联合microRNA测序及体外实验探究miR-15b介导PINK1/Parkin线粒体自噬通道在心力衰竭过程中的作用机制

目的:探究miR-15b介导PINK1/Parkin线粒体自噬通道在心力衰竭过程中的作用机制,寻找防治心衰的新靶点。方法:通过高通量测序检测心衰患者与健康志愿者体内表达差异microRNA;体外实验培养HL-1心肌细胞,通过AngII诱导心肌细胞损伤模型,采用细胞转染技术过表达和抑制miR-15b水平,利用qRT-PCR检测miR-15b转染效能及在各组的表达水平;使用双荧光素酶报告基因实验验证miR-15b与PINK1靶标关系;运用WesternBlot检测自噬蛋白Beclin-1、LC3B及线粒体自噬通道蛋白PINK1、Parkin等表达水平;运用免疫荧光法检测心肌细胞PINK1、Parkin蛋白表达情况。结果:心衰患者和健康志愿者外周血中microRNA表达存在明显差异,其中心衰患者外周血清miR-15b水平上调明显[log2(Fold_change)>1;P<0.01],通过对miR-15b靶基因进行预测,发现PINK1是其靶标,并通过双荧光素酶报告基因实验进一步确定miR-15b与PINK1之间的靶向关系。细胞实验中,与空白组相比,模型组miR-15b的表达增多(P<0.05),自噬蛋白LC3B、Beclin-1水平下降(P<0.01),线粒体自噬通道蛋白PINK1、Parkin水平下降(P<0.01);与模型组相比,转染miR-15b mimics后上述趋势显著增强(P<0.05);转染miR-15b inhibitor后可逆转上述趋势(P<0.01)。结论:miR-15b可通过介导PINK1/Parkin线粒体自噬水平信号通道调控自噬水平,可能成为心力衰竭潜在的治疗靶点。

猪微小RNA⁃15b前体突变对其生物学加工过程及前体脂肪细胞分化的影响

基于在猪微小RNA⁃15b(miR⁃15b)前体(pre⁃miR⁃15b)基因位点第58位碱基上发现了1个C>T突变(+58C>T),本试验旨在探究此突变对微小RNA(miRNA)生物学加工过程以及对猪前体脂肪细胞分化的影响。试验通过构建野生型(pmR⁃miR⁃15bW)和突变型(pmR⁃miR⁃15bM)miR⁃15b过表达载体,分别转染猪原代前体脂肪细胞进行miR⁃15b的过表达试验,然后利用实时荧光定量PCR对比2组细胞pre⁃miR⁃15b和miR⁃15b成熟体的表达量,在体外细胞水平明确+58C>T对miR⁃15b生物学加工过程的影响;随后,诱导转染了不同基因型miR⁃15b过表达载体(pmR⁃miR⁃15bW和pmR⁃miR⁃15bM)的猪前体脂肪细胞成脂分化,利用实时荧光定量PCR对比2组细胞miR⁃15b靶基因叉头框蛋白O1(FOXO1)(可抑制脂肪细胞分化)以及成脂分化相关基因的相对表达量,同时结合油红O染色,明确此突变对猪前体脂肪细胞分化的影响。结果表明:2组细胞miR⁃15b初级转录本(pri⁃miR⁃15b)的表达量没有显著差异(P>0.05),而突变组pre⁃miR⁃15b、miR⁃15b和微小RNA⁃16(miR⁃16)表达量极显著低于野生组(P<0.01);突变组分化前FOXO1相对表达量极显著高于野生组(P<0.01),分化后成脂分化相关基因固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP⁃1c)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)相对表达量极显著低于野生组(P<0.01),脂肪细胞蛋白2(aP2)相对表达量低于野生组(P>0.05);油红O染色结果表明突变组细胞脂滴含量明显低于野生组。综上可知,+58C>T阻碍了pri⁃miR⁃15b到pre⁃miR⁃15b的生物学加工过程,导致miR⁃15b成熟体表达量下降,其靶基因FOXO1相对表达量增高,从而抑制猪前体脂肪细胞分化。

唾液miR-15b与口腔鳞状细胞癌cleaved caspase-3表达及临床意义

目的 分析口腔鳞状细胞癌(OSCC)患者唾液miR-15b和组织cleaved caspase-3表达及与预后的关系。方法 收集2016年5月至2020年6月期间我院收治的OSCC患者154例(OSCC组),另收集103例健康志愿者作为对照组。分别采用实时荧光定量PCR(qPCR)及免疫组化染色法检测唾液miR-15b水平及组织cleaved caspase-3表达。受试者工作特征(ROC)曲线分析唾液miR-15b表达诊断OSCC的效能。分析唾液miR-15b表达与口腔鳞癌临床病理特征的关系,采用多因素Cox回归分析影响OSCC预后的因素。结果 OSCC患者唾液miR-15b水平显著低于对照组(0.72±0.33 vs. 1.00±0.23,P<0.001)。ROC曲线分析唾液miR-15b水平诊断OSCC的曲线下面积为0.760(0.703~0.817)。与癌旁组织比较,OSCC组织中caspase-3、cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。经Spearman相关性分析,OSCC患者的唾液miR-15b水平与OSCC组织cleaved caspase-3蛋白表达呈负相关(r=-0.321,P<0.001)。唾液miR-15b表达与肿瘤直径和预后有关(P<0.05)。miR-15b低表达组患者5年DFS率和5年OS率分别为28.57%和44.16%,高表达组患者5年DFS率和5年OS率分别为62.34%和81.82%,差异有统计学意义(P<0.001)。多因素Cox风险比例回归模型结果显示TNM分期、根治性手术、唾液miR-15b水平均是影响OSCC患者OS的独立预后因素(P<0.05)。结论 OSCC患者唾液miR-15b水平与组织cleaved caspase-3相关,可作为预测OSCC患者预后的生物标志物。

血清mi R939-和mi R15b-表达与糖尿病视网膜病变患者微血管损伤的相关性分析

目的 分析血清miR-939和miR-15b表达与糖尿病视网膜病变(DR)患者微血管损伤的相关性。方法 选取2021年1月至2022年10月在保定市第二医院进行诊治的2型糖尿病患者176例作为研究对象。根据研究对象根据是否发生DR及病变程度分为无DR患者74例(NDR组)、非增殖型DR患者62例(NPDR组)、增殖型DR(PDR)患者40例(PDR组)。采用实时荧光定量PCR检测各组血清miR-939、miR-15b相对表达水平,酶联免疫吸附试验法检测各组血管内皮生长因子(VEGF)水平,流式细胞术检测内皮细胞(ECs)、内皮祖细胞(EPCs)和循环祖细胞(CPCs)计数百分比。比较3组患者血清miR-939、miR-15b、VEGF水平和ECs、EPCs、CPCs。采用Pearson相关性分析血清miR-939、miR-15b与VEGF、ECs、EPCs、CPCs的相关性。采用多因素Logistic回归分析2型糖尿病患者发生DR的影响因素。结果 PDR组、NPDR组血清miR-939、miR-15b相对表达水平低于NDR组,而血清VEGF水平高于NDR组,差异有统计学意义(P<0.05)。PDR组、NPDR组ECs高于NDR组,而EPCs和CPCs低于NDR组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-939与VEGF、ECs呈负相关(r=-0.407、-0.613,P<0.05),与EPCs、CPCs呈正相关(r=0.481、0.486,P<0.05),血清miR-15b与VEGF、ECs呈负相关(r=-0.539、-0.625,P<0.05),与EPCs、CPCs呈正相关(r=0.451、0.483,P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,2型糖尿病病程、糖化血红蛋白、餐后2 h血糖、VEGF、miR-939和miR-15b为2型糖尿病患者发生DR的影响因素(P<0.05)。结论 DR患者血清miR-939、miR-15b表达与VEGF、ECs、EPCs和CPCs密切相关,DR患者血清miR-939、miR-15b表达能够为其微血管损伤程度的早期判断与评估提供一定参考。

支气管肺发育不良早产儿血浆miR-15b、VEGF水平变化及临床意义

目的分析支气管肺发育不良早产儿血浆miR-15b、血管内皮生长因子(VEGF)水平变化及临床意义。方法收集2020年3月—2022年3月首都医科大学附属北京儿童医院新生儿内科收治的早产儿148例,根据是否存在支气管肺发育不良分为支气管肺发育不良组(不良组)65例和发育正常组(正常组)83例。实时荧光定量聚合酶链反应检测血浆miR-15b表达,酶联免疫吸附试验检测血浆VEGF水平,收集相关临床资料。Pearson相关系数描述血浆miR-15b与VEGF之间相关性,多因素Logistic回归分析影响早产儿支气管肺发育不良的因素。受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆miR-15b、VEGF辅助诊断早产儿支气管肺发育不良的价值。结果不良组血浆miR-15b表达高于正常组,VEGF水平低于正常组(t/P=12.754/<0.001、31.023/<0.001),血浆miR-15b表达与VEGF呈负相关(r/P=-0.617/<0.001)。胎龄大、氧分压高、VEGF高是早产儿支气管肺发育不良的保护因素,miR-15b高是危险因素[OR(95%CI)=0.899(0.845~0.958)、0.521(0.356~0.764)、0.600(0.442~0.814)、1.540(1.220~1.945)]。血浆miR-15b、VEGF及二者联合诊断早产儿支气管肺发育不良的曲线下面积分别为0.728、0.756、0.931,且二者联合高于单独诊断(Z/P=4.543/<0.001、4.207/<0.001)。结论支气管肺发育不良早产儿血浆miR-15b表达上调,VEGF水平降低,miR-15b可能负向调控VEGF参与支气管肺发育不良过程。

血清miR-15b、miR-29a和CysC在妊娠高血压疾病肾脏损害中的临床诊断价值

目的观察血清miR-15b、miR-29a和胱抑素C(CysC)在妊娠高血压疾病(HDCP)肾脏损害中的临床诊断价值。方法选择2017年1月-2018年12月在上海中医药大学附属第七人民医院妇产科诊治的HDCP患者108例作为HDCP组。根据病情的严重程度分为妊娠高血压组39例、子痫前期轻度组35例和子痫前期重度组34例。选择同期正常妊娠在医院行体检孕妇和健康体检女性分别作为正常妊娠组和健康对照组,每组各30例。采用qRTPCR法检测各组血清miR-15b和miR-29a表达,并分析miR-15b、miR-29a、CysC与HDCP严重程度、肾功能异常、肾功能损害严重程度的关系,分析其诊断肾功能损伤的敏感度和特异度。结果 HDCP组血清miR-15b、CysC和β2-MG表达水平明显高于正常妊娠组、健康对照组(P <0.01),而血清miR-29a表达水平明显低于正常妊娠组、健康对照组(P<0.01)。HDCP患者肾功能异常亚组血清miR-15b、CysC和β2-MG水平明显高于肾功能正常亚组(P<0.01),血清miR-29a水平明显低于肾功能正常亚组(P <0.01)。血清miR-15b、CysC和β2-MG水平随HDCP严重程度、肾功能分期升高而升高,而血清miR-29a水平随HDCP严重程度、肾功能分期升高而降低(P <0.01)。HDCP患者血清miR-15b、miR-29a和CysC表达水平诊断HDCP肾功能损害的效能明显高于β2-MG(P <0.05),而各指标之间差异无统计学意义(P>0.05),三者联合检测HDCP患者肾功能损害的AUC为0.993,敏感度为95.1%,特异度为100%,明显优于单项指标(P <0.01)。结论 miR-15b、miR-29a和CysC参与了妊娠高血压疾病肾脏损害的发生发展过程,联合miR-15b、miR-29a和CysC指标诊断HDCP肾损害具有较高的敏感度和特异度。

miR-15b-5p靶向HDGF抑制胃癌细胞增殖并促进凋亡

目的:研究miR-15b-5p和HDGF对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:采用qRT-PCR法检测胃癌细胞中miR-15b-5p的表达;通过软件预测miR-15b-5p的下游靶基因;将对数生长期AGS细胞随机分为miR-15b-5p组(转染miR-15b-5p模拟物)、miR-NC组(转染阴性对照)、Scramled组(转染阴性对照)、shHDGF组(转染质粒pcDNA3.1-shHDGF)、Vector+miR-15b-5p组(miR-15b-5p模拟物和pcDNA3.1载体共转染)、HDGF+miR-15b-5p组(miR-15b-5p模拟物和HDGF共转染),均以脂质体法转染;MTT法和流式细胞术检测各组细胞的增殖和凋亡变化;Western blot法和双荧光素酶报告基因实验分析miR-15b-5p对HDGF的靶向调控作用。结果:与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901和AGS中miR-15b-5p低表达,且过表达miR-15b-5p可抑制AGS细胞的增殖并促进凋亡。HDGF是miR-15b-5p的潜在靶标,miR-15b-5p能够抑制HDGF表达。而回补HDGF可逆转miR-15b-5p抑制胃癌细胞增殖与促进凋亡的作用。结论:miR-15b-5p可抑制胃癌细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与靶向抑制HDGF有关,提示miR-15b-5p可能成为胃癌诊断与治疗的潜在靶点。

口腔鳞状细胞癌组织中miR-15b的表达及意义

目的探讨microRNA-15b(miR-15b)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)组织及其对应癌旁组织中的表达及其临床诊断意义。方法收集46例经病理证实为OSCC组织及对应的癌旁组织,分别提取组织内的mRNA,采用qRT-PCR技术检测组织中miR-15b的表达;分析OSCC癌灶组织内miR-15b表达及与临床病理参数的相关性。结果 OSCC癌灶组织内miR-15b表达与对应癌旁组织相比明显下降(P=0.004 1);OSCC癌灶组织内miR-15b表达与患者WHO病理分级有关(P=0.042),而与患者性别、年龄、TNM分期、吸烟、淋巴结转移及癌灶组织内炎症细胞浸润均无相关性(P>0.05)。结论 miR-15b在OSCC癌灶组织内低表达,且与肿瘤分化相关;miR-15b有望成为OSCC早期诊断的潜在指标。

miR-15b在急性脑梗死患者血清中的表达及临床意义

目的探讨miR-15b在急性脑梗死患者血清中的表达及临床意义。方法选取2018年1~12月广西中医药大学第一附属医院(以下简称“我院”)收治的98例急性脑梗死患者为急性脑梗死组,同期选取我院98例健康体检者为对照组。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测两组血清miR-15b表达;受试者工作特征曲线(ROC)评价miR-15b诊断急性脑梗死的价值;分析血清miR-15b表达与急性脑梗死临床病理特征的关系。结果两组血清miR-15b分别为(1.28±0.38)、(2.33±0.72),急性脑梗死组血清miR-15b表达高于对照组(P<0.05)。miR-15b诊断急性脑梗死的ROC曲线下面积为0.817,95%CI=0.721~1.438,敏感度为91.06%,特异度为79.35%。不同性别、年龄患者血清miR-15b表达差异无统计学意义(P>0.05);不同梗死程度、梗死体积及预后患者血清miR-15b表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-15b在急性脑梗死患者血清中呈高表达,且与梗死程度、梗死体积及预后可能有关,是诊断急性脑梗死的潜在血清学标志物。

急性脑梗死患者血清中miR-15b表达变化及临床意义

目的:探讨急性脑梗死患者血清中miR-15b表达变化及临床意义。方法:选取2016年3月至2017年9月,在我院神经内科住院治疗的急性脑梗死患者165例,同期,从体检中心选取健康体检者50例作为对照组,根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将患者分为轻型组(n=72)、中型组(n=69)和重型组(n=24),根据全脑数字减影血管造影(DSA)检查将患者分为侧支循环未完全组(n=67)和侧支循环建立组(n=98),依据影像学检查结果分为小梗死组(n=57)、中梗死组(n=69)和大梗死组(n=39),实时荧光定量PCR术检测血清中miR-15b表达,酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血清中血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素2(Ang-2)浓度。结果:急性脑梗死患者血清中miR-15b相对表达量、VEGF和Ang-2浓度均高于对照组(P<0. 05);侧支循环建立组患者血清中miR-15b相对表达量低于侧支循环未完全组,而VEGF和Ang-2浓度高于侧支循环未完全组(P<0. 05);与轻型组比较,中型组和重型组患者血清中miR-15b相对表达量升高,而VEGF和Ang-2浓度降低,与中型组比较,重型组患者血清中miR-15b相对表达量升高,而VEGF和Ang-2浓度降低,差异均有统计学意义(P<0. 05);与小梗死组比较,中梗死组和大梗死组患者血清中miR-15b相对表达量升高,而VEGF和Ang-2浓度降低(P<0. 05),与中梗死组比较,大梗死组患者血清中miR-15b相对表达量升高,而VEGF和Ang-2浓度降低(P<0. 05)。结论:miR-15b在急性脑梗死患者血清中呈高表达,可能通过靶蛋白VEGF而参与侧支循环建立,且与患者病情严重程度及脑梗死体积呈正相关。

lncRNA XIST靶向miR-15b-5p调控细胞凋亡及自噬参与帕金森病发病机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)X染色体失活特异转录本(XIST)对帕金森病(PD)的潜在分子机制。方法用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导建立PD模型。用爬杆和转棒法检测小鼠行为变化。四甲基偶氮唑盐法和流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)活力和凋亡。双荧光素酶报告基因法、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot、免疫组化探讨lncRNA XIST在PD中的分子机制。结果PD体内外模型XIST表达上调,miR-15b-5p表达下调。沉默XIST(si-XIST)可缩短小鼠准备向下爬行的时间,延长停留时间。此外,si-XIST也可增加酪氨酸羟化酶阳性(TH+)神经元数。miR-15b-5p是XIST的靶基因。结论si-XIST可通过调控miR-15b-5p抑制PD的自噬和凋亡。

miR-15b在荣昌猪不同体组织中的表达差异及其在C_(2)C_(12)细胞中的动态表达分析

为探究miR-15b在荣昌猪不同体组织中的表达差异及其在C_(2)C_(12)细胞不同发育时期的动态表达变化,本研究采用RT-qPCR方法检测miR-15b在荣昌猪心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肌肉、胸腺和小肠组织及其在C_(2)C_(12)细胞增殖和分化过程中的表达水平。结果表明:miR-15b在荣昌猪各组织中均有表达,其中在心脏和胸腺中的表达量最高,在肝脏和肾脏中的表达量最低;miR-15b的表达量在C_(2)C_(12)细胞的整个增殖过程中均显著升高,在C_(2)C_(12)细胞的整个分化过程中先显著升高再显著降低。综上所述,miR-15b在荣昌猪各组织广泛表达,其表达量在C_(2)C_(12)细胞的增殖和早期分化中显著升高,推测miR-15b在C_(2)C_(12)细胞的增殖以及分化早期发挥重要功能。

miR-15b在内皮细胞的功能及其与血管相关性疾病的关系

微小RNA(MicroRNA,miRNA)是长度为22个核苷酸的小片段非编码RNA,作为RNA干扰的参与者之一,其通过在转录后水平调节各种基因的表达,进而对细胞的生命活动产生广泛影响。mi R-15b是mi R-15/16家族一员,是一类在机体各系统、特别是血管内皮系统广泛表达的微小RNA,主要影响细胞的增殖、凋亡、侵袭、成管等行为。文章主要对mi R-15b及相关家族成员在各类细胞、特别是血管内皮细胞的生物学行为、作用机制及mi R-15b在心血管相关疾病的发生、发展及预后等过程中的作用进行了详细阐述。同时,文章对mi R-15b相关家族成员在以胎盘内皮发育异常为病理基础的妊娠期高血压疾病如子痫前期的发病机制中的作用进行了探讨。

循环miR-338-5p、miR-15b-5p和miR-21-5p作为肝细胞癌的潜在肿瘤标记物

目的筛查血浆中能作为肝细胞癌肿瘤标记物的miRNA。方法分为4个阶段：1miRNA芯片筛查肝细胞癌组织中异常表达的miRNA,并根据文献和miRNA芯片结果确定候选miRNA。213对术前和术后7~10 d肝细胞癌患者血浆用定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction,qRT-PCR）检测候选miRNA的表达水平,术后表达水平下降的miRNA定为目的miRNA。339例肝细胞癌患者、32例肝硬化患者、25例健康人员血浆进行qRT-PCR,验证目的miRNA在3组人群中的表达差异。4分析目的 miRNA作为肝细胞癌肿瘤标记物的诊断价值,绘制受试者工作曲线并分析其与临床参数的相关性。结果癌组织中40种miRNA表达量增加（〉2倍）,52种miRNA表达量明显下降（〈0.5倍）。结合文献,选取miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-338-5p作为候选miRNA。术后3种miRNA表达水平下降,定为目的 miRNA。3组人群测量结果显示miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-338-5p在肝细胞癌患者血浆中表达水平明显高于肝硬化患者和健康对照人群。其中miR-338-5p在肝细胞癌与肝硬化、健康人群鉴别时,曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.762 4（灵敏度：64.10%,特异度：87.50%）和0.906 4（灵敏度：89.74%,特异度：84.00%）。miR-21-5p和miR-338-5p进行联合诊断,特异度可达92.98%。即使在甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）判定为阴性的肝细胞癌患者,3种miRNA判定为肝细胞癌的灵敏度都比较高。相关性分析结果显示,血浆miR-338-5p水平与AFP水平呈负相关（r=-0.344,P=0.032）。结论循环miR-338-5p、miR-15b-5p、miR-21-5p具有作为肝细胞癌的肿瘤标记物的潜力。

miR-15b-5p靶向CDK4抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖

目的探讨miR-15b-5p通过靶向抑制细胞周期素依赖性激酶4 (CDK4)的表达进而发挥负向调节脉络膜黑色素瘤细胞增殖的作用。方法使用荧光素酶报告分析检测miR-15b-5p与CDK4结合情况。体外培养人眼侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞系MUM-2B,分别转染negative control RNA、miR-15b-5p mimics、inhibitor nc RNA和miR-15b-5p inhibitor;采用实时定量PCR检测转染后miR-15b-5p的表达水平;采用Western blotting检测4组细胞中CDK4蛋白的表达量;采用CCK8检测4组细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测4组细胞周期情况。结果荧光素酶报告基因分析验证miR-15b-5p能够与CDK4 m RNA 3’UTR结合。与阴性对照组相比,mimics组miR-15b-5p表达显著增加(t=25.01,P <0.000 1),CDK4的蛋白表达水平降低,细胞增殖能力降低,细胞G1期比例增高。而与inhibitor nc组相比,inhibitor组miR-15b-5p表达减少,CDK4表达水平升高,细胞增殖能力增强,细胞G1期比例降低。结论miR-15b-5p能够靶向抑制CDK4的表达,造成肿瘤细胞发生G1期阻滞,从而有效抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖。

过表达miR-15b对斑马鱼血管发育的影响

该研究利用斑马鱼全胚胎原位杂交技术和转基因(VEGFR2:GFP)斑马鱼模式生物,评估miR-15b对斑马鱼早期胚胎发育和后期血管生成的影响。实验结果表明:miR-15b可能是母源性分子,在斑马鱼早期胚胎中高表达,而过表达miR-15b导致斑马鱼血管发育畸形。蛋白免疫印迹和双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,miR-15b通过结合VEGFR2 m RNA 3’UTR区降低VEGFR2基因的表达水平,从而调控斑马鱼的血管生成。综上所述,miR-15b在斑马鱼胚胎发育过程中具有重要的作用,特别是对血管系统发育产生影响。该结果可为进一步研究miR-15b在斑马鱼胚胎发育过程的功能提供参考。

LncRNA HOXC-AS3通过miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞的增殖和迁移

背景与目的:胃癌是一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类具有调控功能的大分子非编码RNA,在胃癌的转移中发挥着重要的作用。探讨lncRNA HOXC-AS3(lnc-HOXC-AS3)在胃癌中的表达模式,以及通过miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞增殖和转移的分子机制。方法:根据生物信息学分析的方法寻找收集2017年4月—2018年12月安徽医科大学第一附属医院收治并经病理学检查诊断为胃癌的90例患者的胃癌组织中异常表达的lncRNA,并且利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测lnc-HOXC-AS3的表达水平;在对lnc-HOXC-AS3功能的研究中,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和transwell等方法确定了lnc-HOXC-AS3对胃癌细胞(MGC803)增殖和迁移的影响;在机制上,采用双荧光素酶报告基因检测lnc-HOXC-AS3、miR-15b-5p和E2F3的靶向调控关系。结果:Lnc-HOXC-AS3在胃癌组织和胃癌细胞系中异常高表达。功能上,lnc-HOXC-AS3促进胃癌细胞增殖和迁移,相反,敲低lnc-HOXC-AS3则明显抑制胃癌细胞增殖和迁移。在机制的探讨中,通过双荧光素酶报告基因和一系列体外实验证实lnc-HOXC-AS3通过靶向下调miR-15b-5p的表达,进而解除miR-15b-5p对E2F3的抑制作用,促进了胃癌细胞增殖和迁移。结论:Lnc-HOXC-AS3在胃癌中异常高表达,并通过调控miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞增殖和迁移,渴望成为研究胃癌早期诊断和治疗的靶点。

miR-15b-5p通过靶向LATS2基因调控前列腺癌细胞侵袭、迁移以及凋亡的分子机制

目的探讨miR-15b-5p靶向大肿瘤抑制分子(LATS2)基因对前列腺癌PC-3细胞侵袭、迁移及凋亡的影响及机制。方法将anti-miR-15b-5p及anti-miR-15b-5p+si-LATS2(同时抑制miR-15b-5p和LATS2表达)转染前列腺癌PC-3细胞,48 h后,通过qRT-PCR检测miR-15b-5p mRNA表达,Transwell小室检测细胞侵袭和迁移能力;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染细胞凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。双荧光素酶报告系统检测miR-15b-5p与LATS2的靶向关系。Western blotting检测LATS2、β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达。结果 PC-3细胞转染anti-miR-15b-5p后,miR-15b-5p mRNA表达明显降低,细胞侵袭和迁移能力明显降低,细胞凋亡率明显升高(P <0. 05)。miR-15b-5p与LATS2存在靶向关系,抑制LATS2表达后可明显减弱anti-miR-15b-5p对PC-3细胞侵袭、迁移、凋亡及β-catenin、MMP-2和Bax蛋白表达的影响(P <0. 05)。结论抑制miR-15b-5p可明显降低前列腺癌PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并诱导细胞凋亡,其机制与靶向LATS2抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

miR-15b靶基因预测、信号通路分析及靶基因鉴定

【目的】对miR-15b靶基因进行预测、信号通路分析及鉴定,以期为miR-15b的功能研究奠定基础.【方法】利用Target Scan Release 7.0,PicTar和PITA数据库对miR-15b靶基因进行预测,再用DAVID数据库对预测出的靶基因集进行功能富集分析(gene ontology-analysis)及信号转导通路富集分析(KEGG pathway analysis).随后利用双荧光素酶报告试验对预测出miR-15b的靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)和CD28进行验证.【结果】3个软件共同预测出miR-15b的靶基因有305个,其靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP结合蛋白调控等分子功能,蛋白氨基酸磷酸化、细胞周期调控等生物学过程及微管相关复合体、转录因子复合体等细胞组分上.信号转导通路则显著富集于癌症相关信号通路.双荧光素酶报告实验结果显示CD28为miR-15b的靶基因,而PDK4不是miR-15b的靶基因.【结论】miR-15b在细胞增殖、凋亡和细胞周期调控等过程中发挥重要调控作用,且miR-15b通过调控CD28的表达对T细胞的受体激活发挥调控作用.

大鼠细胞外信号调节激酶1基因3'非编码区双荧光素酶报告载体的构建及rno-miR-15b-5p对其活性的影响

目的以大鼠细胞外信号调节激酶1(ERK1)基因3'非编码区(UTR)为研究对象,构建含有ERK1基因3'UTR区的野生型以及突变型重组双荧光素酶报告载体,通过分析双荧光素酶报告载体的活性,明确rno-miR-15b-5p对报告载体的调节作用。方法采用miRNeasy Mini Kit提取大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞的总RNA,以PC12细胞的c DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)将ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。利用重叠延伸PCR,将ERK1基因3'UTR中的rno-miR-15b-5p潜在的靶序列TGCTGCT分别突变成CGAACGT和GTACACG,并将突变的ERK1基因3'UTR克隆到pmiR-RB-Report^(TM) vector中。结果成功构建了包含ERK1基因3'UTR区的野生型报告载体pmiR-ERK1 3'UTR和突变型报告载体pmiR-ERK1-mut 3'UTR。利用荧光素酶活性检测系统,发现rno-miR-15b-5p mimic可以降低野生型报告载体的活性(P<0.001),但不影响突变型报告载体的活性。结论成功构建ERK1基因3'UTR区野生型和突变型双荧光素酶报告载体,初步证明ERK1基因3'UTR区是rno-miR-15b-5p的结合靶点。