川芎嗪调控miR⁃31⁃5p/Ednrb通路抑制人肺泡上皮细胞BEAS⁃2B凋亡和炎症反应

目的探讨川芎嗪(TMP)调控miR⁃31⁃5p/内皮素受体B(Ednrb)通路对人肺泡上皮细胞BEAS⁃2B凋亡和炎症反应的影响。方法采用1μg/mL脂多糖(LPS)处理BEAS⁃2B细胞构建炎症模型。将BEAS⁃2B细胞分为对照组、LPS组、LPS+川芎嗪5μmol/L组、LPS+川芎嗪20μmol/L组、LPS+川芎嗪80μmol/L组、LPS+miR⁃con组、LPS+miR⁃31⁃5p组、LPS+si⁃con组、LPS+si⁃Ednrb组、LPS+川芎嗪+pcDNA组、LPS+川芎嗪+pcDNA⁃Ednrb组。酶连免疫吸附实验(ELISA)试剂盒检测细胞培养液中白介素IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α(肿瘤坏死因子)的含量;RT⁃qPCR和Western blot检测miR⁃31⁃5p(炎性相关微小RNA)和Ednrb(内皮素受体B)表达。双荧光素酶报告实验和Western blot验证miR⁃31⁃5p对Ednrb的靶向调控关系。结果与对照组比较,LPS组BEAS⁃2B细胞Ednrb蛋白、凋亡率以及IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的水平增加,miR⁃31⁃5p表达降低(P<0.01);与LPS组比较,LPS+川芎嗪5μmol/L组、LPS+川芎嗪20μmol/L组、LPS+川芎嗪80μmol/L组BEAS⁃2B细胞Ednrb蛋白表达、凋亡率以及IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的水平降低,miR⁃31⁃5p表达升高(P<0.05,P<0.01)。miR⁃31⁃5p靶向负性调控Ednrb表达。与LPS+miR⁃con组比较,LPS+miR⁃31⁃5p组BEAS⁃2B细胞凋亡率以及IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的水平降低(P<0.01);与LPS+si⁃con组比较、LPS+si⁃Ednrb组BEAS⁃2B细胞凋亡率以及培养液中IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的水平降低(P<0.01);与LPS+川芎嗪+pcDNA组比较,LPS+川芎嗪+pcDNA⁃Ednrb组BEAS⁃2B细胞凋亡率、培养液中IL⁃1β、IL⁃6和TNF⁃α的浓度升高(P<0.05)。结论川芎嗪通过上调miR⁃31⁃5p/Ednrb通路抑制人肺泡上皮细胞BEAS⁃2B凋亡和炎症反应。

circLRP6调节miR-31-5p/HMGA1轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的分析circLRP6调节miR-31-5p/高迁移率族蛋白A1(HMGA1)轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组,对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内,实时定量PCR测定细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1 mRNA水平,试剂盒测定细胞上清液白细胞介素-6(IL-6)水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙二醛(MDA)含量;流式细胞仪观察细胞凋亡;Western blotting测定细胞HMGA1、Bax、Bcl-2蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验分析miR-31-5p与circLRP6、HMGA1的靶向关系。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞circLRP6水平升高,细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+si-circLRP6组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。miR-31-5p与circLRP6、HMGA1均具有靶向关系。结论沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p,抑制HMGA1表达,对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。

lncRNA TUG1靶向调节miR-31-5p对急性胰腺炎小鼠炎症反应的影响

目的:探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(lncRNA TUG1)在急性胰腺炎(AP)中的作用机制。方法:体外培养小鼠胰腺腺泡细胞系(MPC-83),用脂多糖(LPS,10μg/ml)和雨蛙素(Caerulein,100 nmol/L)处理3 h,建立AP模型。实验分为对照组(control组)、AP组、AP+sh-NC组、AP+sh-TUG1组、AP+sh-TUG1+inhibitor-NC组、AP+sh-TUG1+miR-31-5p inhibitor组。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA检测细胞上清液中IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA TUG1和miR-31-5p之间的靶向关系。构建AP小鼠模型,给予相应的干预后,qRT-PCR检测胰腺组织中lncRNA TUG1和miR-31-5p表达水平;试剂盒检测血清中炎症因子IL-1β、TNF-α含量和淀粉酶(AMY)和脂肪酶(Lipase)活性;HE染色观察胰腺组织病理学变化;TUNEL检测胰腺组织中细胞凋亡。结果:在Caerulein和LPS共同处理的MPC-83细胞中lncRNA TUG1水平、细胞凋亡率、IL-1β和TNF-α水平升高,miR-31-5p水平、细胞活力降低(均P<0.05);敲低lncRNA TUG1可上调miR-31-5p,增加细胞活力,降低IL-1β和TNF-α水平,抑制细胞凋亡(均P<0.05);下调miR-31-5p表达可减弱敲低lncRNA TUG1对细胞炎症反应的抑制作用。miR-31-5p是lncRNA TUG1的直接靶标。在体内敲低lncRNA TUG1表达可上调AP小鼠胰腺组织中miR-31-5p表达,降低IL-1β、TNF-α水平,减少细胞凋亡,改善胰腺组织损伤。结论:敲低lncRNA TUG1可能通过上调miR-31-5p表达水平,抑制炎症反应,改善AP。

鼻咽癌患者外周血中循环miR-31-5p表达及临床意义

目的探讨miR-31-5p在鼻咽癌患者外周血中的表达及临床意义。方法应用荧光定量PCR检测55例鼻咽癌患者和55例健康人外周血miR-31-5p相对表达量,分析两者之间的表达差异,探讨其与鼻咽癌患者临床病理特征以及放疗的关系。结果 miR-31-5p在鼻咽癌患者外周血中的表达水平明显低于健康人(P <0.01);鼻咽癌患者外周血miR-31-5p的表达水平与肿瘤T分期、局部有无淋巴转移、临床分期相关,但与性别、年龄及是否发生远处转移不相关。同时,放疗抵抗组miR-31-5p表达水平较放疗敏感组下降(P <0.01)。结论 miR-31-5p的低表达与鼻咽癌的发展及放疗有关,它可能成为鼻咽癌新的肿瘤标志物和治疗靶点。

miR-31-5p通过调控TNS1抑制乳腺癌细胞生物学行为及放疗抵抗的分子机制

目的:探讨miR-31-5p/张力蛋白1基因(tension protein 1,TNS1)分子轴对乳腺癌细胞生物学行为的影响及其放疗抵抗的分子机制。方法:收集2017年7月至2017年12月南阳市中心医院肿瘤放疗科收治的、经手术切除的21例乳腺癌患者癌及癌旁组织标本,以及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231和SKBR-3,采用qPCR法检测癌组织和癌细胞系中miR-31-5p的表达水平。通过6 MV-X射线照射MCF-7细胞,构建放疗抵抗细胞株MCF-7R。随后,采用克隆形成实验、Transwell小室法和Annexin V/PI染色流式细胞术检测过表达/敲降miR-31-5p对MCF-7和MCF-7R细胞放疗敏感性的影响;用双荧光素酶报告基因验证miR-31-5p与TNS1的靶向关系。结果:乳腺癌组织、细胞系和MCF-7R细胞中miR-31-5p表达水平显著低于癌旁组织、人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和MCF-7细胞(均P<0.01)。过表达miR-31-5p显著抑制MCF-7R细胞的侵袭并促进细胞凋亡(均P<0.01),沉默miR-31-5p在MCF-7细胞中结果相反。双荧光素酶报告基因法证实TNS1是miR-31-5p靶基因。过表达miR-31-5p通过靶向下调TNS1显著抑制MCF-7R细胞侵袭能力并促进细胞凋亡(均P<0.01),沉默miR-31-5p通过上调TNS1显著促进MCF-7细胞侵袭和抑制细胞凋亡(均P<0.01),从而上调MCF-7R对放射治疗的敏感性。结论:miR-31-5p/TNS1分子轴与乳腺癌放疗抵抗存在调控关系,且过表达miR-31-5p可逆转MCF-7R细胞对放疗抵抗作用。

miR-31-5p通过靶向抑制胰岛素降解酶发挥促进动脉粥样硬化作用

目的探讨miR-31-5p是否通过靶向抑制胰岛素降解酶(IDE)发挥促进动脉粥样硬化作用。方法应用生物信息学和双荧光素酶技术筛选并验证miR-31-5p与IDE 3’UTR靶向结合情况。miR-31-5p mimic和inhibitor转染THP-1巨噬细胞及THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞;采用miR-31-5p agomir处理高脂饮食的ApoE^(-/-)小鼠;Western blot检测IDE蛋白表达;ELISA检测ApoE^(-/-)小鼠血浆脂质水平;油红O染色检测小鼠肝脏脂质蓄积及主动脉粥样硬化斑块病变。结果 miR-31-5p靶向结合IDE 3’UTR并引起转录抑制;miR-31-5p可下调THP-1细胞、小鼠肝脏和主动脉组织中IDE蛋白表达(P<0.05),同时引起泡沫细胞和小鼠血清中脂质含量增加(P<0.05),小鼠主动脉窦和主动脉树病变面积明显增加(P<0.05)。结论 miR-31-5p可通过靶向抑制IDE发挥促进动脉粥样硬化作用。

miR-31-5p在急性髓系白血病中的表达下调

目的探讨miR-31-5p在急性髓系白血病中的表达变化,及其对白血病细胞功能的影响。方法用real-time PCR方法检测miR-31-5p在白血病患者及正常人外周血单个核细胞中的表达;用miR-31-5p模拟物转染人急性髓系白血病细胞系THP-1细胞,通过CCK-8试验和流式细胞术检测细胞增殖和单核系分化;用荧光报告基因和Western blot方法检测靶基因HuR的表达;用RNAi方法干扰内源性HuR的表达,并检测THP-1细胞的增殖和单核系分化。结果 miR-31-5p在急性髓系白血病患者外周血单个核细胞中的表达显著低于正常对照(P<0.05);在THP-1细胞中过表达miR-31-5p可以抑制细胞增殖,并促进细胞向单核方向分化成熟;HuR为miR-31-5p的靶基因;干扰THP-1内源的HuR表达也会对THP-1的增殖和单核分化产生调控作用。结论 miR-31-5p在急性髓系白血病发生中可通过靶向抑制HuR发挥抑癌基因功能。

miR-31-5p对胰岛β细胞增殖及2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响

目的研究miR-31-5p对胰岛β细胞系MIN6细胞增殖的影响,以及对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的作用。方法培养胰岛MIN6细胞,将MIN6细胞分为miR-31-5p mimic组、miR-31-5p mimic NC组、miR-31-5p inhibitor组、miR-31-5p inhibitor NC组。采用脂质体介导法转染MIN6细胞,转染48h后RT-PCR检测细胞miR-31-5p表达水平,CCK-8法检测细胞增殖情况,酶联免疫吸附法测定检测细胞分泌胰岛素的水平。C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、造模组,正常对照组小鼠基础饲料喂养并腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,造模组小鼠高脂高糖饲料喂养联合腹腔注射链脲佐菌素30mg/kg构建2型糖尿病小鼠模型。将建模成功的2型糖尿病小鼠随机分为miR-31-5p NC组(尾静脉注射50mg/kg miR-31-5p NC)与miR-31-5p inhibitor组(尾静脉注射50mg/kg miR-31-5p inhibitor),21天后HE染色观察小鼠胰腺组织病理学形态,免疫组织化学染色观察胰岛素与裂解caspase-3的阳性表达情况。结果转染miR-31-5p mimic和miR-31-5p inhibitor分别增加或抑制了MIN6细胞中miR-31-5p的表达水平;转染miR-31-5p mimic的MIN6细胞增殖能力下降而转染miR-31-5p inhibitor的MIN6细胞增殖能力提高;20mmol/L葡萄糖的KRBH溶液刺激下转染miR-31-5p mimic的MIN6细胞胰岛素的分泌受到抑制,而转染miR-31-5p inhibitor的细胞胰岛素分泌量增加;成功构建2型糖尿病小鼠模型,静脉注射50mg/kg miR-31-5p inhibitor NC的2型糖尿病小鼠出现胰岛萎缩、胰岛细胞细胞核固缩且胞质空泡增多等现象,裂解caspase-3的阳性表达明显,静脉注射50mg/kg miR-31-5p inhibitor的2型糖尿病小鼠胰腺组织病理变化明显改善,裂解caspase-3的阳性表达也减少。结论抑制miR-31-5p的表达可以促进MIN6细胞系的增殖和在高糖刺激下胰岛素的分泌,并且改善2型糖尿病小鼠胰腺病变的现象。

miR-30a-5p靶向调控TRIM31表达对结直肠癌细胞5-氟尿嘧啶耐药的逆转作用及其机制

目的:探讨miR-30a-5p靶向三结构域蛋白31(TRIM31)基因对结直肠癌(CRC)细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药的影响,并阐明其作用机制。方法:收集27例5-FU化疗敏感(5-FU/S组)CRC患者和23例5-FU化疗耐药(5-FU/R组)CRC癌患者的CRC组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测癌组织中miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平,Pearson相关分析法分析miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达的相关性。体外培养人CRC 5-FU耐药细胞HT-29/5-FU细胞及其亲本HT-29细胞,MTT法检测2种细胞增殖活性并计算半数抑制浓度(IC50)和耐药指数(RI),RT-qPCR法检测2种细胞中miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平,Western blotting法检测2种细胞中TRIM31蛋白表达水平。将HT-29/5-FU细胞分为空白对照组、mimics NC组(转染miR-30a-5p阴性对照mimics NC)、miR-30a-5p mimics组(转染miR-30a-5p mimics)、miR-30a-5p mimics+vector组(转染miR-30a-5p mimics和阴性对照空载体)和miR-30a-5p mimics+TRIM31组(转染miR-30a-5p mimics和TRIM31过表达载体)。RT-qPCR法检测各组HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p和RTIM31 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组HT-29/5-FU细胞中TRIM31蛋白表达水平,MTT法检测各组HT-29/5-FU细胞增殖活性,流式细胞术检测各组HT-29/5-FU细胞凋亡率,双荧光素酶报告基因系统验证miR-30a-5p与TRIM31的靶向关系。结果:与5-FU/S组比较,5-FU/R组患者CRC组织中miR-30a-5p表达水平降低(P<0.01),TRIM31 mRNA表达水平升高(P<0.01),miR-30a-5p和TRIM31 mRNA表达水平呈负相关关系(R2=0.885,P<0.01)。与HT-29细胞比较,HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p表达水平降低(P<0.01),TRIM31 mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.01)。HT-29/5-FU细胞和HT-29细胞的IC50值分别为(104.41±0.22)和(9.82±0.31)mg·L^(-1),RI值为12.42。与空白对照组和mimics NC组比较,miR-30a-5p mimics组HT-29/5-FU细胞中miR-30a-5p表达水平升高(P<0.01),TRIM31蛋白表达水平降低(P<0.01),HT-29/5-FU细胞增殖活性明显降低(P<0.01),HT-29/5-FU细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。与miR-30a-5p mimics组比较,miR-30a-5p mimics+TRIM31组HT-29/5-FU细胞中TRIM31蛋白表达水平升高(P<0.01),HT-29/5-FU细胞增殖活性明显升高(P<0.01),HT-29/5-FU细胞凋亡率明显降低(P<0.01)。双荧光素酶报告基因系统证实TRIM31是miR-30a-5p的靶基因。结论:miR-30a-5p通过靶向TRIM31基因表达增强CRC耐药细胞对5-FU的敏感性。

黄芪白术汤下调miR-31-5p/STAT3环路抑制结肠炎相关性结肠癌进程

目的探讨miR-31-5p/STAT3在结肠炎相关性结肠癌(colitis-associated cancer,CAC)发病机制中的作用,以及黄芪白术汤的干预机制。方法采用氧化偶氮甲烷(AOM)/葡聚糖硫酸钠(DSS)方法建立C57BL/6小鼠CAC模型,并检测对照组和CAC模型小鼠中microRNA的差异表达。qPCR验证筛选差异microRNA;Western blot检测STAT3、p-STAT3、IL-6Rα的表达水平。结果一次性腹腔注射AOM,结合3%DSS自由饮用3个循环造模,8周后模型小鼠结肠黏膜出现中、重度异型增生,并伴随大量炎细胞浸润,经检测,CAC小鼠结肠组织中miR-31-5p及STAT3、p-STAT3蛋白的表达明显升高;黄芪白术汤干预后,miR-31-5p及STAT3、p-STAT3蛋白的表达下调。体外研究表明,RAW264.7细胞转染miR-31-5p precursor后,STAT3蛋白明显增高;促炎因子IL-6、TNF-α刺激RAW264.7 24 h后,miR-31-5p水平也明显升高,提示炎症因子可引起miR-31-5p/STAT3的正相关上调。同时,白术内酯Ⅱ+黄芪甲苷混合物可明显下调IL-6刺激引起的miR-31-5p、STAT3、IL-6Rα增高。结论miR-31-5p/STAT3在上皮细胞与免疫细胞之间可能形成一个正反馈的环路,在CAC病理微环境中发挥持续放大炎症效应,最终导致结肠上皮的异型增生,甚至肿瘤发生。

miR-31-5p对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响

【目的】长江三角洲白山羊是我国及世界上唯一能生产优质笔料毛的山羊品种,课题组前期转录组测序结果表明:在优质笔料毛与非优质笔料毛个体皮肤组织中,MAP3K1的表达水平存在显著差异。探究优质笔料毛性状形成过程中与MAP3K1相互作用的关键miRNAs及其对山羊毛囊干细胞增殖和凋亡的影响,为长江三角洲白山羊的分子选育提供理论依据。【方法】通过生物信息学网站(StrBase、miRDB、TargetScan、miRWalk、DAVID、KEGG、RNAhybrid)预测、筛选与MAP3K1具有靶向关系的miRNAs,利用在线网站Venny 2.1绘制韦恩图。通过构建miR-31-5p过表达载体,MAP3K1、RASA1野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,验证miR-31-5p与MAP3K1、RASA1之间的靶向关系,并结合qPCR和Western Blot技术检测过表达后miR-31-5p对MAP3K1、RASA1 mRNA和蛋白表达水平的影响。为探究过表达miR-31-5p后对细胞增殖、凋亡的影响,分析了转染miR-31-5p后毛囊干细胞内增殖相关基因(PCNA,CDK1,CCND2)、抗凋亡基因(Bcl-2)和促凋亡基因(Bax)的mRNA和蛋白表达水平;同时结合CCK-8,EdU,流式细胞术等方法验证过表达miR-31-5p对毛囊干细胞活力、细胞周期以及凋亡的影响。【结果】通过数据库共同预测到3个可能与MAP3K1相作用的miRNAs,结合现有miRNAs在皮肤和毛囊细胞上研究,最终选用评分相对较高的miR-31-5p作为研究对象。转染miR-31-5p后检测细胞内的miR-31-5p的相对表达量,发现miR-31-5p表达含量极显著高于对照组及空白载体组(P<0.01);双荧光素酶报告基因结果显示过表达miR-31-5p可促使MAP3K1活性升高(P<0.01),结合TargetScan、KEGG数据库预测发现miR-31-5p可靶向MAPK信号通路中位于MAP3K1的上游抑制因子RASA1。过表达miR-31-5p抑制了RASA1的活性(P<0.01);同时,qPCR及Western Blot表明:过表达miR-31-5p后显著抑制RASA1的mRNA和蛋白表达,促进了MAP3K1的表达(P<0.01)。CCK-8结果显示过表达miR-31-5p后提高了细胞增殖能力(P<0.01),通过EdU染色发现过表达miR-31-5p后,EdU阳性细胞率显著高于空白组(P<0.01),促进细胞增殖;细胞周期数据说明过表达miR-31-5p后,G1/G0期细胞所占比例为52.23%,显著低于Control组(56.81%,P<0.01),减缓了G1/G0期细胞阻滞,而S期和G2/M期差异不显著,但仍有上升趋势。通过细胞凋亡试验发现过表达miR-31-5p组活细胞率为93.8%,总凋亡率为4.9%,而空白组活细胞率仅为90.1%,总凋亡率为8.41%,说明在过表达miR-31-5p后细胞凋亡率明显下降(P<0.05);最后检测miR-31-5p对增殖和凋亡相关基因的影响,发现过表达miR-31-5p后显著提高了增殖相关基因、抗凋亡基因(Bcl-2)的mRNA和蛋白表达水平(P<0.05),降低了促凋亡基因(Bax)的mRNA和蛋白表达水平。最终根据所研究出的结果绘制miR-31-5p在毛囊干细胞中的分子作用机制图。【结论】miR-31-5p通过靶向抑制MAPK信号通路中的RASA1,上调MAP3K1表达水平,进而促进毛囊干细胞增殖并抑制其凋亡,为进一步阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛性状的分子形成机制提供理论依据。

土木香提取物通过下调miR-31-5p表达调控宫颈癌细胞增殖和凋亡的机制研究

目的:研究土木香提取物(EEIHL)对宫颈癌细胞增殖和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法:用0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、6 μg/ml和8 μg/ml的土木香提取物(EEIHL)处理宫颈癌HeLa细胞48 h,MTT法和流式细胞术检测HeLa细胞增殖抑制率和细胞凋亡率,qRT-PCR检测细胞中miR-31-5p的表达,Western blot检测CyclinD1和Cleave-caspase-3蛋白表达水平。结果:EEIHL可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并促进细胞凋亡,下调细胞中miR-31-5p和CyclinD1的表达,上调Cleave-caspase-3的表达,呈剂量依赖趋势,在6 μg/ml和8 μg/ml时达到最高增殖抑制率;抑制miR-31-5p表达可抑制HeLa增殖并促进细胞凋亡;过表达miR-31-5p可逆转EEIHL对HeLa细胞增殖和凋亡的作用。结论:土木香提取物EEIHL可能通过下调miR-31-5p抑制HeLa细胞增殖和促进细胞凋亡。EEIHL对宫颈癌具有潜在抑制作用。

miR-31-5p靶向Notch1调节骨关节炎软骨细胞增殖和凋亡的作用

目的明确miR-31-5p在骨关节炎软骨细胞中的作用。方法采用Hulth法进行大鼠骨关节炎造模,并分离原代软骨细胞,白细胞介素(interleukin,IL)-1β诱导体外模型,检测miR-31-5p的表达变化;进一步通过在线数据库预测miR-31-5p靶点并验证,细胞增殖检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和流式细胞术检测miR-31-5p对原代软骨细胞增殖和凋亡的影响。结果骨关节炎大鼠中miR-31-5p表达下调;miR-31-5p mimics促进软骨细胞增殖,而miR-31-5p inhibitor诱导软骨细胞凋亡增加;此外,miR-31-5p inhibitor促进IL-6和基质金属蛋白酶13(matrix metalloprotein,MMP-13)表达增加;荧光素酶报告基因实验证实Notch1是miR-31-5p的直接靶点,Notch1过表达质粒会部分抵消miR-31-5p mimics对软骨细胞的增殖保护作用。结论miR-31-5p下调表达介导骨关节炎软骨细胞增殖受限和凋亡发生,可能参与骨关节炎的发病。

miR-31-5p过表达对兔自身免疫性干眼外周血Th17细胞的免疫调控作用

目的探讨慢病毒介导微小RNA(miR)-31-5p过表达对兔自身免疫性干眼模型外周血辅助性T细胞17(Th17)的免疫调控作用。方法构建miR-31-5p重组慢病毒载体。包装miR-31-5p过表达及其对照慢病毒,进行浓缩和滴度测定。建立兔自身免疫性干眼模型,并分离模型兔外周血单个核细胞(PBMC),分别感染miR-31-5p及阴性对照慢病毒颗粒作为miR-31-5p过表达组和对照组,采用实时荧光定量PCR法检测miR-31-5p的表达水平。将2个组PBMC与经γ射线照射后的泪腺上皮细胞共培养,采用实时荧光定量PCR法检测2个组PBMC中Th17细胞特异性转录因子维甲酸相关孤儿核受体C(RORC)、标志性细胞因子白细胞介素-17(IL-17)及Th17细胞极化相关细胞因子IL-1β、IL-6和IL-23的mRNA表达水平;采用Western blot法检测PBMC中IL-17的蛋白表达水平。结果通过测序验证,成功构建miR-31-5p重组慢病毒载体。包装并浓缩miR-31-5p过表达和对照慢病毒颗粒,滴度测定结果分别为3.82×107 TU/ml和3.50×107 TU/ml,满足后续实验需求。实时荧光定量PCR结果显示,miR-31-5p过表达组miR-31-5p相对表达量较对照组显著升高,差异有统计学意义(t=-9.696,P<0.001)。在兔泪腺上皮细胞与PBMC共培养体系中,miR-31-5p过表达组PBMC中的RORC、IL-17 mRNA相对表达量分别为0.33±0.03和0.28±0.09,明显低于对照组的1.00±0.00和1.00±0.00,差异均有统计学意义(t=46.256、13.810,均P<0.05)。Western blot检测结果显示,miR-31-5p过表达组PBMC中IL-17蛋白相对表达量较对照组明显降低,差异有统计学意义(t=4.977,P=0.008)。实时荧光定量PCR结果显示,miR-31-5p过表达组PBMC中IL-6、IL-23和IL-1βmRNA相对表达量较对照组显著下降,差异均有统计学意义(t=220.076、6.641、13.271,均P<0.05)。结论miR-31-5p过表达可能通过下调免疫微环境中IL-6、IL-23、IL-1β等细胞因子的表达负向调控Th17细胞免疫反应。

沉默miR-31-5p抑制口腔鳞状细胞癌的增殖及凋亡

目的探究miR-31-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖和凋亡的作用及与线粒体活性之间的关系。方法RT-qPCR检测OSCC组织和细胞中miR-31-5p的表达。利用Lipofectamine 2000将miR-NC、miR-31-5p mimic、miR-31-5p inhibitor分别转染至SCC-25和CAL-27细胞内,将细胞分为Control组、miR-NC组、miR-31-5p inhibitor组和miR-31-5p mimic组。克隆形成实验检测细胞增殖,微管形成实验检测微管数目,流式细胞术检测细胞凋亡,JC-1染色评估线粒体活性,ELISA检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;蛋白印迹法检测Ki67、survivin、VEGF、Bcl-2、Bax和c-Myc蛋白表达水平。结果RT-qPCR检测结果显示,miR-31-5p在OSCC组织和细胞中均高表达(P<0.05);与Control组比较,沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞克隆形成和微管形成数目(P<0.05),并提高细胞凋亡率(P<0.05);蛋白印迹实验结果表明,沉默miR-31-5p可降低Ki67、survivin、VEGF和c-Myc蛋白表达水平及Bcl-2/Bax比率(P<0.05)。沉默miR-31-5p可显著降低SCC-25和CAL-27细胞中JC-1线粒体活性(P<0.05),抑制SOD活性并增加MDA含量(P<0.05)。结论沉默miR-31-5p通过破坏线粒体活性抑制OSCC细胞的增殖并诱导其凋亡。

鸡gga-miR-31-5p启动子真核表达载体的构建及其转录因子结合位点预测

为确定鸡gga-miR-31-5p启动子基本活性区域,并分析调控其转录的重要转录因子,初步探究影响鸡gga-miR-31-5p的表达调控机制,采用PCR法扩增鸡gga-miR-31-5p启动子,插入到pEGFP-N1载体,构建重组载体。利用菌液PCR及测序鉴定阳性重组质粒。将重组载体转染DF-1细胞系,观察其启动活性。利用在线预测网站预测gga-miR-31-5p启动子区域的转录因子结合位点。结果显示,成功克隆出gga-miR-31-5p启动子片段,并成功构建其pEGFP重组载体。体外转染结果表明,该区域具有启动活性,并发现鸡gga-miR-31-5p启动子区域存在RARα、ER、c-Jun、GR等重要转录因子结合位点。研究初步确定了鸡gga-miR-31-5p启动子区域,同时发现该区域存在重要转录因子结合位点,该结果为后续探讨进一步研究gga-miR-31-5p启动子的生物学功能奠定基础。

miR-876-5p通过靶向FBXO31促进卵巢癌细胞增殖和侵袭的机制

目的探究微小RNA(microRNA,miR)-876-5p通过靶向F-box蛋白31(FBXO31)促进卵巢癌细胞增殖和侵袭的机制。方法对TCGA数据库中,miR-876-5p和FBXO31在卵巢癌患者中的表达特点和与预后的关系进行分析。通过双荧光素酶报告验证miR-876-5p靶向FBXO31。将卵巢癌细胞系SKOV-3分为4组:对照组、mimic组、mimic+FBXO31组和FBXO31组。通过质粒转染技术过表达miR-876-5p和(或)FBXO31。qPCR和Western blot检测RNA或蛋白的表达水平。分别通过CCK-8法、Transwell实验检测各组的细胞生长和侵袭能力。通过荷瘤裸鼠实验在体内验证miR-876-5p和FBXO31对肿瘤生长的影响。结果在TCGA数据库中,miR-876-5p高表达的患者的生存率显著低于miR-876-5p低表达患者(P<0.05)。卵巢癌患者FBXO31水平显著降低,卵巢癌分期的越高FBXO31水平越低,并且FBXO31高表达卵巢癌患者的生存率显著高于FBXO31低表达(P<0.05)。miR-876-5p直接靶向FBXO31。过表达miR-876-5p抑制FBXO31 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05),过表达FBXO31显著逆转miR-876-5p对FBXO31的抑制作用(P<0.05)。Mimic组的细胞活力和细胞迁移能力显著高于对照组(P<0.05),FBXO31组的细胞活力和细胞迁移能力显著低于对照组(P<0.05),并且mimic+FBXO31组的细胞活力和细胞迁移能力显著低于mimic组(P<0.05)。miR-876-5p组荷瘤裸鼠的肿瘤体积和质量均显著高于对照组(P<0.05),miR-876-5p+FBXO31组肿瘤体积和质量显著低于miR-876-5p组(P<0.05)。结论miR-876-5p具有促进卵巢癌进展的作用,而FBXO31可能抑制卵巢癌进展。miR-876-5p直接靶向FBXO31,并且miR-876-5p过表达可通过抑制FBXO31促进卵巢癌细胞生长、侵袭,起到抑制卵巢癌生长的作用。

血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p水平与股骨颈骨折患者骨折延迟愈合的关系及其预测价值分析

目的:探讨血清微小核糖核酸(miR)-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p水平与股骨颈骨折患者术后骨折延迟愈合的关系及对术后骨折延迟愈合的预测价值。方法:选择2020年1月~2022年10月在徐州医科大学附属医院行内固定治疗的292例新鲜股骨颈骨折患者为研究对象。于术后4周复查时,检测患者血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p水平;并根据其骨折愈合情况分为延迟组(n=36)和愈合组(n=256)。采用多因素Logistic回归分析股骨颈骨折患者术后骨折延迟愈合的影响因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p对股骨颈骨折患者术后骨折延迟愈合的预测价值。结果:术后4个月复查时,骨折延迟愈合发生率为12.33%。两组年龄、吸烟史、合并糖尿病组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。愈合组血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p水平均高于延迟组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,年龄≥60岁、合并糖尿病、血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p水平降低是股骨颈骨折患者术后骨折延迟愈合的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线结果显示,三者联合检测的曲线下面积(AUC)(0.95CI)为0.841(0.738~0.936),高于各指标单独应用时的AUC,三者联合检测的灵敏度和特异度亦高于单一指标检测。结论:血清miR-203a、miR-31-5p、miR-19b-1-5p在股骨颈骨折术后骨折延迟愈合患者中呈低表达,是骨折延迟愈合的独立危险因素,三者联合检测对股骨颈骨折患者骨折延迟愈合具有较高的预测价值。

LncRNA ZNF667-AS1靶向 miR-31-5p对食管癌细胞增殖、迁移和凋亡的机制研究

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)ZNF667-AS1通过靶向miR-31-5p对食管癌细胞增殖和迁移的影响及潜在的机制。方法采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测ZNF667-AS1在食管癌细胞Eca109、EC1、TE1和正常食管上皮细胞Het-1A的表达水平,并选择表达差异最大的细胞株进行后续实验。采用脂质体转染技术将pcDNA3.1-ZNF667-AS1过表达重组载体质粒转染至人食管癌Eca109细胞,实验分为对照组(未行转染的Eca109细胞)、pcDNA3.1组(转染空载体质粒的Eca109细胞)和ZNF667-AS1组(转染pcDNA3.1-ZNF667-AS1质粒的Eca109细胞),qPCR技术检测pcDNA3.1-ZNF667-AS1的转染效果,噻唑蓝比色法(MTT)和平板克隆实验检测过表达ZNF667-AS1对Eca109细胞增殖能力的影响,Transwell实验检测Eca109细胞迁移能力,流式细胞术检测Eca109细胞凋亡率,Western blot检测Eca109细胞中G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1)、细胞周期依赖性激酶抑制因子(p21)、上皮标志物上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、间充质标志物神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关蛋白X(Bax)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的表达水平,生物信息学预测ZNF667-AS1与miR-31-5p的互补配对关系,荧光素酶报告实验和qPCR技术验证ZNF667-AS1和miR-31-5p的靶向调控关系。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果与Het-1A细胞相比,食管癌Eca109、EC1和TE1细胞中ZNF667-AS1的表达水平均降低(1.00±0.08比0.29±0.04,0.36±0.05,0.33±0.06),差异有统计学意义(P<0.001)。与ZNF667-AS1组相比,对照组及pcDNA3.1组中ZNF667-AS1的表达水平(3.14±0.32比1.00±0.10,0.94±0.09),细胞活力[(63.42±3.75)%比100.00±4.85、(97.69±4.57)%],细胞克隆形成数[(34.26±3.52)个比(95.64±10.22)个、(92.80±10.04、个],Cyclin D1表达水平(0.26±0.05比0.75±0.08、0.71±0.07),迁移细胞数[(20.24±2.35)个比(63.55±6.04)个、(60.02±6.12)个],细胞中E-cadherin表达水平(0.19±0.02比0.48±0.05,0.49±0.05)和miR-31-5p的表达水平(0.30±0.03比1.00±0.10,0.95±0.09)均升高,p21表达水平(0.79±0.09比0.24±0.05,0.26±0.06),细胞凋亡率[(29.17±1.26)%比(3.41±0.73)%,(3.72±0.78)%],细胞中N-cadherin(0.87±0.09比0.42±0.04,0.40±0.04)、Vimentin表达水平(0.82±0.08比0.44±0.04,0.44±0.04)均降低,差异有统计学意义(P均<0.001),与对照组比较,pcDNA3.1组ZNF667-AS1的表达水平,细胞活力,细胞克隆形成数,Cyclin D1和p21表达水平,迁移细胞数,细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和miR-31-5p表达水平,细胞凋亡率差异无统计学意义(P均>0.05)。生物信息学预测发现ZNF667-AS1和miR-31-5p存在靶向结合位点;荧光素酶报告实验结果显示,与空载转染组比较,miR-31-5p组ZNF667-AS1-Wt相对荧光素酶活性(1.00±0.10比0.19±0.02)降低(P<0.05),ZNF667-AS1-Mut相对荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论过表达ZNF667-AS1能抑制食管癌Eca109细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡,其机制可能与ZNF667-AS1靶向调控miR-31-5p有关。

miR-31-5p通过VPS53介导的自噬对结直肠癌细胞增殖的影响

目的探讨miR-31-5p通过VPS53介导的自噬对结直肠癌细胞增殖的影响。方法选择人正常结直肠黏膜细胞(FHC)及结直肠癌细胞株HT29、HCT116、SW480、LoVo进行研究。采用实时荧光定量PCR实验检测miR-31-5p在前述各种细胞中的表达,miR-31-5p对VPS53 RNA表达的影响,miR-31-5p、VPS53对Beclin1 RNA表达的影响。采用CCK-8法检测细胞活力。利用数据库Targetscan筛选与miR-31-5p靶向结合的靶基因,并通过双荧光素酶报告实验进行验证。利用数据库GEPIA分析VPS53和Beclin1表达的相关性。采用透射电子显微镜实验探究VPS53对细胞自噬的影响。采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)分析VPS53对Beclin1蛋白表达的影响。结果与FHC细胞相比,HCT116、LoVo、HT29、SW480细胞的miR-31-5p表达水平均升高(均P<0.05)。过表达miR-31-5p可促进LoVo细胞增殖(P<0.05)。miR-31-5p与VPS53靶向结合。过表达miR-31-5p可下调VPS53的RNA表达水平(P<0.05)。过表达VPS53可抑制LoVo细胞增殖,可逆转过表达miR-31-5p对LoVo细胞增殖的促进作用(均P<0.05)。结直肠癌组织中的VPS53与Beclin1的表达呈正相关。过表达VPS53促进自噬小体的形成。过表达VPS53可上调Beclin1蛋白的表达水平(P<0.05)。自噬抑制剂可逆转过表达VPS53对LoVo细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。过表达miR-31-5p可下调Beclin1的RNA表达水平,过表达VPS53可逆转该现象(均P<0.05)。结论miR-31-5p是结直肠癌发生发展中的重要调控因子,miR-31-5p在结直肠癌细胞中高表达。miR-31-5p可能通过下调VPS53来抑制Beclin1的表达,通过抑制自噬来促进结直肠癌细胞的增殖。