单孔胸腔镜肺癌根治术治疗早期NSCLC对应激反应指标、miR⁃20a、TOP2A的影响

目的研究单孔胸腔镜肺癌根治术治疗早期NSCLC对应激反应指标、miR⁃20a、TOP2A的影响。方法选取2021年1月至2022年12月于徐州贾汪区人民医院诊治的60例早期NSCLC患者,均行胸腔镜下肺叶切除术+淋巴结清扫,根据切口方式分别为单孔组(32例)和三孔组(28例),比较两组围术期指标、肺功能指标、应激反应指标、miR⁃20a、TOP2A及并发症情况。结果单孔组的胸管拔除时间短于三孔组,总胸腔引流量少于三孔组,VAS评分低于三孔组,差异有统计学意义(P<0.05);术后1个月两组的PEF、FVC、FEV1低于术前,但单孔组的水平均高于三孔组,差异有统计学意义(P<0.05);两组的MDA、PGE⁃2、Cor水平在术后1 d、3 d相比于同组术前1d呈现先升高后降低的趋势,且术后1 d、3 d单孔组的水平均低于三孔组,差异有统计学意义(P<0.05);单孔组和三孔组患者术后1 d及术后3 d的miR⁃20a及TOP2A均叫术前1 d显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);单孔组和三孔组术前1 d、术后1 d及术后3 d的miR⁃20a及TOP2A比较,差异均无统计学意义(P>0.05);单孔组术后并发症发生率为6.25%,低于三孔组的25.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论单孔胸腔镜肺癌根治术可显著改善早期NSCLC患者肺功能、应激反应、miR⁃20a及TOP2A,具有高效安全的优点。

miR-20a-5p调控NFKBIB对人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤增殖的影响

目的探讨miR-20a-5p对人肾母细胞瘤细胞系WiT49裸鼠移植瘤的影响及作用机制。方法从GEO数据库下载基因表达芯片,应用GEO2R获得差异基因miR-20a-5p;通过cBioPortal数据库获得与miR-20a-5p表达具有正相关关系的NF-κB基因;通过targetscan数据库预测miR-20a-5p靶基因可能为NF-κB转录因子抑制蛋白家族的NFKBIB,并使用双荧光素酶实验进行验证;体外培养肾母细胞瘤细胞系WiT49,采用miR-20a-5p模拟物及其抑制基因构建慢病毒载体分别转染至WiT49细胞;将12只裸鼠随机分为3组,WiT49模型组、WiT49-miR-20a-5p过表达组、WiT49-miR-20a-5p敲低组;裸鼠成瘤实验检测各组瘤块质量及体积;应用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各组瘤块中miR-20a-5p、NFKBIB及NF-κB表达情况;通过CCK-8细胞增殖实验验证各组瘤细胞增殖情况。结果miR-20a-5p在肾母细胞瘤中高表达,且与NF-κB表达呈正相关,miR-20a-5p与NFKBIB具有相互结合位点且存在结合作用;裸鼠成瘤实验中,WiT49-miR-20a-5p过表达组瘤块体积及质量较WiT49模型组均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);qRT-PCR实验中,WiT49-miR-20a-5p过表达组中miR-20a-5p及NF-κB表达均高于WiT49模型组,WiT49-miR-20a-5p过表达组中NFKBIB表达低于WiT49模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8细胞增殖实验中WiT49-miR-20a-5p过表达组细胞24及48 h吸光度高于WiT49模型组,WiT49-miR-20a-5p敲低组细胞24、48及72 h吸光度均低于WiT49模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论miR-20a-5p可能是通过调控NFKBIB激活NF-κB通路促进人肾母细胞瘤细胞WiT49裸鼠移植瘤生长。

miR-20a在妇科常见恶性肿瘤中的作用机制

宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌作为妇科最常见的三大恶性肿瘤,其发病率近年来在各年龄段中呈上升趋势,已严重威胁我国女性健康。尽管多种靶向药物的应用已使该类患者的生存期明显延长,但其仍是一类无法被精准诊断和治疗的疾病。miR-17-92基因簇作为最早被确定为癌基因的微小RNA(micro RNA,miRNA)家族,其作用机制一直被广泛关注。miR-20a是miR-17-92基因簇中的一员,可通过降低或上调表达的方式发挥转录后调控功能,进而影响下游基因通路,调控恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移,并最终实现恶性肿瘤的发生及进展。根据目前研究进展,miR-20a在宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢癌中表达特异性升高通常与疾病的恶性进展有关,综述miR-20a在妇科常见三大恶性肿瘤发病机制中作用的最新研究。

miR-20a调控压力超负荷型心肌肥大

背景:心肌肥大是心脏对压力超负荷等生理和病理刺激所做出的适应性反应,早期具有代偿意义,若刺激持续进行可引起心肌病变导致心力衰竭。micro RNAs参与调控了心肌肥大的发生发展,然而mi R-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用尚未见报道。目的:探究mi R-20a在压力超负荷所致心肌肥大中的作用及其机制。方法:横向主动脉缩窄术诱导心肌肥大小鼠模型,使用血管紧张素Ⅱ诱导心肌肥大H9c2细胞模型。体内实验在小鼠心脏原位注射mi R-20a过表达腺病毒,体外实验将mi R-20a mimic转染至H9c2细胞。通过检测心质量/体质量比值、细胞表面积、心肌纤维化等指标评估心肌肥大,实时荧光定量PCR法检测心房利钠肽、脑利钠肽、β-肌球蛋白重链和mi R-20a的表达水平,Mito Tracker法检测线粒体分裂情况,RNAhybrid软件预测miR-20a的下游靶基因。结果与结论:(1)在心肌肥大细胞模型和动物模型中,mi R-20a的表达水平均显著降低(P<0.05);(2)在动物水平,过表达miR-20a显著抑制了横向主动脉缩窄手术诱导的心肌肥大,包括抑制了肥大标志基因表达水平的升高(P<0.05),抑制了心脏体积的增大,抑制了心质量/体质量比值的升高(P<0.01),抑制了心肌横截面积的增大(P<0.05)以及减轻了心肌纤维化程度(P<0.01);(3)在细胞水平,过表达mi R-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大,包括抑制了心房利钠肽(P<0.05)、脑钠肽(P<0.01)、β-肌球蛋白重链(P<0.05)等肥大标志基因表达水平的升高,抑制了蛋白质/DNA比值的升高(P<0.01),抑制了细胞表面积的增大(P<0.05);(4)过表达mi R-20a显著抑制了血管紧张素Ⅱ诱导的线粒体分裂(P<0.05);(5)RNAhybrid软件分析结果显示mi R-20a与蛋白质活化酶抑制剂αm RNA的3’非翻译区可以很好地互补配对,且预测的结合位点具有高度保守性;(6)结果表明,在压力超负荷心肌肥大模型中mi R-20a表达水平显著下调,过表达mi R-20a可在细胞水平和动物水平抑制心肌肥大表型,并减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞线粒体分裂。

红景天苷调控miR-20a-5p/TIMP2轴对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖和迁移的影响

目的探讨红景天苷调控miR-20a-5p/金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP2)轴对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(HFLS-RA)功能和活化的影响。方法以HFLS-RA细胞为研究对象,将HFLS-RA细胞分为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)组、对照组、红景天苷组、miR-20a-5p抑制物阴性对照(inhibitor NC)组、miR-20a-5p抑制物组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物阴性对照(mimic NC)组、红景天苷+miR-20a-5p模拟物组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HFLS-RA细胞中miR-20a-5p表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HFLS-RA细胞上清液中白细胞介素(IL)-1β、IL-6水平;细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)染色检测HFLS-RA细胞增殖;划痕实验检测HFLS-RA细胞迁移;免疫印迹实验(Western blot)检测HFLS-RA细胞中TIMP2、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)-9蛋白表达;双荧光素酶验证miR-20a-5p与TIMP2的关系。结果与对照组比较,TNF-α组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、吸光度(OD_(450))值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白上调,TIMP2蛋白下调(P<0.05);与TNF-α组相比,红景天苷组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与inhibitor NC组、TNF-α组相比比较,miR-20a-5p抑制物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白下调,TIMP2蛋白上调(P<0.05);与红景天苷+mimic NC组、红景天苷组相比,红景天苷+miR-20a-5p模拟物组miR-20a-5p表达、IL-1β、IL-6水平、OD_(450)值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率及CyclinD1、MMP-9蛋白表达升高,TIMP2蛋白表达降低(P<0.05)。miR-20a-5p与TIMP2存在靶向调控关系。结论红景天苷可能通过调控miR-20a-5p/TIMP2抑制TNF-α诱导的HFLS-RA细胞增殖、迁移及炎症反应。

肺炎支原体肺炎患儿外周血miR-106a、miR-20a表达与胸部X线表现及炎症的相关性

目的:探讨肺炎支原体肺炎(MPP)患儿外周血微小RNA(miR)-106a、miR-20a表达与胸部X线(CXR)表现及炎症的相关性。方法:选取2020年1月至2021年12月本院收治的393例MPP患儿作为研究对象。采用全自动血细胞分析仪检测白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、中性分叶核白细胞等,免疫透射比浊法检测C反应蛋白(CRP)水平。采用实时定量聚合酶链反应法检测外周血miR-106a和miR-20a表达。所有患儿均在入组后接受CXR检查。结果:MPP患儿外周血miR-106a和miR-20a的表达水平分别为1.00(0.61,2.11)、1.06(0.73,1.67)。根据中位值分组,与miR-106a和miR-20a低表达组相比,高表达组患儿CRP水平和肺实变患儿比例明显更高(P<0.05);miR-20a高表达组患儿胸腔积液患儿比例也显著高于低表达组(P<0.05)。MPP患儿外周血miR-106a和miR-20a与CRP呈显著正相关(r值分别为0.212、0.230,均P<0.001)。肺实变组外周血miR-106a和miR-20a表达水平均显著高于非肺实变组(P<0.05)。经ROC曲线分析,外周血miR-106a和miR-20a预测MPP肺实变的曲线下面积(AUC)为0.811(95%CI:0.767~0.855)、0.807(95%CI:0.762~0.852),灵敏度分别为75.3%和77.4%,特异度分别为76.5%和76.4%,对应的截断值为1.20和1.18。Logistic回归分析显示,外周血miR-106a和miR-20a高表达是MPP肺实变的独立影响因素(P<0.05)。结论:MPP患儿外周血miR-106a和miR-20a过表达与CXR严重表现和炎症加重有关,两者可作为指示MPP严重程度和炎症进展的标志物。

贝伐珠单抗辅助PD-1抑制剂治疗胃癌对血清miR-20a-5p和miR-515-3p的影响研究

背景与目的:二线化疗方案治疗胃癌疗效欠佳,贝伐珠单抗属于抗血管生成分子靶向抗癌药物,信迪利单抗是一种国产的程序性死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)抑制剂,两者结合是临床治疗胃癌的新方向。本研究旨在探究贝伐珠单抗辅助PD-1抑制剂治疗胃癌对血清miR-20a-5p和miR-515-3p的影响。方法:选取2019年1月—2021年7月于南京医科大学第四附属医院就诊的84例胃癌患者进行回顾性研究,根据治疗方案的不同将其分为观察组和对照组(每组各42例),对照组给予二线化疗方案治疗,观察组在对照组基础上给予贝伐珠单抗联合PD-1抑制剂(信迪利单抗)治疗,比较两组的客观缓解率(objective response rate,ORR)、疾病控制率(disease control rate,DCR)、血清肿瘤标志物、免疫功能指标、血清miR-20a-5p、miR-515-3p及不良反应总发生率。本研究已通过南京医科大学第四附属医院伦理委员会的伦理审批(批件号:20230531--K061)。结果:观察组的ORR(69.05%)和DCR(85.71%)均高于对照组(40.48%、64.29%)。观察组治疗后的血清糖类抗原12-5(carbohydrate antigen 12-5,CA12-5)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)及细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokerantin-19-fragment antigen 21-1,CYFRA21-1)水平均低于对照组。观察组治疗后的CD4^(+)T淋巴细胞、CD4^(+)/CD8^(+)T淋巴细胞比值均高于对照组,CD8^(+)T淋巴细胞低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。观察组治疗后的血清miR-20a-5p、miR-515-3p水平均低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组(28.57%)的不良反应总发生率与对照组(38.10%)相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:贝伐珠单抗辅助信迪利单抗可有效地提高胃癌治疗效率,改善免疫功能,降低血清miR-20a-5p、miR-515-3p及肿瘤标志物表达量,且不会增加不良反应,效果显著。

卵巢型子宫内膜异位症患者外周血ROS、PON-1水平和miR-20a表达水平及与病情的关系

目的探究卵巢型子宫内膜异位症(EMs)患者外周血氧自由基(ROS)、氧磷酶-1(PON-1)水平和miR-20a表达水平及与病情的关系。方法回顾性选取2020年3月至2023年3月在江苏省人民医院(南京医科大学第一附属医院)进行治疗的113例卵巢型EMs患者纳入研究组,并根据美国生育协会分期标准对其进行分组:62例Ⅰ~Ⅱ期患者纳入轻度组,51例Ⅲ~Ⅳ期患者纳入重度组。另选30例在本院进行治疗的盆腔炎且子宫内膜正常患者纳入对照组。比较研究组与对照组患者、轻度组与重度组患者的ROS、PON-1水平和miR-20a相对表达水平,比较轻度组与重度组的血清炎症因子[白细胞介素(IL)-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)]水平,并探究其与患者病情严重程度的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析ROS、PON-1水平和miR-20a表达水平对重度卵巢型EMs的诊断价值。结果研究组患者的ROS水平和miR-20a相对表达水平分别为(485.55±32.12)pg/mL、2.48±0.33,均高于对照组患者[(326.26±28.12)pg/mL、1.03±0.24],PON-1水平为(152.23±8.78)pg/mL,低于对照组患者[(212.26±8.23)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。重度组患者的ROS水平和miR-20a相对表达水平分别为(498.22±18.45)pg/mL、2.64±0.37,均高于轻度组患者[(433.28±23.16)pg/mL、1.97±0.21],PON-1水平为(142.04±5.99)pg/mL,低于轻度组患者[(164.56±5.48)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。重度组患者的血清IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α水平分别为(33.26±2.45)、(29.55±3.16)、(39.45±2.78)、(29.88±2.64)pg/mL,均高于轻度组患者[(17.22±2.23)、(23.66±3.15)、(32.45±2.54)、(21.02±2.37)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。ROS水平,miR-20a相对表达水平,IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α水平与患者的临床分期呈正相关(r=0.847、0.751、0.862、0.685、0.830、0.859,P<0.05),PON-1水平与患者的临床分期呈负相关(r=-0.856,P<0.05)。ROS、PON-1水平,miR-20a相对表达水平诊断重度卵巢型子宫内膜异位的ROC曲线的曲线下面积(AUC)分别为0.991、0.997、0.936,具有较好诊断价值(P<0.05)。结论ROS水平、miR-20a相对表达水平在卵巢型EMs患者中升高,PON-1水平表达下调,且对其病情严重程度具有一定诊断价值,可用于临床辅助诊断。

LncRNA HOTAIR通过靶基因miR-20a-5p调控淋巴瘤细胞增殖、侵袭、迁移的分子机制研究

目的:探讨lnc RNA HOTAIR通过靶基因mi R-20a-5p对淋巴瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其分子机制研究。方法:合成HOTAIR si RNA和si RNA NC质粒后,分别转染淋巴瘤Raji细胞,RT-q PCR检测HOTAIR的m RNA表达,分别通过CCK-8实验、Transwell和细胞划痕愈合实验检测Raji细胞的增殖、侵袭和迁移情况。mi Rcode软件预测lnc RNA HOTAIR的靶基因,并通过双荧光素酶实验分析HOTAIR与靶基因的关系。合成mi R-20a-5p inhibitor和inhibitor NC后,瞬时转染Raji细胞,RT-q PCR检测mi R-20a-5p表达,分析下调mi R-20a-5p对Raji细胞的增殖、侵袭和迁移的影响。用lnc RNA HOTAIR过表达质粒和mi R-20a-5p模拟物同时转染Raji细胞,分析Raji细胞的增殖、侵袭和迁移能力。过表达或下调mi R-20a-5p后,分析JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达。结果:转染HOTAIR si RNA后Raji细胞中HOTAIR表达降低(P<0.01),转染mi R-20a-5p inhibitor后Raji细胞中mi R-20a-5p表达降低(P<0.01);HOTAIR与mi R-20a-5p存在靶向及负调控关系(r=-0.826);沉默HOTAIR促进mi R-20a-5p表达,抑制Raji细胞增殖、侵袭和迁移;下调mi R-20a-5p表达促进Raji细胞增殖、侵袭和迁移。上调mi R-20a-5p可逆转过表达HOTAIR对Raji细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用。下调mi R-20a-5p表达激活了细胞内JAK/STAT3信号通路。结论:HOTAIR通过靶向mi R-20a-5p影响淋巴瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,其作用机制可能与JAK/STAT3信号通路激活有关。

外泌体miR-20a-5p调控Sp1/CD147信号通路促进非小细胞肺癌的骨转移

目的探究外泌体miR-20a-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)骨转移的调控作用及机制。方法提取并鉴定16HBE、A549、PC9、H1299细胞以及转染miR-20a-5p mimic和miR-NC的A549细胞所分泌的外泌体。qRT-PCR检测各种细胞及外泌体中miR-20a-5p的表达。将A549和RAW264.7细胞分为PBS组、16HBE exo组、A549 exo组、miR-NC exo组和miR-20a-5p exo组。Transwell小室检测A549细胞迁移和侵袭能力,TRAP染色检测破骨细胞分化。Western blot检测各组RAW264.7细胞Sp1和CD147的表达。6周龄的雌性Balb/c裸鼠随机分为5组,分别注射PBS(A组)、16HBE exo(B组)、A549 exo(C组)、miR-NC exo(D组)和miR-20a-5p exo(E组)外泌体4周,构建NSCLC骨转移的小鼠模型;HE染色观察各组小鼠骨转移情况。结果透射电镜下观察到A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo为具有双层膜的囊泡样结构,粒径在30~100 nm,且均表达CD9、CD81、HSP70标志蛋白。miR-20a-5p高表达于NSCLC细胞及其外泌体。与PBS组相比,A549 exo组肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。与miR-NC exo组相比,miR-20a-5p exo组A549细胞迁移和侵袭能力增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。在小鼠体内实验中,A组、B组骨组织骨小梁结构完整,组织中有少量肿瘤细胞,骨髓腔相对完整,病变较少;C组小鼠骨组织出现大量肿瘤细胞且细胞紧密排列,骨小梁显著破坏,核浆比例严重失调,病变显著增加;E组小鼠骨组织中出现大量肿瘤细胞,骨小梁破坏严重,病变较D组显著。结论外泌体miR-20a-5p可显著促进NSCLC的体内外转移,其机制可能为激活破骨细胞Sp1/CD147信号通路从而促进破骨细胞的分化。

喉癌细胞外泌体miR-20a对肿瘤相关巨噬细胞增殖和凋亡的影响

目的探究喉癌细胞外泌体miR-20a对肿瘤相关巨噬细胞增殖和凋亡的影响。方法提取并且鉴定16HBE、TU686、TU177、TU212细胞所分泌的外泌体(记为16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo)。TU212细胞转染miR-20a模拟物和阴性对照,并收集转染后TU212所分泌的外泌体(记为miR-20a exo和miR-NC exo),M2型巨噬细胞与PBS以及16HBE exo、TU686 exo、TU177 exo、TU212 exo、miR-NC exo和miR-20a exo共孵育48 h(记为PBS组、16HBE exo组、TU686 exo组、TU177 exo组、TU212 exo组、miR-NC exo组和miR-20a exo组),CCK8法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western bloting检测细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB又称AKT)磷酸化水平。结果本文所提取的外泌体符合其结构和生物学特征。TU686 exo组、TU177 exo组、TU212 exo组M2型巨噬细胞增殖能力显著高于PBS组(P<0.05),细胞凋亡率(9.67%±1.53%、8.67%±2.08%、4.00%±1.00%)显著低于PBS组(21.67%±4.72%)(P<0.01),PI3K(0.81±0.03、0.70±0.03、1.10±0.08)和AKT(1.55±0.11、1.86±0.06、2.13±0.10)磷酸化水平显著高于PBS组(0.19±0.04和0.11±0.03)(P<0.001)。miR-20a exo组M2型巨噬细胞增殖能力显著高于miR-NC exo组(P<0.05),细胞凋亡率(8.33%±1.52%)显著低于miR-NC exo组(14.33%±1.53%)(P<0.01),PI3K(1.05±0.09)和AKT(1.55±0.11)磷酸化水平显著高于miR-NC exo组(0.11±0.04和1.19±0.03)(P<0.001)。结论喉癌细胞外泌体miR-20a可调控M2型巨噬细胞的增殖和凋亡,其机制可能为激活PI3K/AKT信号通路。

慢性乙型病毒性肝炎患者外周血外泌体miR-21、miR-20a表达与MDSCs功能的相关性

目的探究慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者外周血外泌体微小RNA(microRNA,miR)-21、miR-20a表达与髓源性抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)功能的相关性。方法选取2019年6月—2022年12月在绵阳市中心医院治疗的105例慢乙肝患者作为观察组,并根据患者免疫应答情况分为免疫耐受期组(65例)、免疫激活期组(40例);另选取我院同期105例健康体检者作为对照组纳入研究。采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)法对患者外周血外泌体miR-21、miR-20a的相对表达水平进行检测;流式细胞术检测各组患者外周血中MDSCs含量。对观察组患者外周血外泌体miR-21、miR-20a水平与参与MDSCs扩增的信号通路[信号转导与转录激活因子(signal transduction and activator of transcription,STAT)1、STAT3、STAT6]、MDSCs功能因子[一氧化氮(nitric oxide,NO)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、精氨酸酶1(arginase 1,ARG1)]的相关性进行分析。结果与对照组相比,免疫耐受期组、免疫激活期组外周血外泌体miR-21、miR-20a水平均显著升高(P均<0.05),且免疫耐受期组高于免疫激活期组(P均<0.05);与对照组相比,免疫耐受期组、免疫激活期组外周血MDSCs含量均显著升高(P均<0.05),而免疫激活期组较免疫耐受期组外周血MDSCs含量明显降低(P<0.05);与对照组相比,免疫耐受期组、免疫激活期组血清STAT3、STAT6水平均显著升高,STAT1水平明显降低(P均<0.05),且免疫耐受期组较免疫激活期组血清STAT3、STAT6水平均明显升高,STAT1水平显著降低(P均<0.05);与对照组相比,免疫耐受期组、免疫激活期组血清NO、iNOS、ARG1水平均显著升高(P均<0.05),且免疫耐受期组较免疫激活期组患者升高明显(P均<0.05);观察组外周血外泌体miR-21、miR-20a水平与外周血MDSCs含量、血清STAT3、STAT6、NO、iNOS、ARG1水平均呈正相关(r=0.643,0.593,0.485,0.573,0.543,0.531;r=0.621,0.551,0.585,0.570,0.683,0.410,P均<0.05),与血清STAT1水平均呈负相关(r=-0.525,-0.480,P均<0.05)。结论慢乙肝患者外周血外泌体miR-21、miR-20a水平升高,与患者外周血MDSCs含量以及参与MDSCs扩增的信号通路和功能因子相关。

miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响及信号通路调控机制

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制。方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养。通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性。通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系。通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平。结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26%、58.84%和68.12%(P<0.05)。双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P<0.05)。过表达SMURF1抑制了miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P<0.05)。结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化。

肺癌与癌旁组织中miR-20a的定量检测及其意义

目的探讨人肺癌与癌旁组织miR-20a定量检测的临床意义。方法 real-timePCR检测31例肺癌及其对应癌旁组织中miR-20a的表达量,分析其与肺癌组织学类型、临床分期、分化程度等临床病理特征的关系。结果肺癌组织miR-20a表达量(2-△△Ct)为3.630(1.042～7.727),与对应癌旁组织相比,有显著性差异(P<0.05)。miR-20a与肺癌临床分期、分化程度、病理类型、肿块大小和淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。结论 miR-20a在肺癌组织高表达,可能与肺癌的发生有关。

黄芪多糖通过调控miR-20a/TGFBR2分子轴降低结直肠癌HT-29/DDP细胞的顺铂耐药性

目的:探讨黄芪多糖(APS)通过调控miR-20a/TGFBR2分子轴对结直肠癌(CRC)顺铂耐药细胞HT-29/DDP增殖、侵袭、凋亡和耐药性的影响及其机制。方法:以人CRC HT-29细胞、HT-29/DDP细胞为亲本和耐药细胞模型,将HT-29/DDP细胞随机分为4组:对照组、APS处理组、过表达miR-20a+APS组、沉默TGFBR2+APS组。用不同质量浓度的APS(0、0.5、1.0、1.5和2.0 mg/ml)处理HT-29/DDP细胞后,以qPCR和Wb实验检测细胞中miR-20a和TGFBR2的表达水平;用CCK-8、Transwell和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测对HT-29/DDP细胞增殖、侵袭和凋亡的影响;用双荧光素酶报告基因验证miR-20a与TGFBR2的靶向作用关系。构建裸鼠皮下CRC HT-29/DDP细胞移植瘤模型,观察APS对移植瘤生长的影响及其机制。结果:APS显著抑制HT-29/DDP细胞的增殖(P<0.01),且呈剂量依赖性。miR-20a在经APS处理后的HT-29/DDP细胞中低表达(P<0.01)、TGFBR2的表达水平显著上调(P<0.01)。双荧光素酶报告基因证实miR-20a靶向作用TGFBR2并下调其表达水平。体内外实验证实APS通过靶向下调miR-20a对TGFBR2的抑制作用,提高HT-29/DDP细胞的药物敏感性,进而抑制该细胞增殖、侵袭和促进凋亡(均P<0.01);同时发现,该作用与抑制PCNA、Bcl-2蛋白而促进Bax、Caspase-3蛋白表达有关联。结论:APS通过下调miR-20a对TGFBR2表达的抑制作用,从而逆转HT-29/DDP细胞对顺铂的耐药性。

miR-20a海绵载体构建及在白血病细胞株Jurkat中的表达

本研究构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立Jurkat-S稳定细胞株,为进一步研究的miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础。设计、合成1对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列,并带有酶切位点,退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上;载体双酶切后再与退火产物连接,重复4次后进行酶切及荧光素酶活性鉴定;亚克隆到慢病毒表达载体,与psPAX2、PMD2G共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度,感染Jurkat细胞,建立稳定细胞株;应用实时PCR和Western blot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白的表达,并与对照组进行比较。结果表明,成功构建了针对miR-20a基因的海绵载体,病毒滴度为5×107TU/ml;建立了稳定转染的Jurkat-S细胞株。有效干扰验证显示,miR-20a海绵能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建miR-20a基因的miRNA海绵载体,建立稳定干扰miR-20a表达的Jurkat-S细胞株。

miR-17-5p、miR-17-3p和miR-20a-5p在胃间质瘤中表达

目的探讨miR-17-5p、miR-17-3p及miR-20a-5p在胃间质瘤(gastric stromal tumor,GST)中的差异表达及其与临床病理因素的关系。方法提取正常胃组织及GST组织共72例标本的总RNA,应用Real time RT-PCR方法检测miR-17-5p、miR-17-3p及miR-20a-5p的表达,用SPSS 19.0分析其与临床病理因素的关系及3个miRNA间的相关性。结果在GST中,miR-17-3p、miR-17-5p在肿瘤组织中表达较胃正常组织低(P<0.001),但是在低危组和中高危组GST中表达差异无统计学意义(P>0.05);miR-20a-5p表达在胃正常组织、低危组和中高危组之间均有差异表达,且随着恶性度的增加而下降(P<0.001),3种miRNA的表达水平与肿瘤的侵袭、转移、年龄、肿瘤最大直径和核分裂象密切相关,而与瘤体是否破溃无关。结论 miR-17-5p、miR-17-3p、miR-20a-5p在GST中下调并相互作用可能是促进GST发生、发展因素之一。

膀胱移行细胞癌E2F3、miR-17-5p、miR-20a的表达及相关性分析

目的检测E2F3、miR-17-5p、miR-20a在膀胱癌中的表达情况,分析E2F3与miR-17-5p、miR-20a之间是否存在关联性。方法荧光定量RT-PCR法检测不同病理分级膀胱移行细胞癌组织和细胞系5637、T24中miR-17-5p、miR-20a和E2F3基因的表达,Western blot检测E2F3蛋白的表达。结果与正常膀胱黏膜比较,膀胱移行细胞癌组织及5637、T24细胞系中E2F3、miR-17-5p和miR-20a均高表达(P<0.05)。E2F3表达随着病理分级的升高逐步增多,miR-20a表达随病理分级的升高有降低趋势。5637细胞系相对T24细胞系高表达E2F3(P<0.05)。结论膀胱移行细胞癌中miR-17-5p、miR-20a和E2F3均高表达,miR-20a和miR-17-5p的表达与E2F3的增高密切相关。

雷帕霉素对RAW264.7细胞6种miRNAs表达的影响及miR-20a对ATG16L1的靶向调控作用

目的:探讨雷帕霉素对miR-17-92簇中的6种miRNAs表达的影响,及miR-20a对ATG16L1基因的靶向调控作用。方法:利用qRT-PCR检测雷帕霉素对RAW264.7细胞miR-17-92簇中的miR-20a等6种miRNAs的表达水平;通过双荧光素酶报告系统、Western blot,验证miR-20a对ATG16L1的靶向调控关系。结果:与正常组相比,雷帕霉素组RAW264.7细胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表达水平显著上调(P<0.05);3-MA组RAW264.7细胞的miR-20a表达水平显著下调(P<0.05)。双荧光素酶报告系统结果显示,miR-20a可靶向ATG16L1-3'-UTR,抑制其表达;Western blot结果显示,miR-20a能明显抑制ATG16L1蛋白的表达,说明miR-20a可靶向抑制ATG16L1的表达,参与调控细胞自噬过程。结论:miR-20可靶向抑制Atg16L1的表达,参与调控RAW264.7细胞自噬过程。

miR-20a-5p在胰腺癌中的表达及作用机制研究

目的检测并分析胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中miR-20a-5p的表达情况及对胰腺癌细胞发生、发展的影响。方法收集16对手术切除胰腺癌患者的癌组织及对应癌旁组织、5种胰腺癌细胞株及1株正常胰腺导管上皮细胞,通过实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative realtime polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测临床标本及胰腺癌细胞株中miR-20a-5p的表达水平;通过转染miR-20a-5p mimics及miR-20a-5p inhibitor分别上调及下调胰腺癌细胞(AsPC-1、BxPC-3)中miR-20a-5p的表达水平,采用CCK-8、EdU及流式凋亡实验检测过表达及敲低miR-20a-5p后对胰腺癌细胞活力、增殖及凋亡能力的影响。结果胰腺癌组织中miR-20a-5p的表达量显著高于癌旁组织(P<0.01),5种胰腺癌细胞系中miR-20a-5p的表达量较正常胰腺细胞也明显升高(P<0.05)。CCK-8及EdU实验结果显示,过表达miR-20a-5p促进胰腺癌细胞增殖能力,反之,干扰miR-20a-5p抑制胰腺癌细胞增殖。凋亡检测结果显示,过表达miR-20a-5p抑制胰腺癌细胞凋亡能力,反之,干扰miR-20a-5p促进胰腺癌细胞凋亡。结论胰腺癌组织和胰腺癌细胞系均高表达miR-20a-5p,上调miR-20a-5p能促进胰腺癌细胞增殖及抗凋亡能力。