内质网应激头颈部鳞状细胞癌细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路促进巨噬细胞PD⁃L1表达

目的探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squa⁃mous cell carcinoma,HNSCC)细胞分泌的外泌体miRNA表达变化对巨噬细胞的影响机制。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR实验(RT⁃qPCR)检测HNSCC肿瘤组织及癌旁组织ERS相关蛋白,包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R⁃like endoplas⁃mic reticulum kinase,PERK)和葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)的表达水平;以500 U/mL干扰素⁃γ(interferon⁃γ,IFN⁃γ)处理人喉鳞癌细胞系HN4细胞48 h,诱发HN4细胞产生内质网应激反应,收集HN4细胞分泌的外泌体,通过生物信息学分析鉴定外泌体的miRNA种类,预测miRNA的靶基因,将巨噬细胞转染miRNA、与收集的外泌体共培养、并敲低巨噬细胞PTEN表达,以WB和RT⁃qPCR检测外泌体miRNA调控的下游信号通路蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及程序性死亡受体⁃1配体(programmed death receptor ligand 1,PD⁃L1)表达变化。结果HNSCC肿瘤组织相比癌旁组织ERS相关蛋白表达水平升高(P<0.05);RNA测序及实验验证表明ERS的HN4细胞分泌的外泌体miR⁃26a⁃5p表达上调(P<0.05);PTEN是miR⁃26a⁃5p的靶基因,miR⁃26a⁃5p升高巨噬细胞PD⁃L1表达水平,并下调PTEN表达(P<0.05);巨噬细胞与ERS外泌体共培养,miR⁃26a⁃5p和PD⁃L1表达上升,PTEN表达下降,p⁃AKT表达升高(P<0.05);敲低巨噬细胞PTEN表达,PD⁃L1表达上升(P<0.01)。结论ERS的HNSCC细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路及PD⁃L1的表达。

circRNA_0051079通过靶向miR⁃26a⁃5p/PTEN轴诱导视网膜神经变性的分子机制

目的探讨circ_0051079对缺血/再灌注(I/R)损伤诱导的视网膜神经变性的影响及机制。方法从C57BL/6J乳鼠眼球中分离视网膜神经节细胞(RGC),随机分为对照组、siRNA组(转染阴性siRNA)、si_circ_0051079组(转染si⁃circ⁃0051079干扰RNA)、模拟物对照组(转染Scr mimic)、miR⁃26a⁃5p组(转染miR⁃26a⁃5p mimic)、miR⁃26a⁃5p+vector组(转染pcDNA 3.1)、miR⁃26a⁃5p+PTEN组(转染pcDNA 3.1⁃PTEN),分别在正常、缺氧(体积分数1%O_(2)暴露)或氧化应激(50μmol·L^(-1) H_(2) O_(2)暴露)条件下培养24 h,进行RT⁃qPCR、CCK⁃8、TUNEL、RNA免疫沉淀(RIP)等检测。于15只C57BL/6小鼠左眼中建立I/R损伤模型,对侧眼保持正常眼压作为对照,I/R损伤后0 d、3 d和7 d各取5只小鼠收集视网膜检测circ_0051079表达。另取20只C57BL/6小鼠分为正常对照组(用针头插入左眼前房但不升高眼压)、I/R组(左眼I/R损伤处理)、I/R+对照shRNA组(左眼注射无序shRNA并建立I/R损伤模型)、I/R+circ_0051079 shRNA组(左眼注射circ_0051079 shR⁃NA并建立I/R损伤模型)。I/R损伤后7 d,取视网膜进行蛋白免疫荧光染色。收集2020年11月至2021年3月急性闭角型青光眼和白内障患者的房水样本各20例,进行RT⁃qPCR测定。结果缺氧或氧化应激条件下培养的RGC中circ_0051079表达量较正常条件下培养的RGC增加(均为P<0.05)。在缺氧或氧化应激条件下培养,si_circ_0051079组RGC细胞活力均较siRNA组增加,RGC凋亡细胞数均减少(均为P<0.05)。荧光素酶报告基因分析和RIP检测结果表明,circ_0051079可以通过调节miR⁃26a⁃3p/PTEN信号转导进而影响RGC功能。动物实验中,I/R损伤可致视网膜组织中circ_0051079表达量升高(P<0.05)。与正常对照组(1.00±0.07)相比,I/R+circ_0051079 shRNA组小鼠视网膜中circ_0051079表达水平(0.37±0.04)下降(P<0.05),同时I/R诱导的视网膜神经变性减轻。临床研究中,与白内障患者房水样本相比,青光眼患者房水样本中circ_0051079和PTEN mRNA表达增加,miR⁃26a⁃3p表达降低(均为P<0.001)。结论circ_0051079可能是缺血性视网膜病变诊断和治疗的潜在靶点。

miR⁃26a⁃5p靶向PTEN基因影响成骨细胞分化及基质矿化

目的探究微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)对第10染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)的靶向作用及对成骨细胞分化及基质矿化的影响。方法通过在线软件预测miR-26a-5p与PTEN基因的结合位点,并经双荧光素酶报告基因检测验证。取生长状态良好的MC3T3-E1细胞,分为miR-26a-5p模拟物(mimic)组、miR-26a-5p mimic阴性对照(NC)组、pcDNA3.1-PTEN组、miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组,通过MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶活性测定研究细胞分化情况、骨钙素定量检测分析和茜素红染色观察细胞基质矿化情况、Western blot检测成骨分化标志物和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路蛋白表达变化。结果与NC组比较,miR-26a-5p mimic组miR-26a-5p水平、细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素、矿化率及β-catenin表达升高,PTEN mRNA及蛋白表达和糖原合成酶激酶-3b(Gsk-3b)表达降低(P<0.05),pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05);与miR-26a-5p mimic组比较,miR-26a-5p+pcDNA3.1-PTEN组PTEN mRNA及蛋白表达和Gsk-3b表达升高,细胞增殖率、碱性磷酸酶活性、ColⅠ、OPN、骨钙素、矿化率及β-catenin表达降低(P<0.05)。结论miR-26a-5p可靶向下调PTEN表达,调控Wnt/β-catenin信号通路,促进成骨细胞增殖、分化及基质矿化。

孟鲁司特钠片联合糠酸氟替卡松治疗支气管哮喘患儿的疗效及对miRNA-21、miRNA-26a水平的影响

目的探究孟鲁司特钠片联合糠酸氟替卡松治疗对支气管哮喘患儿血清微小RNA(miRNA)-21及miRNA-26a水平的影响。方法选择2020年3月至2022年3月陕西省人民医院儿童病院收治的支气管哮喘患儿120例,按照随机数字表法分为两组,每组60例。在常规方法的基础上,对照组使用布地奈德雾化吸入治疗,观察组使用孟鲁司特钠片联合糠酸氟替卡松治疗。比较两组治疗后临床疗效和不良反应。检测并比较两组患儿肺功能指标、血清炎症因子以及miRNA-21、miRNA-26a表达水平。结果治疗后两组第1秒用力呼气容积(FEV_(1))和最大呼气流量(PEF)均显著升高(P<0.05),且观察组FEV1和PEF均显著高于对照组(P<0.05)。治疗后两组超敏C感应蛋白(hs-CRP)和白细胞介素6(IL-6)水平均显著降低(P<0.05),且观察组hs-CPR和IL-6水平均显著低于对照组(P<0.05)。治疗后两组miRNA-21和miRNA-26a表达水平均显著降低(P<0.05),且观察组均显著低于对照组(P<0.05)。两组不良反应总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论糠酸氟替卡松联合孟鲁斯特钠片对儿童支气管哮喘具有更好的临床疗效,可提高肺功能,并具有一定的安全性。并且联合治疗可能通过下调miRNA-21和miRNA-26a的表达水平抑制炎症因子。

miR-21、miR-26a及miR-200a在子痫前期患者中的表达水平及与病情的相关性

目的分析miR-21、miR-26a及miR-200a在子痫前期(PE)患者血清中的表达,并探讨其临床意义。方法选取2019年3月至2021年3月在南京市妇幼保健院治疗的PE患者103例,分为轻度PE组(57例)和重度PE组(46例),另选取同期正常孕妇50例作为对照组。检测各组孕妇血清miR-21、miR-26a及miR-200a表达水平,分析其与年龄、孕周、BMI、血压、24h尿蛋白及不良妊娠结局的相关性,并分析血清miR-21、miR-26a及miR-200a对PE的诊断价值。结果重度PE组BMI、舒张压、收缩压以及24h尿蛋白高于轻度PE组及对照组,且差异具有统计学意义(F值分别为4.116、141.063、143.118和342.736,P<0.05)。对照组、轻度PE组及重度PE组孕妇血清中miR-21、miR-26a及miR-200a的表达水平依次升高。Pearson相关性分析结果显示,血清miR-21、miR-26a及miR-200a的表达水平与血压、24h尿蛋白及不良妊娠结局发生率呈正相关(r值介于0.446~0.832之间,P<0.001)。经受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析发现,血清miR-21、miR-26a及miR-200a联合诊断PE的曲线下面积(AUC)为0.967,敏感度为98.10%,特异性为92.30%。结论PE患者血清miR-21、miR-26a及miR-200a的表达高于正常孕妇,且与患者的临床指标及不良妊娠结局相关,检测血清miR-21、miR-26a、miR-200a水平对早期诊断PE及评估患者预后具有十分重要的意义。

miR-26a通过HGF/c-Met通路调控乳腺癌血管生成及分子机制

目的:研究miR-26a通过肝细胞生长因子(HGF)/细胞间质上皮转化(c-Met)通路调控乳腺癌血管生成及分子机制。方法:选择深圳市宝安区松岗人民医院2021年1月~2022年3月收治的乳腺癌患者40例,采集所有受试者的乳腺癌组织以及癌旁正常组织,比较不同乳腺组织织miR-26a、血管内皮生长因子A(VEGFA)mRNA相对表达量以及微血管密度(MVD)情况。此外,通过LipofectamineTM2000脂质体法将miR-26a模拟物以及抑制物分别转染至乳腺癌细胞中,记作miR-26a转染组、miR-26a抑制组,并将未进行任何处理的乳腺癌细胞作为阴性对照组。采用PCR方法检测HGF/c-Met通路相关蛋白及其下游靶基因磷脂酰肌醇激酶3(PI3K)、蛋白酶B(AKT)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达情况。结果:乳腺癌组织中miR-26a相对表达量相较于癌旁正常组织更低,而VEGFA相对表达量与MVD相较于癌旁正常组织更高,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-26a抑制组HGF、p-c-Met/c-MET表达水平相较于阴性对照组以及miR-26a转染组均更高,而miR-26a转染组HGF、p-c-Met/c-MET表达水平相较于阴性对照组更低,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-26a抑制组PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量相较于阴性对照组以及miR-26a转染组更高,而miR-26a转染组PI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量相较于阴性对照组更低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:miR-26a通过抑制HGF/c-Met通路,降低PI3K、AKT、mTOR表达,抑制乳腺癌的发生及发展。

lncHAGLR通过抑制miR-26a激活NF-κB促进骨关节炎大鼠软骨细胞的炎症反应和细胞凋亡

目的探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOXD反义生长相关长链非编码RNA(HOXD antisense growth-associated long non-coding RNA,lncHAGLR)对大鼠膝关节退行性软骨细胞C518细胞的炎症反应和凋亡的作用与潜在机制。方法采用StarBase和荧光素酶报告基因法预测和确认ln-cHAGLR和微小RNA(microRNA,miR)-26a之间的相互作用。为研究lncHAGLR对miR-26a表达的调控作用,将C518细胞分为沉默lncHAGLR的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)载体质粒(si-ln-cHAGLR)组、siRNA的阴性对照(negative control of siRNA,si-NC)组、miR-26a抑制剂阴性对照(nega-tive control of miR-26a inhibitor,inhibitor-NC)组、miR-26a的抑制剂(miR-26a-inhibitor)组。此外,为研究lncHAGLR是否通过调控miR-26a对C518细胞的炎症和凋亡具有调控作用,将C518细胞分为5组:Control组、白细胞介素(interleukin,IL)-1β组、IL-1β+si-NC组、IL-1β+si-lncHAGLR组和IL-1β+si-lncHA-GLR+miR-26a-inhibitor组。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)分析lncHAGLR和miR-26a的水平。采用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydro-genase,LDH)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测C518细胞的增殖、细胞毒性和凋亡情况。蛋白质印迹检测切割模式的半胱天冬酶3(CLEAVED-CASPASE3)、核因子κB P65(nuclear factor-κB P65,NF-κB P65)、磷酸化的NF-κB P65(phosphorylated NF-κB P65,P-NF-κB P65)的表达。ELISA法检测白细胞介素(interleukin,IL)-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α的释放。结果lncHAGLR直接靶向miR-26a。在IL-1β组,lncHAGLR水平明显较Control组增高,miR-26a水平较Control组降低(P均<0.05)。此外,IL-1β+si-lncHAGLR组减轻了IL-1β诱导的C518细胞的炎症并抑制了凋亡,而且细胞的活力增加,LDH释放减少,CLEAVED-CASPASE3的表达被抑制,TNF-α和IL-6的分泌减少,且p-NF-κB P65表达减少(P均<0.05)。IL-1β+si-lncHAGLR+miR-26a-inhibitor组逆转了IL-1β+si-lncHAGLR组的结果(P均<0.05)。结论lncHAGLR通过抑制miR-26a激活NF-κB促进C518细胞的炎症反应和细胞凋亡,表明lncHAGLR可能是治疗骨关节炎的一个有价值的靶点。

非诺贝特对糖尿病小鼠视网膜神经组织中miR-26a-5p/PTEN表达的影响

目的:研究非诺贝特对糖尿病小鼠视网膜神经损伤的保护作用并观察其对miR-26a-5p及其靶基因PTEN的影响。方法:构建糖尿病小鼠模型,并进行非诺贝特灌胃,H&E及透射电镜观察视网膜神经损伤情况,Real-time PCR检测视网膜组织中miR-26a-5p的表达,Western blotting检测同源性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)在视网膜组织中的表达,并观察NF-κB及IL-1β的水平及视网膜神经上皮的结构变化。结果:与糖尿病组相比,非诺贝特治疗组糖尿病小鼠视网膜神经节细胞损伤及神经纤维层萎缩明显减轻,视网膜中miR-26a-5p表达升高,PTEN mRNA和蛋白表达下降,炎性介质NF-κB及IL-1βmRNA表达水平下降(P<0.05)。结论:非诺贝特通过上调miR-26a-5p抑制PTEN的表达,降低炎症因子水平,减轻视网膜细胞损伤,发挥糖尿病视网膜神经保护作用。

狼疮性肾炎患者尿液miR-26a、miR-146a表达及对病情活动的预测价值分析

目的 分析狼疮性肾炎(LN)患者尿液miR-26a、miR-146a表达及对病情活动的预测价值。方法 选取2021年1月至2022年12月在本院住院的158例LN患者,按照系统性红斑狼疮活动指数(SLEDAI)将其分为LN稳定期组(88例)和LN活动期组(70例);选取同期本院60例体检健康者作为对照组。比较三组的一般资料及常规实验室指标;用多因素Logistic回归分析影响LN病情活动的因素;分析LN患者尿液miR-26a、miR-146a预测病情活动的效能。结果 LN活动期组和LN稳定期组的补体C3、补体C4、血红蛋白、白蛋白水平及尿液miR-26a、miR-146a表达量均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LN活动期组的补体C4、血红蛋白、白蛋白水平及尿液miR-26a、miR-146a表达量均低于LN稳定期组,尿酸水平高于LN稳定期组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,尿液miR-26a、miR-146a均是影响LN患者病情活动的因素(P<0.05)。尿液miR-26a、miR-146a及二者联合预测LN患者病情活动的曲线下面积(AUC)分别为0.773、0.686、0.876;二者联合预测价值优于尿液miR-26a及miR-146a单独预测(P=0.037、0.000)。结论 miR-26a及miR-146a在LN患者尿液中表达降低,二者联合用于预测LN病情活动的价值更高。

LncRNA SNHG5/miR-26a-5p/MTDH信号轴促进结直肠癌转移的机制研究

背景与目的:长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因5(long non-coding RNA small nucleolar RNA host gene 5,lncRNA SNHG5)在多种癌症中发挥促癌作用,但其对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的影响和调节机制尚不清楚。本研究旨在探究lncRNA SNHG5/miR-26a-5p/异粘蛋白(metadherin,MTDH)信号轴促进CRC转移的机制。方法:分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的数据,探索CRC中异常表达的lncRNA并进行生存分析。收集2020年10月—2021年10月经手术切除的100例CRC、癌旁组织样本及患者的完整临床资料,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测lncRNA SNHG5、miR-26a-5p表达水平,采用免疫组织化学法检测MTDH的表达水平,分析lncRNA SNHG5在CRC中的相对表达水平与临床病理学特征及生存期的关系。通过细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测、克隆形成、划痕、transwell实验及体内异种移植实验检测lncRNA SNHG5对CRC细胞增殖、迁移及侵袭的影响,通过蛋白质印迹法(Western blot)和免疫组织化学检测CRC细胞转移、上皮-间充质转化相关分子表达水平与lncRNA SNHG5表达水平的关系。通过RNA下拉实验、双荧光素酶报告基因检测、RNA免疫共沉淀实验探究SNHG5与miR-26a-5p、MTDH与miR-26a-5p在物理上的相互作用,通过CCK-8、EdU、transwell实验验证三者在功能上的相互关系,采用Western blot检测分析SNHG5、miR-26a-5p、MTDH表达对迁移、侵袭相关分子的影响。结果:TCGA数据库分析结果显示,lncRNA SNHG5在CRC中显著上调。RTFQ-PCR和免疫组织化学检测结果显示,CRC组织中lncRNA SNHG5、MTDH水平显著上调(P<0.05),miR-26a-5p水平下降(P<0.05),SNHG5高表达的样本中MTDH水平也较高。浆膜及浆膜外浸润、远处转移、淋巴结转移、TNMⅢ期的CRC组织lncRNA SNHG5表达量高于浆膜下浸润、无远处转移、无淋巴结转移、TNMⅠ~Ⅱ期的组织,差异有统计学意义(P<0.05)。生存分析结果显示,lncRNA SNHG5高表达与总生存率显著相关(P<0.05)。过表达lncRNA SNHG5能够提升CRC细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力,促进移植瘤生长和肺转移,提高Ki-67增殖指数和波形蛋白(vimentin)的相对表达水平(P<0.05),降低E钙粘蛋白(E-cadherin)的相对表达水平(P<0.05),而抑制lncRNA SNHG5表达后CRC细胞的发展受到抑制。RNA下拉实验、双荧光素酶报告基因检测、RNA免疫共沉淀实验证实SNHG5与miR-26a-5p、MTDH及miR-26a-5p存在物理上的相互作用,在lncRNA SNHG5过表达细胞中上调miR-26a-5p或下调MTDH表达可部分逆转lncRNA SNHG5对CRC细胞增殖、迁移、侵袭及相关分子表达水平的影响。结论:LncRNA SNHG5在CRC组织和细胞中表达上调,其高表达与肿瘤进展及生存不良有关,可作为miR-26a-5p的分子海绵调节MTDH表达促进SW620细胞增殖和转移。

miR-26a-5p调控SLC26A4挽救听力减退在耳聋中的作用

目的检测miR-26a-5p和SLC26A4在耳聋小鼠和听力损失小鼠中的表达变化,以此研究miR-26a-5p调控SLC26A4挽救听力减退的作用。方法通过构建小鼠听力损失模型和小鼠耳聋模型,使用听性脑干反应测试检测小鼠右耳的听力来鉴定模型的构建是否成功。使用qPCR实验检测miR-26a-5p和SLC26A4在小鼠听力损失和耳聋后的相对表达量,通过TargetScan网站预测miR-26a-5p靶向结合SLC26A4的具体位点,对小鼠注射miR-26a-5p和SLC26A4的干扰和过表达载体,继续检测miR-26a-5p和SLC26A4的表达变化。结果在小鼠听力损失和耳聋后,miR-26a-5p表达显著降低(P<0.05),而SLC26A4表达明显升高(P<0.05),在小鼠注射antagomir后,miR-26a-5p明显下调(P=0.047),同时SLC26A4显著上调(P=0.014),同时小鼠听力阈值明显降低(P<0.05),而在注射miR-26a-5p agomir后结果恰恰相反。结论miR-26a-5p可以通过SLC26A4从而降低听力减退以此抑制耳聋的发生。

miR-26a-3p靶向调控Survivin表达对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨miR-26a-3p对缺氧/复氧(H/R)诱导的大鼠心肌细胞(H9c2)损伤的影响及其机制。方法取对数生长期H9c2心肌细胞进行缺氧(1%O 2)6 h,复氧不同时间(2、4、8、12 h)建立细胞H/R模型,另设常氧组,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞增殖活性;比色法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-26a-3p和生存素(Survivin)mRNA表达水平;Western blot检测细胞中Survivin蛋白表达水平。将miR-26a-3p inhibitor及其阴性对照inhibitor NC、Survivin基因siRNA干扰质粒(si-Survivin)及其阴性对照si-NC共转染至H9c2细胞中,随后进行H/R干预,CCK-8检测各组细胞增殖水平;比色法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及上清液中LDH水平;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;Western blot检测各组细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)和Survivin蛋白表达水平;双荧光素酶测定miR-26a-3p和Survivin基因的靶向关系。结果与常氧组细胞比较,随着复氧时间的延长,H9c2细胞增殖活性、Survivin mRNA和蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05),而LDH及miR-26a-3p表达水平逐渐升高(P<0.05)。下调miR-26a-3p表达可提高H/R暴露下H9c2细胞增殖活性、SOD活性、Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05),同时降低MDA含量、LDH释放量、凋亡率、Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平(P<0.05);而Survivin缺失可明显逆转miR-26a-3p inhibitor对H/R诱导下H9c2细胞的保护作用。双荧光素酶报告基因实验表明Survivin是miR-93-5p的靶基因。结论miR-26a-3p在H/R诱导的心肌细胞损伤中高表达,抑制miR-26a-3p表达可通过靶向上调Survivin表达抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡和氧化应激。

微小RNA-26a-5p对氧化型低密度脂蛋白处理的血管平滑肌细胞增殖、迁移和泡沫化的影响

目的探究微小RNA-26a-5p(miR-26a-5p)对动脉粥样硬化(AS)过程中血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移和泡沫化的影响。方法使用氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)处理VSMCs,模拟AS过程中的VSMCs细胞模型,向细胞中转染miR-26a-5p模拟物(miR-26a-5p mimic)及其阴性对照(NC mimic),将细胞分为对照组、ox-LDL组、ox-LDL+NC mimic组、ox-LDL+miR-26a-5p mimic组。通过qRT-PCR检测细胞miR-26a-5p表达水平,采用CCK-8和EDU染色检测细胞活力和增殖,通过划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,使用油红O染色观察细胞中脂滴聚集情况,采用免疫荧光实验检测细胞中α-SMA的表达。结果VSMCs中miR-26a-5p水平随着ox-LDL浓度的增加和作用时间的延长而降低。与对照组比较,ox-LDL组VSMCs细胞增殖、迁移、侵袭能力显著增强,脂滴聚集增多,α-SMA信号减弱,泡沫化程度增强。与oxLDL+NC mimic组比较,ox-LDL+miR-26a-5p mimic组细胞增殖、迁移、侵袭能力显著减弱,脂滴聚集减少,α-SMA信号增强,泡沫化程度减弱。结论过表达miR-26a-5p可以下调血管平滑肌细胞的增殖、迁移和泡沫化,miR-26a-5p可能成为AS治疗的新靶点。

miR-26a-5p通过靶向KCNJ2在β-淀粉样蛋白诱导的小胶质细胞炎症及氧化应激损伤

目的揭示miR-26a-5p对β-淀粉样蛋白诱导的炎症及氧化应激损伤的作用机制。方法选取2018-01—2020-01江苏省人民医院老年科实验室70例阿尔茨海默病(AD)患者外周血样本,同时采集80例健康体检者外周血作对照,通过qRT-PCR检测miR-26a-5p在AD患者体内的表达情况,并采用ELISA分析AD患者和健康体检者中炎性因子和活性氧(ROS)水平。通过Aβ_(1-42)(10μmol/L)刺激BV2小胶质细胞构建AD细胞模型,以等体积的DMSO刺激BV2细胞为对照组。采用ELISA检测正常BV2细胞和AD细胞模型的炎性和ROS水平,并通过qRT-PCR检测AD细胞模型中miR-26a-5p的表达趋势。转染miR-26a-5p调控质粒,采用CCK-8和ELISA分析检测miR-26a-5p对BV2细胞增殖、炎性因子表达和氧化应激的影响,生物信息分析和双荧光素酶报告基因预测miR-26a-5p的作用靶点并检测其对靶分子的影响,qRT-PCR、CCK-8和ELISA分析检测KCNJ2对BV2细胞增殖、炎性因子和氧化应激的影响,通过共同调控miR-26a-5ps和KCNJ2的表达,检测PI3K/AKT通路活性、细胞活力和ROS水平变化。结果miR-26a-5p在AD患者血清中的表达量低于健康患者,AD患者血清内炎性因子TNF-α和IL-18水平高于健康体检者,ROS水平也高于健康体检者。通过Aβ_(1-42)刺激构建的AD细胞模型中,TNF-α、IL-18和ROS水平高于正常BV2细胞,miR-26a-5p的表达量在AD细胞模型中低于正常BV2细胞。过表达miR-26a-5p促进AD细胞增殖,降低TNF-α、IL-18和ROS水平;干扰miR-26a-5p表达抑制AD细胞增殖,TNF-α、IL-18和ROS水平升高。生物信息学分析显示miR-26a-5p可靶向KCNJ2;KCNJ2在AD模型中高表达,过表达KCNJ2可抑制AD细胞增殖,提高TNF-α、IL-18和ROS的水平,干扰KCNJ2的表达可提高AD细胞增殖能力并降低TNF-α、IL-18和ROS水平;激活miR-26a-5p的表达可通过靶向降低KCNJ2的表达进而刺激PI3K/AKT通路活性来提高BV2细胞增殖减缓ROS释放水平。结论miR-26a-5p可通过靶向KCNJ2调节PI3K/AKT信号通路影响BV2细胞增殖、炎性反应和氧化应激。

miR-26a-5p对H_(2)O_(2)诱导的EA.hy926血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨miR-26a-5p对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的EA.hy926内皮细胞焦亡和血栓因子(TF)的影响及其机制。方法MTT法检测不同浓度H_(2)O_(2)(0,100,300,400,450,500,700μmol/L)刺激EA.hy926内皮细胞后的存活率。为了研究H_(2)O_(2)对EA.hy926内皮细胞的影响,分为control组(0μmol/L H_(2)O_(2))和450μmol/L H_(2)O_(2)组;为了研究miR-26a-5p对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导的EA.hy926内皮细胞损伤的影响及其与PI3K/Akt信号通路的关系,分为miR-26a-5p mimic+H_(2)O_(2)组,mimic NC+H_(2)O_(2)组,miR-26a-5p inhibitor+H_(2)O_(2)组,inhibitor NC+H_(2)O_(2)组。使用流式细胞术检测活性氧水平(ROS),Western blot检测焦亡关键物Caspase-1蛋白水平和血栓指标TF以及PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白水平,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测焦亡指标Caspase-1、IL-18、IL-1β和血栓指标TF的mRNA水平。为了检测miR-26a-5p转染效率,分别转染带Fam荧光的mimic NC,miR-26a-5p mimic,inhibitor NC,miR-26a-5p inhibitor后,荧光显微镜下观察Fam荧光分布情况,RT-qPCR检测转染后miR-26a-5p mRNA表达情况。结果MTT结果显示随着H_(2)O_(2)浓度升高,EA.hy926内皮细胞存活率呈下降趋势(P<0.05)。与control组相比,450μmol/L H_(2)O_(2)组ROS水平、Caspase-1、TF蛋白表达增加(P<0.05),Caspase-1、TF、IL-18、IL-1β的mRNA表达均增加(P<0.05)。荧光显微镜下,Fam荧光占视野的60%~80%。与转染mimic NC相比,转染miR-26a-5p mimic后,miR-26a-5p mRNA相对表达量增加(P<0.05);与转染inhibitor NC相比,转染miR-26a-5p inhibitor后,miR-26a-5p mRNA相对表达量减少(P<0.001)。与mimic NC+H_(2)O_(2)组相比,miR-26a-5p mimic+H_(2)O_(2)组ROS表达下降(P<0.05),TF、Caspase-1蛋白表达量降低(P<0.01),TF、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表达减少(P<0.001),而p-PI3K、p-Akt蛋白表达量增加(P<0.05);与inhibitor NC+H_(2)O_(2)组相比,miR-26a-5p inhibitor+H_(2)O_(2)组ROS表达升高(P<0.05),TF、Caspase-1蛋白表达增加(P<0.05),TF、Caspase-1、IL-18、IL-1β的mRNA表达增加(P<0.05),但p-PI3K、p-Akt蛋白表达量降低(P<0.05)。结论H_(2)O_(2)刺激EA.hy926内皮细胞发生氧化损伤,促进细胞焦亡和TF表达水平增加;而miR-26a-5p能改善H_(2)O_(2)诱导的EA.hy926细胞焦亡,降低TF表达水平,其机制可能与其激活PI3K/Akt通路有关。

老年白内障患者血清miR-26a和miR-26b表达水平及意义

目的探讨血清微小RNA(miR)-26a、miR-26b的表达水平与老年人白内障易感的相关性。方法选择2018年2月至2021年12月该院收治的137例老年白内障患者作为白内障组,另选择同期到该院进行健康体检的107例体检志愿者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测血清miR-26a、miR-26b的表达水平,双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清纤维化相关指标[转换生长因子-β_(2)(TGF-β_(2))、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原肽(PCⅢ)]水平。分析miR-26a、miR-26b的表达水平与白内障晶状体浑浊分级(LOCSⅢ分级)、血清纤维化指标相关性,收集临床资料,分析老年人白内障的易感因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-26a、miR-26b诊断白内障的价值。结果白内障组血清miR-26a(1.35±0.64 vs.3.07±0.92)、miR-26b表达水平(1.16±0.62 vs.3.21±0.83)低于对照组,差异有统计学意义(t=17.198、22.082,P<0.05),血清TGF-β_(2)、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ表达水平[(35.12±9.56)ng/L vs.(12.06±3.41)ng/L、(322.02±32.16)μg/L vs.(80.14±16.35)μg/L、(201.32±30.07)μg/L vs.(75.15±14.33)μg/L、(136.26±28.65)μg/L vs.(62.35±14.77)μg/L、(163.26±21.18)μg/L vs.(42.16±10.52)μg/L]高于对照组,差异有统计学意义(t=23.788、70.940、39.988、24.277、54.141,P<0.05)。miR-26a、miR-26b表达水平与LOCSⅢ分级(NC、C、P)评分、TGF-β_(2)、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ均呈负相关(r=-0.912~-0.514,P<0.05)。miR-26a(OR=0.436,95%CI:0.302~0.619)和miR-26b(OR=0.411,95%CI:0.295~0.603)是老年白内障易感的保护因素(P<0.05)。miR-26a、miR-26b诊断白内障的曲线下面积为0.689,0.775,联合miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ诊断白内障的曲线下面积为0.954,高于单独miR-26a、miR-26b、HA、Ⅳ-C、LN、PCⅢ(P<0.05)。结论老年人白内障患者血清miR-26a、miR-26b表达水平均降低,miR-26a、miR-26b低表达与血清纤维化指标升高和白内障晶状体浑浊程度有关,可能与老年人白内障发病有关,miR-26a、miR-26b可作为白内障辅助诊断的生物学指标。

子宫肌瘤患者血清CTGF、miR-26a手术前后变化及对术后复发的评估价值

目的探讨子宫肌瘤患者血清结缔组织生长因子(CTGF)、微小RNA(miR)-26a手术前后变化,并分析两者对术后复发的评估价值。方法选取2020年1月至2021年10月子宫肌瘤患者126例为研究对象,均采用手术治疗。入院时、出院前1 d检测血清CTGF、miR-26a水平,统计术后6个月复发率。分析血清CTGF、miR-26a与术后复发的关系,并采用受试者工作特征(ROC)曲线、决策曲线(DCA)、临床影响曲线分析血清CTGF、miR-26a在术后复发中的评估价值。结果出院前1 d患者血清CTGF水平低于入院时,miR-26a水平高于入院时(P<0.05);126例患者术后随访6个月,复发率为18.03%(22/122)。Logistic回归分析模型结果显示,调整混杂因素条件下,CTGF高表达患者术后复发风险是CTGF低表达的2.305倍,miR-26a高表达患者术后复发风险是miR-26a低表达的0.336倍;在模型2和模型3中,CTGF高表达患者术后复发风险分别是CTGF低表达的2.684、2.823倍,miR-26a高表达患者术后复发风险分别是miR-26a低表达的0.254、0.216倍。交互作用分析结果显示,CTGF与miR-26a对子宫肌瘤患者术后复发存在拮抗作用,两者联合评估子宫肌瘤术后复发对应AUC值大于单独评估效能(P<0.05)。经DCA比较不同模型,在阈值0.34~0.87范围内,CTGF、miR-26a联合评估子宫肌瘤术后复发的净受益率优于单独检测,被联合检测方案划分为高风险的人数与真阳性例数在阈值概率为0.45时,两者基本达到一致。结论血CTGF、miR-26a水平异常均会增加子宫肌瘤术后复发风险,且两者相加交互作用可显著增加复发风险,可为临床早期评估术后复发提供参考。

构建载免疫调节肽/miR-26a复合物微球缓释体系的体内成骨

背景:课题组前期研究证明,免疫调节肽DP7-C具有良好的免疫调节功能,并可高效转染递送miRNA进入细胞发挥调控功能。目的:制备并筛选不同尺寸的多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球,装载免疫调节肽DP7-C/miR-26a复合物,构建并优化缓释体系,验证其生物相容性及体内成骨能力。方法:(1)微球制备:以碳酸氢铵作为造孔剂,通过双乳化法制备多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球,通过调整转速制备3种不同尺寸的多孔微球,将微球分散于免疫调节肽DP7-C/miR-26a复合物溶液中,制备载药微球,通过微球物理性能表征、投入产出比、包封率及缓释性能,筛选出最佳载药多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球,用于后续实验。(2)体外细胞实验:将不同质量浓度的载药与未载药微球溶液分别与大鼠骨髓间充质干细胞共培养,采用CCK-8法检测微球的生物相容性。(3)动物体内实验:取9只成年SD大鼠,按照随机数字表法分为空白组、对照组、实验组,每组3只。3组均建立直径5 mm颅骨缺损模型,空白组不进行干预,对照组植入未载药微球,实验组植入载药微球,术后8周,分别进行主要脏器及颅骨缺损区病理形态、碱性磷酸酶免疫组化染色检测。结果与结论:(1)微球制备:通过相关检测结果得出,相较于转速500,1200 r/min,转速1000 r/min制备的载药微球具有均匀的尺寸、更高的产率及良好的缓释性能,可用于后续实验。(2)体外细胞实验:CCK-8检测结果显示,载药与未载药微球溶液对骨髓间充质干细胞的增殖无影响,无明显的细胞毒性。(3)动物体内实验:苏木精-伊红染色显示,各组大鼠内脏未发生与实验干预相关的病理学改变。苏木精-伊红及Masson染色显示,空白组缺损部位主要被纤维结缔组织增生占据,可见少量血管生成,未见明显新骨生成;对照组缺损部位可见少量新骨生成及不同程度纤维组织增生,可见新生毛细血管;实验组缺损区域有明显新骨生成及不同程度纤维组织增生,可见新生毛细血管。免疫组化染色显示,实验组缺损部位碱性磷酸酶表达高于对照组、空白组(P<0.05)。(4)结果显示,多孔聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球/免疫调节肽miR-26a复合物缓释体系具有良好的生物相容性及体内成骨性能,可促进大鼠颅骨临界骨缺损的再生修复。

circTLK1通过miR-26a-5p/YES1轴减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的探讨环状RNA凌乱样激酶1(circTLK1)在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中的作用和潜在机制。方法48只C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham组)、MIRI组、sh-NC组、sh-circTLK1组、sh-circTLK1+antagomir-NC组、sh-circTLK1+antagomir-miR-26a-5p组,每组8只;采用结扎左冠状动脉前降支(LAD)建立MIRI小鼠模型。超声心动图检测小鼠左心室射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)和收缩末期内径(LVESD)以评估心脏功能,ELISA检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平,苏木精-伊红(HE)染色检测心肌组织病理学变化,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测心肌组织中circTLK1、miR-26a-5p、YES1 mRNA和蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)验证circTLK1/YES1和miR-26a-5p之间的相互作用。结果与Sham组相比,MIRI组小鼠EF、FS、心肌组织miR-26a-5p水平显著降低,LVEDD、LVESD、血清LDH、CK-MB活性和cTnI水平、心肌细胞凋亡率、心肌组织circTLK1、YES1 mRNA和蛋白水平显著升高(均P<0.05),心肌细胞排列紊乱,细胞间质有炎性细胞浸润;circTLK1敲低可显著上调miR-26a-5p,抑制YES1表达,改善上述指标变化(均P<0.05),减轻心肌损伤;抑制miR-26a-5p可通过上调YES1,显著减弱circTLK1敲低对MIRI的保护作用。双荧光素酶报告基因实验和RIP证实了circTLK1和miR-26a-5p之间的直接相互作用,YES1是miR-26a-5p的靶标。结论敲低circTLK1可能通过调节miR-26a-5p/YES1轴在MIRI中发挥保护作用,circTLK1可能是MIRI的潜在治疗靶点。

miR-26a-5p基于PHD2/HIF-1α通路对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡作用的研究

目的通过缺氧诱导信号通路PHD2/HIF-1α探究miR-26a-5p对慢性心力衰竭(CHF)模型大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法将大鼠随机分为假手术组、CHF组、NC组和miR-26a-5p组,每组16只。CHF组、NC组与miR-26a-5p组建立大鼠CHF模型,假手术组除不进行结扎外其他操作相同。NC组和miR-26a-5p组分别尾静脉注射5nmol NC-agomiR和miR-26a-5p-agomiR,每3天1次,连续注射4周,假手术组和CHF组通过尾静脉注射给予等量生理盐水。对大鼠心肌组织进行masson染色,实时定量PCR法检测大鼠心肌组织miR-26a-5p表达水平,Tunel法检测大鼠心肌组织进行凋亡检水平,ELISA法检测心肌组织氧化损伤因子超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平,实时定量PCR法和Western blotting法检测心肌组织脯氨酸羟化酶2(PHD2)及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA及蛋白表达水平。结果与假手术组相比,CHF组和NC组出现心肌肥大并伴有大量纤维细胞出现,miR-26a-5p组大鼠心肌肥大有所缓解,纤维细胞减少;CHF组和NC组心肌组织miR-26a-5p表达水平有降低趋势,miR-26a-5p组表达显著上升(P<0.01);CHF组和NC组心肌细胞显著增加(P<0.01),miR-26a-5p组心肌细胞凋亡与CHF组和NC组相比显著降低,但仍高于假手术组(P<0.01);CHF组和NC组大鼠心肌组织SOD显著降低、MDA表达显著升高(P<0.01),与CHF组和NC组相比,miR-26a-5p组SOD显著升高、MDA表达显著降低(P<0.01);CHF组和NC组PHD2 mRNA和蛋白均有上调趋势,HIF-1α有下调趋势,与CHF组和NC组相比,miR-26a-5p组PHD2 mRNA及其蛋白表达下调,HIF-1α表达上调(P<0.05)。结论miR-26a-5p可以抑制CHF大鼠心肌细胞凋亡,提高SOD表达,降低MDA表达,降低氧化损伤,其机制与缺氧诱导信号通路PHD2/HIF-1α的调控相关。