核心1β13-半乳糖基转移酶1(C1GALT1)对肺腺癌细胞放疗敏感性的影响及机制。方法选取肺腺癌组织芯片中76例患者肿瘤组织及肺腺癌A549细胞株为研究对象。对组织芯片分别进行miR-148a-3p原位杂交(ISH)染色和C1GALT1免疫组织化学染色,分析76例肺腺癌患者肿瘤组织中miR-148a-3p的表达与临床病理、预后及C1GALT1表达的关系。采用细胞转染技术对A549细胞进行miR-148a-3p过表达质粒的转染;转染细胞接受2 Gy放疗后采用克隆形成实验检测细胞的放疗敏感性;采用蛋白质印迹法检测细胞C1GALT1蛋白表达水平;采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-148a-3p与C1GALT1的靶向调控关系;采用共转染技术分析miR-148a-3p调控A549细胞放疗敏感性的机制。结果76例肺腺癌组织中低表达miR-148a-3p与患者淋巴结转移显著相关(P=0.012);miR-148a-3p高表达者预后显著优于miR-148a-3p低表达者(P=0.005);肺腺癌组织中miR-148a-3p与C1GALT1的表达呈显著负相关(P=0.023)。多因素分析显示,miR-148a-3p低表达、T分期及淋巴结转移是预后的独立危险因素。克隆形成实验显示,过表达miR-148a-3p组克隆形成数显著低于对照组(P<0.001);Western Blot结果显示,miR-148a-3p过表达可以显著下调细胞中C1GALT1蛋白水平(P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验显示miR-148a-3p通过结合C1GALT1的3′UTR来调控C1GALT1的表达。功能拯救试验显示C1GALT1能够部分抵消miR-148a-3p的放疗增敏效应。结论肺腺癌中miR-148a-3p低表达与淋巴结转移、C1GALT1高表达及预后不良显著相关,miR-148a-3p通过负调控C1GALT1的表达增强肺腺癌细胞的放疗敏感性。

异甘草素通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移的机制研究

目的 肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)是全世界范围内高频率发生的恶性肿瘤。最近的研究表明,异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)在肿瘤增殖和转移中发挥抗肿瘤活性。因此,研究旨在探讨ISL在抗LUSC转移中的作用机制。方法 利用梯度浓度ISL处理LUSC细胞,探究ISL在LUSC细胞增殖、迁移和侵袭中的抗癌特性。随后,利用生物信息学手段探寻了长链非编码RNA(Long non-coding RNAs, lncRNA)MIR22HG/miR-24-3p/Fas配体基因(Fas ligand Gene,FASLG)之间可能的互作关系。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测LUSC细胞中lncRNA MIR22HG、miR-24-3p、FASLG的表达,细胞计数盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验分别检测细胞活力、增殖、迁移和侵袭。蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测上皮间充质转换(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移相关蛋白的表达。RNA免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RIP)实验和双萤光素酶实验验证lncRNA MIR22HG与miR-24-3p、miR-24-3p与FASLG的结合关系。结果 ISL可以显著抑制LUSC细胞增殖、迁移和侵袭。生信分析及临床样本分析发现lncRNA MIR22HG在LUSC中低表达,ISL可以促进lncRNA MIR22HG的表达,抑制LUSC细胞的恶性行为。此外,lncRNA MIR22HG可以海绵吸附miR-24-3p进而调节FASLG的表达。miR-24-3p在LUSC中上调表达,FASLG在LUSC中下调表达。过表达FASLG可以逆转miR-24-3p过表达对LUSC增殖、转移以及EMT进程的促进作用。结论 这些结果表明,ISL通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移,表明ISL有潜力作为治疗LUSC的新型药物。

lncRNA MIR4435-2HG靶向miR-376a-3p调控胆管癌细胞生物学行为的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)MIR4435-2HG(MIR4435-2HG)对胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其对微小RNA-376a-3p(miR-376a-3p)的调控作用。方法 qRT-PCR法检测人肝内胆管上皮细胞HIBEpic与人胆管癌细胞RBE中MIR4435-2HG、miR-376a-3p的表达。将si-NC、si-MIR4435-2HG、miR-NC、miR-376a-3p mimics、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-NC、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-376a-3p分别转染至RBE细胞,作为si-NC组、si-MIR4435-2HG组、miR-NC组、miR-376a-3p组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组;采用MTT法、Transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验验证MIR4435-2HG与miR-376a-3p的靶向关系。Western blot检测相关蛋白表达。结果 RBE细胞中MIR4435-2HG表达量升高(P<0.05),miR-376a-3p表达量降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-MIR4435-2HG组MIR4435-2HG表达、细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率升高(P<0.05)。MIR4435-2HG可靶向调控miR-376a-3p;与si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组比较,si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05),迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论 敲低MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-376a-3p进而抑制RBE细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导其凋亡。

Hsa-miR-148a-3p通过下调DUSP1基因促进乳腺癌细胞的恶性行为

目的通过生信分析结合体内外实验验证Hsa-miR-148a-3p调控双特异性磷酸酶1(DUSP1)对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法TCGA数据库下载数据并鉴定差异微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA);数据库筛选差异miRNA靶基因;String和Cytoscape构建蛋白质互作网络及筛选TOP10 hub基因;TCGA数据库验证TOP10hub基因的表达;Cytoscape构建miRNA-TOP10hub基因网络。定量逆转录PCR(RT-qPCR)实验检测Hsa-miR-148a-3p和DUSP1在人乳腺癌组织和细胞中的表达。采用Hsa-miR-148a-3p mimic、Hsa-miR-148a-3p inhibitor及对照NC转染MCF-7细胞。分为NC组,NC mimics组,HsamiR-148a-3p mimics组,NC inhibitor组,Hsa-miR-148a-3p inhibitor组;荧光素酶报告基因实验验证Hsa-miR-148a-3p和DUSP1的结合;CCK-8,划痕实验,Transwell和细胞凋亡实验验证Hsa-miR-148a-3p对乳腺癌细胞增殖,迁移,侵袭和凋亡的影响。建立裸鼠成瘤模型,测量小鼠肿瘤质量和体积;Kaplan-Meier生存曲线分析小鼠生存情况;免疫组化检测DUSP1的表达水平。结果获得乳腺癌差异miRNA 54个(8个下调,46个上调),差异mRNA799个(509个下调,290个上调);54个差异miRNA预测靶基因3716个,与差异mRNA取交集,得到150个交集基因;蛋白-蛋白互作网络图中的TOP10hub基因为MET,LPAR1,LAMC1,FOS,EGFR,PIK3R1,DUSP1,GNAI1,LAMA4,NR3C1,这些基因在乳腺癌组织中均显著下调;双荧光素酶报告基因实验证实Hsa-miR-148a-3p能与DUSP1结合;RT-qPCR结果表明,Hsa-miR-148a-3p在乳腺癌组织和细胞中显著上调(P<0.01),而DUSP1则显著下调(P<0.01)。细胞实验结果表明,Hsa-miR-148a-3p促进乳腺癌细胞增殖,迁移和侵袭,抑制细胞的凋亡(P<0.01)。动物实验结果表明,Hsa-miR-148a-3p促进小鼠体内肿瘤质量和体积的增长(P<0.01),缩短小鼠的存活时间(P<0.01),免疫组化结果显示,Hsa-miR-148a-3p抑制DUSP1的表达水平(P<0.01)。结论Hsa-miR-148a-3p通过抑制DUSP1的表达而作为癌基因发挥作用,这有助于开发针对乳腺癌的新型治疗靶点。

长链非编码RNAMIR22HG和微RNA-9-3p在骨关节炎病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MIR22HG和微RNA-9-3p(miR-9-3p)在骨关节炎(OA)病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性。方法 选取2020年10月至2021年10月在南充市中医医院确诊为OA的病人120例,作为OA组,60例体检健康人群作为对照组;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平;Pearson法分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的相关性以及二者与视觉模拟(VAS)评分、美国特种外科医院膝关节评分(HSS)以及西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(WOMAC)评分的相关性;绘制受试者操作特征(ROC)曲线分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p对OA的诊断价值。结果 OA组的血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著高于对照组(1.48±0.25比1.01±0.22),miR-9-3p的表达水平显著低于对照组(0.72±0.13比1.05±0.12)(P<0.05);相关性分析显示,lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平呈负相关关系(P<0.05);KLⅣ级血清lncRNA MIR22HG的表达水平、VAS评分、WOMAC评分显著高于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著高于KLⅡ级(P<0.05),KLⅣ级血清miR-9-3p的表达水平、HSS评分显著低于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著低于KLⅡ级(P<0.05);OA病人lncRNA MIR22HG的表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈正相关,与HSS评分呈负相关(P<0.05);miR-9-3p表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈负相关,与HSS评分呈正相关(P<0.05);二者联合诊断的AUC高于lncRNA MIR22HG、miR-9-3p单独诊断的AUC值(Z=2.22,P=0.012;Z=1.43,P=0.025)。结论OA病人血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著升高,miR-9-3p表达水平显著降低,二者与OA病情严重程度密切相关,且对OA具有一定的诊断价值。

LncRNA CRNDE调节miR⁃338⁃3p/KLF6轴对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨LncRNA结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)调节miR⁃338⁃3p/KLF6轴对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响。方法将人肺泡上皮细胞A549分为CK组、LPS组、LPS+si⁃NC组、LPS+si⁃CRNDE组、LPS+si⁃CRNDE+inhibitor NC组、LPS+si⁃CRNDE+miR⁃338⁃3p inhibitor组、LPS+si⁃CRNDE+oe⁃NC组、LPS+si⁃CRNDE+oe⁃KLF6组;qRT⁃PCR检测各组细胞CRNDE、miR⁃338⁃3p和KLF6表达水平;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA试剂盒检测TNF⁃α、IL⁃10和IL⁃1β水平;商品化试剂盒分析MDA、GSH⁃Px、SOD水平;Western blot检测细胞中KLF6、Cleaved⁃caspase⁃3、Bax、Bcl⁃2蛋白表达量。双荧光素酶报告基因实验验证miR⁃338⁃3p与RNDE和KLF6的关系。结果与CK组相比,LPS组和LPS+si⁃NC组A549细胞CRNDE和KLF6 mRNA表达、TNF⁃α、IL⁃1β水平、MDA含量、细胞凋亡率、caspase⁃3、Bax、KLF6蛋白表达显著升高,miR⁃338⁃3p表达、细胞活力、IL⁃10水平、SOD和GSH⁃Px活性、Bcl⁃2蛋白表达显著降低(P<0.05);与LPS+si⁃NC组相比,LPS+si⁃CRNDE组A549细胞CRNDE和KLF6 mRNA表达、TNF⁃α、IL⁃1β水平、MDA含量、细胞凋亡率、caspase⁃3、Bax、KLF6蛋白表达显著降低,miR⁃150⁃5p表达、细胞活力、IL⁃10水平、SOD和GSH⁃Px活性、Bcl⁃2蛋白表达显著升高(P<0.05);干扰miR⁃338⁃3p表达或过表达KLF6均可降低下调CRNDE表达改善LPS诱导A549细胞损伤的作用(P<0.05)。结论下调CRNDE可调控miR⁃338⁃3p/KLF6轴减轻LPS诱导的A549细胞损伤。

当归多糖通过调控miR-148a-3p抑制高糖诱导的视网膜神经节细胞氧化应激损伤及凋亡研究

目的观察当归多糖对高糖诱导的视网膜神经节细胞(RGC)氧化应激损伤及凋亡的影响,并探讨可能机制。方法取对数期RGC-5细胞,分为对照组(常规培养基培养)、高糖组(含葡萄糖30 mmol/L的培养基培养)及高糖+低、中、高剂量组(分别用含葡萄糖30 mmol/L与当归多糖100、200、400 mg/L的培养基培养)。另取对数期RGC-5细胞,将细胞分为高糖+mi R-NC组、高糖+mi R-148a-3p mimics组、高糖+mi R-148a-3p inhibitor组、高糖+当归多糖+mi R-148a-3p mimics组、高糖+当归多糖+mi R-148a-3p inhibitor组。ELISA法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平;Annexin V/PITC双染法检测细胞凋亡率;Western blot法检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表达量。结果与对照组比较,高糖组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量降低,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量升高(P<0.05);与高糖组比较,高糖+低剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+低剂量组比较,高糖+中剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+中剂量组比较,高糖+高剂量组SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05)。与高糖+mi R-NC组比较,高糖+mi R-148a-3p mimics组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05),高糖+mi R-148a-3p inhibitor组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量降低,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量升高(P<0.05);与高糖+mi R-148a-3p mimics组比较,高糖+当归多糖+mi R-148a-3p mimics组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05);与高糖+mi R-148a-3p inhibitor组比较,高糖+当归多糖+mi R-148a-3p inhibitor组mi R-148a-3p表达量及SOD活性、Bcl-2蛋白表达量升高,MDA水平、凋亡率、Bax蛋白表达量降低(P<0.05)。结论当归多糖可减轻高糖诱导的RGC氧化应激损伤,减少细胞凋亡,且表现为剂量依赖性,其作用机制可能与上调mi R-148a-3p表达有关。

miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖

目的:探究脂筏特征蛋白2(Flotillin2,FLOT2)对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响及相关机制。方法:通过ENCORI数据库和细胞功能学实验证实FLOT2在肝癌中的表达情况以及对肝癌细胞生物学行为的影响;TargetScan中检索可能调控FLOT2的miRNA,CancerMIRNome分析miR-148a-3p在肝癌中的表达和对肝癌患者预后的影响,qRT-PCR和Western Blot检测过表达miR-148a-3p后肝癌细胞中FLOT2的表达水平,双荧光素酶实验验证miR-148a-3p与FLOT2的靶向调控关系;将细胞分为pcDNA组、pcDNA-FLOT2组以及pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p mimics组,Transwell实验以及EdU实验检测三组细胞迁移、侵袭和增殖能力。结果:FLOT2在肝癌中高表达,高表达FLOT2的肝癌患者预后更差,过表达FLOT2增强肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力;miR-148a-3p在肝癌组织中低表达,与肝癌患者预后相关,和FLOT2呈负相关;过表达miR-148a-3p降低FLOT2的mRNA和蛋白水平,双荧光素酶实验表明miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因;过表达miR-148a-3p抑制FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖的能力。结论:miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖。

miR-148a-3p靶向SMURF2调节牙髓干细胞和口腔上皮细胞共培养体系成骨分化及牙釉质发育的作用机制

目的探讨miR-148a-3p在体外牙齿发生中成骨分化和牙釉质发育中的作用,揭示其分子机制。方法获取人牙髓干细胞和口腔上皮细胞。将人牙髓干细胞转染miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p抑制剂或阴性对照。通过在Matrigel基质凝胶上接种人牙髓干细胞并覆盖口腔上皮细胞,建立三维共培养系统。采用MTT实验评估miR-148a-3p对共培养细胞增殖和蛋白表达的影响,采用Western blotting实验检测成骨细胞分化(RUNX2)和牙釉质发育标志物(E-cadherin)蛋白表达水平,采用荧光素酶报告实验验证SMURF2(SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶2)与miR-148a-3p的相互作用。结果在人牙髓干细胞中使用抑制剂下调miR-148a-3p后,3D共培养中的细胞活力降低(P<0.05)。使用模拟物上调miR-148a-3p后,共培养中成骨标志物RUNX2和牙釉质发育标志物E-cadherin的表达增加(P<0.05)。TargetScan软件预测miR-148a-3p在SMURF2的3’-UTR中有结合位点。荧光素酶报告实验表明miR-148a-3p mimics抑制野生型载体的荧光素酶活性(P<0.05),同时Western blot结果显示miR-148a-3p mimics下调SMURF2的表达(P<0.05)。结论miR-148a-3p可能通过靶向SMURF2,调控RUNX2和E-cadherin的表达,参与了人牙髓干细胞成骨分化和上皮细胞牙釉质发育。为牙齿修复和治疗提供了潜在的治疗靶点。

紫花牡荆素通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路抑制肝癌MHCC97H细胞的迁移和侵袭

目的用紫花牡荆素(casticin,CAS)处理MHCC97H细胞,观察其迁移和侵袭能力的变化,并初步探讨CAS的分子作用机制。方法CCK-8试剂盒检测不同浓度CAS对MHCC97H细胞活力的影响;分组开展细胞迁移和侵袭实验,评估MHCC97H细胞的迁移和侵袭能力;逆转录荧光定量PCR(RT-qPCR)检测CAS处理后,MHCC97H细胞的miR-148a-3p和Wnt1 mRNA表达变化;迁移侵袭相关蛋白(MMP2、MMP9)和Wnt1蛋白表达量采用Western blot检测;Dual-Luciferase报告基因检测miR-148a-3p与Wnt13′-UTR的结合情况。结果CAS明显抑制MHCC97H细胞的生存活力,其对这种细胞的IC_(50)约为10.0μmol·L^(-1),亚细胞毒浓度的CAS(3.0μmol·L^(-1))可减弱这种细胞的迁移和侵袭能力;miR-148a-3p mimic或CAS均能抑制MHCC97H细胞迁移和侵袭能力,且两者联合处理后的抑制作用强于单独使用;过表达Wnt1能有效减弱CAS的抑制作用;CAS能明显上调MHCC97H细胞miR-148a-3p表达,同时Wnt1、MMP2和MMP9的表达呈现下降;Dual-Luciferase报告基因发现,miR-148a-3p可以直接靶向Wnt13′-UTR。结论CAS可通过miR-148a-3p/Wnt1信号通路减弱肝癌细胞的迁移和侵袭。