Circular RNA hsa_circ_0078767通过miR-330-3p/p53轴调控肺癌细胞铁死亡

目的:探讨Circular RNAs(hsa_circ_0078767)通过调控miR-330-3p/p53信号通路,对肺癌细胞铁死亡的影响。方法:用qRT-PCR法检测四种人类肺癌细胞系(HCC827、A-549、Calu-3和H1975)和一种正常肺上皮细胞系BEAS-2B中hsa_circ_0078767的表达;转染hsa_circ_0078767的过表达载体(oe-circ)于A-549和H1975细胞内;RNA FISH确定hsa_circ_0078767的胞质定位;CCK-8、集落形成、EdU染色、FACS分析和流式细胞仪分别检测A-549和H1975细胞的活性、增殖、凋亡和ROS情况;铁测定试剂盒检测细胞铁含量;Western blot检测细胞中miR-330-3p、cleaved Caspase3和cleaved PARP的表达;RNA pull-down实验分析hsa_circ_0078767与miR-330-3p的结合位点的结合效率;RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验检测hsa_circ_0078767和miR-330-3p的mRNA水平;双荧光素酶报告基因实验检测hsa_circ_0078767与miR-330-3p的靶向关系;皮下注射A-549-vector和A549-oe-circ细胞(1×10~6个)到六周大的雄性裸鼠腹部,建立活体异种移植动物模型。结果:我们发现hsa_circ_0078767在肺癌细胞中低表达以及hsa_circ_0078767在肺癌恶性发展过程中对铁死亡的调控功能。在过表达hsa_circ_0078767的肺癌细胞中发现铁、Fe2+和ROS水平升高。铁死亡诱导剂erastin会降低细胞活力,而过表达hsa_circ_0078767会加强erastin对肺癌细胞的抑制作用。在机制方面,hsa_circ_0078767可通过海绵吸附miR-330-3p来影响p53的表达。上调miR-330-3p及敲降p53可逆转hsa_circ_0078767过表达对肺癌细胞的作用。结论:hsa_circ_0078767可能通过miR-330-3p/p53轴促进肺癌细胞铁死亡从而抑制肺癌进展。

清肾颗粒通过调控外泌体、miR-330-3p以及CREBBP表达抑制小鼠肾纤维化

目的探讨清肾颗粒对腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型及尿酸刺激下NRK-49F细胞的作用及其调控外泌体、miR-330-3p和CREBBP的机制。方法动物实验:构建腺嘌呤诱导的肾纤维化小鼠模型,分为正常组、模型组和清肾颗粒组(8.0 g·kg^(-1)·d^(-1)),6只/组,灌胃12周。采用尾静脉注射腺相关病毒载体,实验结束后收集双侧肾组织。观察小鼠肾组织外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测小鼠肾组织Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;HE和Masson染色观察小鼠肾组织病理学变化。细胞实验:构建尿酸刺激下的NRK-49F细胞模型(尿酸400μmol/L),SD大鼠灌胃制备清肾颗粒含药血清用于细胞实验,分为正常组、模型组和清肾颗粒含药血清组。观察NRK-49F细胞中外泌体标记蛋白CD9,Hsp70,TSG101蛋白水平变化;Western blotting及免疫荧光检测NRK-49F细胞中Col-III、α-SMA、FN和E-cad表达变化;双荧光素酶报告基因检测miR-330-3p与CREBBP靶向关系;RT-qPCR和Western blotting检测NRK-49F细胞中miR-330-3p与CREBBP表达变化。结果动物实验中,Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组CD9、Hsp70、TSG101蛋白水平降低(P<0.05)。Western blotting及免疫荧光结果显示,与正常组相比,模型组Col-III、α-SMA、FN表达增加,E-cad表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组Col-III、α-SMA、FN表达减少,E-cad表达增加(P<0.05)。肾脏病理检查显示,清肾颗粒可以明显减轻小鼠肾组织纤维化(P<0.05)。RT-qPCR结果显示,尾静脉注射腺相关病毒病毒载体抑制miR-330-3p表达,增加CREBBP水平,减轻肾纤维化(P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,CREBBP是miR-330-3p的靶点(P<0.05)。RT-qPCR和Western blotting结果显示,与正常组相比,模型组miR-330-3p表达增加,CREBBP表达减少(P<0.05);与模型组相比,清肾颗粒组miR-330-3p表达减少,CREBBP表达增加(P<0.05)。细胞实验结果与动物实验结果趋势一致。结论清肾颗粒通过干预外泌体,降低miR-330-3p水平,增加CREBBP表达抑制肾纤维化。

LncRNA SNHG3通过miR-330-5p/PAK1信号轴调节前列腺癌细胞的增殖、凋亡和上皮间质转化

目的 探讨长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因(LncRNA SNHG)3通过miR-330-5p/P21活化激酶(PAK)1信号轴调节前列腺癌细胞的增殖、凋亡和上皮间质转化。方法 体外培养人前列腺上皮细胞和人前列腺癌细胞株PC-3、DU 145、VCaP,通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测各细胞中LncRNA SNHG3、miR-330-5p与PAK1 mRNA表达。体外培养人前列腺癌细胞PC-3,随机分为对照组、LncRNA SNHG3 siRNA组、miR-330-5p inhibitor组、共转染阴性对照(LncRNA SNHG3 siRNA阴性对照+miR-330-5p inhibitor阴性对照)组、共转染(LncRNA SNHG3 siRNA+miR-330-5p inhibitor)组,分组转染LncRNA SNHG3 siRNA及其阴性对照、miR-330-5p inhibitor及其阴性对照后,以噻唑蓝(MTT)和5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测PC-3细胞增殖情况;以流式细胞术检测PC-3细胞凋亡情况;以Transwell实验检测PC-3细胞侵袭情况;以qRT-PCR检测PC-3细胞miR-330-5p、PAK1与上皮间质转化因子E-钙黏附蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;以双荧光素酶报告基因实验检测PC-3细胞中LncRNA SNHG3对miR-330-5p的靶向调控作用。结果 与人前列腺上皮细胞比较,PC-3、DU 145、VCaP细胞中LncRNA SNHG3、PAK1 mRNA表达明显升高,miR-330-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组、共转染组分别相比,LncRNA SNHG3siRNA组细胞活力与相对增殖率、细胞Vimentin与PAK1 mRNA表达、侵袭细胞数均明显降低,细胞凋亡率、细胞miR-330-5p、E-cadherin mRNA表达均明显升高(均P<0.05);miR-330-5p inhibitor组细胞活力与相对增殖率、细胞Vimentin与PAK1 mRNA表达、侵袭细胞数均明显升高,细胞凋亡率、细胞miR-330-5p、E-cadherin mRNA表达均降低(P<0.05);共转染阴性对照组细胞各指标均无显著差异(P>0.05)。在PC-3细胞中,LncRNA SNHG3可靶向下调miR-330-5p表达。结论 下调LncRNA SNHG3可通过上调miR-330-5p表达而降低PAK1表达,进而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和上皮间质转化,诱导其凋亡。

miR-330-3p靶向丙酮酸激酶M2型对胃癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解进程调控机制研究

目的探讨miR-330-3p靶向丙酮酸激酶M2型(PKM2)基因对胃癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解进程的影响及机制。方法采用反转录聚合酶链式反应检测胃癌细胞SGC-7901、胃粘膜上皮细胞PKM2-NC、miR-330-3p-inhibitor+PKM2-shRNA、miR-330-3p-mimcs+LV-NC、miR-330-3p-mimcs+LV-PKM2转染至胃癌细胞中,采用CCK8法、Transwell实验、Annexin V/PI法分别检测细胞增殖、侵袭、凋亡情况,检测葡萄糖利用率、乳酸生成量、己糖激酶(HK)活性、乳酸脱氢酶(LDH)活性等糖酵解指标,采用Western Blot法检测PKM2、GLUT1、HK2、Bax、Caspase-3蛋白的表达,采用双荧光素酶报告基因检测实验检测miR-330-3p与PKM2的靶向关系。结果 (1)胃癌细胞系miR-330-3p表达量高于胃粘膜上皮细胞,PKM2表达量低于胃粘膜上皮细胞(P <0.05)。(2)生物信息学显示,miR-330-3p与PKM2存在结合位点;荧光素酶报告基因检测结果显示,与miR-NC组比较,miR-330-3p PKM2野生型荧光素酶活性降低(P <0.05)。(3)与miR-NC组比较,miR-330-3p-inhibitor组吸光度值、侵袭细胞数增多,凋亡细胞数减少,细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK活性、LDH活性降低,PKM2、GLUT1、HK2表达升高,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达量降低(P <0.05),miR-330-3p-inhibitor+PKM2-shRNA组升高或降低幅度低于miR-330-3p-inhibitor组(P <0.05)。(4)与miR-NC组比较,miR-330-3p-mimcs组miR-330-3p表达量升高(P <0.05),吸光度值、侵袭细胞数减少,凋亡细胞增多,细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量、HK活性、LDH活性升高,PKM2、GLUT1、HK2表达降低,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达量升高(P <0.05);miR-330-3p-mimcs+LV-PKM2组升高或降低趋势低于miR-330-3pmimcs组(P <0.05)。结论 miR-330-3p表达与胃癌细胞增殖、凋亡及有氧糖酵解进程相关,可能通过靶向PKM2实现。

circ_0003221/miR-330-3p在骨肉瘤组织中的表达及对U2-OS增殖迁移的影响

目的探讨circ_0003221在骨肉瘤组织中的表达及对U2-OS增殖迁移的影响和分子机制。方法选择37例骨肉瘤患者瘤组织及瘤旁组织,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0003221和miR-330-3p的表达水平,Pearson进行相关性分析。双荧光素酶报告实验检测circ_0003221和miR-330-3p的靶向关系。将骨肉瘤细胞U2-OS分为si-NC组、si-circ_0003221组、miR-NC组、miR-330-3p mimic组、si-circ_0003221+anti-miR-NC组、si-circ_0003221+miR-330-3p Inhibitor组;MTT法检测细胞增殖抑制率;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;Transwell检测细胞迁移数;划痕实验检测划痕愈合率。结果与瘤旁组织比较,骨肉瘤组织中circ_0003221表达水平升高,miR-330-3p表达水平降低(P<0.05);circ_0003221与miR-330-3p的表达呈负相关。circ_0003221靶向调控miR-330-3p。干扰circ_0003221或过表达miR-330-3p,U2-OS增殖抑制率升高,克隆形成数和迁移细胞数减少,划痕愈合率降低(P<0.05)。抑制miR-330-3p表达可逆转干扰circ_0003221对U2-OS细胞增殖和迁移的影响。结论circ_0003221再骨肉瘤组织中高表达,干扰circ_0003221可通过上调miR-330-3p抑制骨肉瘤细胞U2-OS增殖、迁移。

miRNA-330-3p/Ap2m1轴在过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体抗心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)分泌外泌体(BMSC^(GATA-4)exosome)通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴减少心肌细胞凋亡,提高心肌梗死心功能。方法建立小鼠心梗模型,共分7组,分别经尾静脉注射BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome、BMSC^(miRNA-330-3p-inhibitor)-exosome、BMSC^(空载体)-exosome、BMSCexosome 48 h,同时将心梗未处理组及正常小鼠作为对照组。采用心脏彩超检测各组心功能,RT-PCR检测心梗心肌细胞内miRNA-330-3p的表达,Tunel法检测各组心梗心肌细胞凋亡数量。miRNA-330-3p对应靶基因Ap2.m1、Cnot4蛋白采用Western blot法进行检测。结果BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心功能改善最为明显(P<0.05),其心肌细胞内miRNA-330-3p表达量最高(P<0.05)。BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心肌细胞的凋亡率最低(P<0.05),BMSC^(miRNA-330-3p-mimic)-exosome组心梗心肌细胞内的Ap2.m1的表达最低(P<0.05)。结论过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞外泌体通过miRNA-330-3p/Ap2m1轴抗心肌细胞凋亡。

miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在食管鳞癌组织中的表达及相关性研究

目的探讨微小核糖核酸-330-3p(miR-330-3p)、FAM83H、长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因7(LncRNA SNHG7)在食管鳞癌组织中的表达及相关性研究。方法选取2014年11月至2020年11月东南大学附属中大医院江北院区和江苏省肿瘤医院接诊的114例食管癌患者作为研究对象,采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测癌组织、癌旁组织中miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表达情况。分析miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表达与食管鳞癌的相关性。结果与癌旁组织相比,miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在癌组织中表达较高(P<0.05)。与高中分化、无淋巴结转移、浅浸润、预后良好、Ⅰ~Ⅱ期食管鳞癌患者相比,低分化、有淋巴结转移、深浸润、预后不良、Ⅲ~Ⅳ期食管鳞癌患者miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7表达较高(P<0.05)。与miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7单项检测相比,三者联合对食管鳞癌的诊断价值较高(P<0.05)。结论miR-330-3p、FAM83H在食管鳞癌组织中呈高表达,LncRNA SNHG7呈低表达,且miR-330-3p、FAM83H、LncRNA SNHG7在食管癌中呈正相关,miR-330-3p、FAM83H高表达,LncRNA SNHG7低表达与患者分化程度、淋巴结转移、浸润程度、临床分期相关,并参与食管鳞癌的发生、发展的过程。

急性冠脉综合征患者血清LncRNA XIST和miR-330-3p水平表达与心脏自主神经功能的相关性研究

目的检测急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清长链非编码RNA X染色体失活特异转录物(LncRNA X inactivate-specific transcript,LncRNA XIST)和微小RNA(miR)-330-3p水平,分析二者与心脏自主神经功能的关系。方法选取2020年2月~2021年6月在华北石油管理局总医院诊断为ACS的患者156例,包括不稳定型心绞痛(unstable angina,UA)80例(UA组)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)76例(AMI组);另选取同期体检健康者100例作为对照组。实时荧光定量PCR法检测受试者血清LncRNA XIST和miR-330-3p水平;24 h动态心电图检测受试者心率变异性(heart rate variability,HRV)时域指标[包括:24 h内正常R-R间期标准差(SDNN)、每5 min R-R间期平均值的标准差(SDANN)、每5 min R-R间期标准差的平均值(SDNN index)、相邻R-R间期之差的均方根(RMSSD)及相邻R-R间期相差>50 ms心搏数占总心搏数的百分比(PNN50)]以及Pearson法分析ACS患者血清LncRNA XIST和miR-330-3p水平与HRV时域指标的相关性。结果与对照组比较,UA组和AMI组血清LncRNA XIST(1.37±0.26,1.69±0.31 vs 1.09±0.22)水平升高(F=113.587,P=0.000),miR-330-3p(0.82±0.15,0.53±0.12 vs 1.03±0.18)及SDANN(115.96±19.57 ms,98.96±16.57 ms vs 133.43±21.01 ms),SDNN(113.84±15.26 ms,101.84±11.22 ms vs 136.41±31.53 ms),SDNN index(54.68±6.72 ms,46.73±5.14 ms vs 64.68±10.64 ms),RMSSD(27.48±5.62 ms,21.37±3.64 ms vs 36.48±8.62 ms)和PNN50(7.58%±2.83%,4.18%±1.13%vs 10.72%±3.21%)水平均降低(F=54.923~225.201,均P=0.000),差异均有统计学意义。与UA组比较,AMI组血清LncRNA XIST水平升高(t=10.792,P<0.05),miR-330-3p及SDANN,SDNN,SDNN index,RMSSD和PNN50水平降低,差异有统计学意义(t=4.743~16.538,均P<0.05);ACS患者血清LncRNA XIST与SDNN index,RMSSD和PNN50呈负相关(r=-0.465,-0.532,-0.542,均P<0.05);miR-330-3p与SDNN index,RMSSD和PNN50呈正相关(r=0.471,0.562,0.561,均P<0.05)。结论ACS患者血清LncRNA XIST水平升高,miR-330-3p水平降低,与心脏自主神经功能有关,可作为防治ACS的重要靶点。

食管癌患者血清miR-3653-3p和miR-330-3p的作用及临床意义

目的观察血清miR-3653-3p和miR-330-3p表达水平对食管癌诊断和预后预测的临床价值。方法选取2015年1月至2017年6月在该院行手术治疗的食管癌患者109例作为食管癌组,同期在该院行手术治疗的食管良性病变患者(65例)和体检健康者(30例)分别作为食管良性病变组和对照组。采用实时荧光定量PCR检测血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-3653-3p和miR-330-3p水平对食管癌的诊断效能和预后预测价值。结果食管癌组患者血清miR-3653-3p水平低于食管良性病变组和对照组(P<0.01),食管良性病变组血清miR-3653-3p水平低于对照组(P<0.01);食管癌组患者血清miR-330-3p水平高于食管良性病变组和对照组(P<0.01),食管良性病变组miR-330-3p水平高于对照组(P<0.01)。ROC曲线分析显示,血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平对食管癌有较高的诊断效能,联合检测的曲线下面积(AUC)高于miR-365403-13p、miR-330-3p单独检测。3年随访存活组血清miR-3653-3p水平明显高于死亡组(P<0.01),而血清miR-330-3p水平明显低于死亡组(P<0.01)。血清miR-3653-3p和miR-330-3p水平对食管癌患者3年内出现死亡具有较高的预测价值,且联合检测的AUC高于miR-3653-3p、miR-330-3p单独检测。结论miR-3653-3p和miR-330-3p在食管癌中的作用类似抑癌基因和促癌基因,血清miR-3653-3p和miR-330-3p联合检测在食管癌诊断和预测3年内死亡方面有重要价值。

过表达GATA-4骨髓间充质干细胞外泌体中miR-330-3p的时-量变化

背景:前期实验已经证明过表达GATA-4骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosomes)可以通过抑制心肌细胞凋亡,有效修复心肌梗死引起的心肌损伤,进一步发现在其外泌体中miRNA-330-3p明显高表达且功能涉及抗凋亡,提示miRNA-330-3p可能是外泌体修复心肌损伤的关键分子。目的:探讨过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌的外泌体(BMSCs^GATA-4-exosomes)中miR-330-3p的时-量变化。方法:在过表达GATA-4小鼠BMSCs培养体系内加入miR-330-3p模拟剂(miR-330-3p-mimic)及抑制剂(miR-330-3p-inhibitor)作为BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic组及BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组,将BMSCs^GATA-4组、BMSCs^GATA-4-空载体组、BMSCs组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic-空载体组及BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor-空载体组作为混杂因素对照组。上述各组与基因开启剂强力霉素共培养24,48h,提取各组细胞分泌的外泌体。采用RT-PCR检测各组细胞及其外泌体内miR-330-3p的表达量。采用光镜评估BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组与BMSCs组细胞在24,48h的形态变化。结果与结论:①BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-mimic,组细胞与外泌体内miR-330-3p的表达率最高,且随着时间推移其miR-330-3p的表达逐渐增多;②BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组细胞与外泌体内miR-330-3p的表达率最低,且随着时间推移其miR-330-3p的表达逐渐减少;③BMSCsz^GATA-4-miR-330-3p-mimic组、BMSCs^GATA-4-miR-330-3p-inhibitor组与BMSCs组在24,48h的形态无变化;④结果表明,BMSCs内miR-330-3p表达与外泌体内miR-330-3p表达正相关,BMSCs过表达miR-330-3p可以有效提高外泌体中miR-330-3p的表达,而静默miR-330-3p可以有效减少外泌体中miR-330-3p的表达。

结直肠癌中miR-330-3p-RUVBL1信号轴对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨结直肠癌(colorectal cancer,CRC)中miR-330-3p-RUVBL1信号轴对肿瘤增殖、凋亡的影响。方法分析Oncomine数据库中结直肠癌RUVBL1 mRNA的表达情况;利用Kaplan-Meier生存曲线分析RUVBL1 mRNA表达水平与CRC患者生存预后之间的相关性;免疫组化法检测临床CRC标本癌组织和正常结直肠组织RUVBL1蛋白的表达情况。荧光素酶报告基因实验分析RUVBL1与miR-330-3p的靶向关系;荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测CRC临床标本癌组织和正常结直肠组织miR-330-3p的表达情况;利用脂质体转染结直肠癌HT-29细胞,过表达或沉默miR-330-3p的表达;运用CCK-8法检测过表达miR-330-3p对HT-29细胞活力的影响和对顺铂敏感性变化,利用流式细胞仪检测过表达miR-330-3p对HT-29凋亡的影响;利用Western blot检测转染miR-330-3p后HT-29细胞中RUVBL1蛋白的表达情况和细胞凋亡相关蛋白的表达情况。结果数据库分析结果显示RUVBL1 mRNA在CRC中高表达;RUVBL1基因的表达水平与结直肠癌患者生存预后之间存在相关性,RUVBL1高表达患者的总体生存率明显低于低表达RUVBL1的患者(P=0.0077);免疫组化结果显示RUVBL1在CRC组织中的表达水平较正常结直肠组织明显增高;qRT-PCR结果显示CRC临床标本癌组织中miR-330-3p的表达水平明显低于正常结直肠组织(P<0.01);过表达miR-330-3p的HT-29细胞中RUVBL1的表达明显下调,细胞内促凋亡蛋白Bax、cleaved-Caspase-3的蛋白表达水平均上调,而Bcl-2表达水平下降;过表达miR-330-3p的HT-29细胞凋亡增加,且对顺铂的敏感性增强。结论RUVBL1在CRC中高表达,其表达水平与CRC患者生存预后相关;RUVBL1是miR-330-3p的潜在靶点,miR-330-3p可能通过抑制RUVBL1表达促进结直肠癌细胞凋亡。

miR-330-3p在颞下颌关节骨关节炎软骨退变中的作用机制研究

目的:探讨miR-330-3p在颞下颌关节骨关节炎(temporomandibular joint osteoarthritis,TMJOA)软骨退变中的作用机制。方法:对SW1353软骨细胞系进行炎症及加压刺激,建立大鼠单侧前牙反(牙合)(unilateral anterior crossbite,UAC)TMJOA模型,通过RT-qPCR检测体外及体内软骨OA情况下miR-330-3p的表达变化。miR-330-3p过表达或抑制后,利用EDU荧光染色以及蛋白免疫印迹(WB)检测SW1353软骨细胞的增殖及合成分解代谢变化。生物信息学分析预测并筛选miR-330-3p的下游靶点,并在炎症及加压刺激下通过RT-qPCR和WB明确miR-330-3p对其调控作用。在miR-330-3p大鼠UAC TMJOA模型的关节腔内注射后,采用免疫组织化学方法检测靶分子的表达及软骨代谢的变化,明确miR-330-3p对TMJOA的治疗作用。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:在体外炎症和加压刺激下,以及大鼠UAC的TMJOA模型中,miR-330-3p在软骨中的表达均下降。抑制miR-330-3p可导致软骨细胞增殖能力下降,SOX9合成降低,MMP13表达增加,而过表达的结果则相反。生物信息学分析发现CTNNB1为可能的下游靶点之一,其在体外炎症和加压刺激后表达升高。过表达CTNNB1后,软骨细胞SOX9蛋白表达下降,MMP13蛋白表达升高,抑制CTNNB1的结果则相反。miR-330-3p与CTNNB1在mRNA及蛋白表达水平上存在负相关关系。大鼠UAC TMJOA模型关节腔内注射miR-330-3p模拟物后,CTNNB1的表达减少,软骨退变减轻。结论:miR-330-3p通过抑制CTNNB1的表达,减轻TMJOA的软骨退变。

异甘草素通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移的机制研究

目的 肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)是全世界范围内高频率发生的恶性肿瘤。最近的研究表明,异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)在肿瘤增殖和转移中发挥抗肿瘤活性。因此,研究旨在探讨ISL在抗LUSC转移中的作用机制。方法 利用梯度浓度ISL处理LUSC细胞,探究ISL在LUSC细胞增殖、迁移和侵袭中的抗癌特性。随后,利用生物信息学手段探寻了长链非编码RNA(Long non-coding RNAs, lncRNA)MIR22HG/miR-24-3p/Fas配体基因(Fas ligand Gene,FASLG)之间可能的互作关系。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测LUSC细胞中lncRNA MIR22HG、miR-24-3p、FASLG的表达,细胞计数盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、克隆形成、划痕愈合和Transwell实验分别检测细胞活力、增殖、迁移和侵袭。蛋白质免疫印迹法(Western blot, WB)检测上皮间充质转换(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)和转移相关蛋白的表达。RNA免疫沉淀(RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RIP)实验和双萤光素酶实验验证lncRNA MIR22HG与miR-24-3p、miR-24-3p与FASLG的结合关系。结果 ISL可以显著抑制LUSC细胞增殖、迁移和侵袭。生信分析及临床样本分析发现lncRNA MIR22HG在LUSC中低表达,ISL可以促进lncRNA MIR22HG的表达,抑制LUSC细胞的恶性行为。此外,lncRNA MIR22HG可以海绵吸附miR-24-3p进而调节FASLG的表达。miR-24-3p在LUSC中上调表达,FASLG在LUSC中下调表达。过表达FASLG可以逆转miR-24-3p过表达对LUSC增殖、转移以及EMT进程的促进作用。结论 这些结果表明,ISL通过lncRNA MIR22HG/miR-24-3p/FASLG轴抑制肺鳞癌转移,表明ISL有潜力作为治疗LUSC的新型药物。

lncRNA MIR4435-2HG靶向miR-376a-3p调控胆管癌细胞生物学行为的机制研究

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)MIR4435-2HG(MIR4435-2HG)对胆管癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其对微小RNA-376a-3p(miR-376a-3p)的调控作用。方法 qRT-PCR法检测人肝内胆管上皮细胞HIBEpic与人胆管癌细胞RBE中MIR4435-2HG、miR-376a-3p的表达。将si-NC、si-MIR4435-2HG、miR-NC、miR-376a-3p mimics、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-NC、si-MIR4435-2HG联合anti-miR-376a-3p分别转染至RBE细胞,作为si-NC组、si-MIR4435-2HG组、miR-NC组、miR-376a-3p组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组、si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组;采用MTT法、Transwell小室法及流式细胞仪分别检测细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡情况;双荧光素酶报告基因实验验证MIR4435-2HG与miR-376a-3p的靶向关系。Western blot检测相关蛋白表达。结果 RBE细胞中MIR4435-2HG表达量升高(P<0.05),miR-376a-3p表达量降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-MIR4435-2HG组MIR4435-2HG表达、细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.05),迁移及侵袭细胞数减少(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率升高(P<0.05)。MIR4435-2HG可靶向调控miR-376a-3p;与si-MIR4435-2HG+anti-miR-NC组比较,si-MIR4435-2HG+anti-miR-376a-3p组细胞活力及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平升高(P<0.05),迁移及侵袭细胞数增多(P<0.05),miR-376a-3p表达、细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论 敲低MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-376a-3p进而抑制RBE细胞增殖、迁移、侵袭,并诱导其凋亡。

长链非编码RNAMIR22HG和微RNA-9-3p在骨关节炎病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性

目的 探究长链非编码RNA(lncRNA)MIR22HG和微RNA-9-3p(miR-9-3p)在骨关节炎(OA)病人血清中的表达及与病情严重程度的相关性。方法 选取2020年10月至2021年10月在南充市中医医院确诊为OA的病人120例,作为OA组,60例体检健康人群作为对照组;采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测血清lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平;Pearson法分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的相关性以及二者与视觉模拟(VAS)评分、美国特种外科医院膝关节评分(HSS)以及西安大略和麦马斯特大学骨关节炎指数可视化量表(WOMAC)评分的相关性;绘制受试者操作特征(ROC)曲线分析lncRNA MIR22HG和miR-9-3p对OA的诊断价值。结果 OA组的血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著高于对照组(1.48±0.25比1.01±0.22),miR-9-3p的表达水平显著低于对照组(0.72±0.13比1.05±0.12)(P<0.05);相关性分析显示,lncRNA MIR22HG和miR-9-3p的表达水平呈负相关关系(P<0.05);KLⅣ级血清lncRNA MIR22HG的表达水平、VAS评分、WOMAC评分显著高于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著高于KLⅡ级(P<0.05),KLⅣ级血清miR-9-3p的表达水平、HSS评分显著低于KLⅢ级和KLⅡ级,KLⅢ级显著低于KLⅡ级(P<0.05);OA病人lncRNA MIR22HG的表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈正相关,与HSS评分呈负相关(P<0.05);miR-9-3p表达水平与VAS评分、WOMAC评分均呈负相关,与HSS评分呈正相关(P<0.05);二者联合诊断的AUC高于lncRNA MIR22HG、miR-9-3p单独诊断的AUC值(Z=2.22,P=0.012;Z=1.43,P=0.025)。结论OA病人血清中lncRNA MIR22HG表达水平显著升高,miR-9-3p表达水平显著降低,二者与OA病情严重程度密切相关,且对OA具有一定的诊断价值。

circ_0011385和miR-330-3p在结肠癌中的表达及其对结肠癌细胞恶性行为的影响

目的:探讨结肠癌组织中circ_0011385和miR-330-3p表达情况,研究circ_0011385靶向miR-330-3p对结肠癌细胞(SW1116)恶性行为的影响。方法:RT-qPCR检测circ_0011385和miR-330-3p在结肠癌组织中表达情况,并分析circ_0011385和miR-330-3p表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关系。皮尔森相关分析确定circ_0011385和miR-330-3p表达的相关性。circ_0011385和miR-330-3p的关系通过双荧光素酶报告实验来确定。将si-circ_0011385、si-NC、si-circ_0011385+anti-miR-NC、si-circ_0011385+anti-miR-330-3p分别转染SW1116细胞,Transwell、流式细胞术分析细胞迁移、侵袭和凋亡。结果:结肠癌组织中circ_0011385呈高表达,miR-330-3p呈低表达,二者的表达水平呈负相关关系(r=-0.8924)。circ_0011385和miR-330-3p表达水平与结肠癌患者年龄、肿瘤大小无相关性(P>0.05),与分化程度、TNM分期、淋巴结转移显著相关(P<0.05)。miR-330-3p是circ_0011385的靶基因。沉默circ_0011385表达后SW1116细胞凋亡率、miR-330-3p表达水平显著升高(P<0.05),细胞迁移数、侵袭数显著减少(P<0.05)。抑制miR-330-3p表达显著减弱沉默circ_0011385对SW1116细胞凋亡、迁移和侵袭的作用(P<0.05)。结论:沉默circ_0011385通过上调miR-330-3p表达来诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其迁移和侵袭。

LncRNA CRNDE调节miR⁃338⁃3p/KLF6轴对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响

目的探讨LncRNA结直肠肿瘤差异表达基因(CRNDE)调节miR⁃338⁃3p/KLF6轴对LPS诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响。方法将人肺泡上皮细胞A549分为CK组、LPS组、LPS+si⁃NC组、LPS+si⁃CRNDE组、LPS+si⁃CRNDE+inhibitor NC组、LPS+si⁃CRNDE+miR⁃338⁃3p inhibitor组、LPS+si⁃CRNDE+oe⁃NC组、LPS+si⁃CRNDE+oe⁃KLF6组;qRT⁃PCR检测各组细胞CRNDE、miR⁃338⁃3p和KLF6表达水平;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA试剂盒检测TNF⁃α、IL⁃10和IL⁃1β水平;商品化试剂盒分析MDA、GSH⁃Px、SOD水平;Western blot检测细胞中KLF6、Cleaved⁃caspase⁃3、Bax、Bcl⁃2蛋白表达量。双荧光素酶报告基因实验验证miR⁃338⁃3p与RNDE和KLF6的关系。结果与CK组相比,LPS组和LPS+si⁃NC组A549细胞CRNDE和KLF6 mRNA表达、TNF⁃α、IL⁃1β水平、MDA含量、细胞凋亡率、caspase⁃3、Bax、KLF6蛋白表达显著升高,miR⁃338⁃3p表达、细胞活力、IL⁃10水平、SOD和GSH⁃Px活性、Bcl⁃2蛋白表达显著降低(P<0.05);与LPS+si⁃NC组相比,LPS+si⁃CRNDE组A549细胞CRNDE和KLF6 mRNA表达、TNF⁃α、IL⁃1β水平、MDA含量、细胞凋亡率、caspase⁃3、Bax、KLF6蛋白表达显著降低,miR⁃150⁃5p表达、细胞活力、IL⁃10水平、SOD和GSH⁃Px活性、Bcl⁃2蛋白表达显著升高(P<0.05);干扰miR⁃338⁃3p表达或过表达KLF6均可降低下调CRNDE表达改善LPS诱导A549细胞损伤的作用(P<0.05)。结论下调CRNDE可调控miR⁃338⁃3p/KLF6轴减轻LPS诱导的A549细胞损伤。

LncRNA SNHG25在直肠癌细胞中的表达及其调节miR-330-3p/SMYD3轴对直肠癌细胞迁移及侵袭的影响

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)小核仁RNA宿主基因25(SNHG25)对直肠癌(RC)细胞迁移、侵袭的影响及微小RNA(miR)-330-3p/组蛋白甲基化转移酶3(SMYD3)轴在此过程中所发挥的作用。方法使用Real-Time PCR检测SNHG25在不同细胞系的表达及其沉默效率,Transwell实验检测下调SNHG25对RC细胞迁移和侵袭的影响。再次培养细胞,并依实验目的分为NC组(不作任何处理)、miR-330-3p mimics组(转染miR-330-3p模拟物)、miR-330-3p inhibitor组(转染miR-330-3p抑制物)、sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor组(转染sh-SNHG25-1+miR-330-3p抑制物)、SMYD3组(转染pcDNA-SMYD3)、si-SMYD3(转染si-SMYD3)、SMYD3+miR-330-3p mimics(转染pcDNA-SMYD3+miR-330-3p模拟物),Real-Time PCR检测各组细胞中miR-330-3p与SMYD3 mRNA表达;Transwell实验检测各组RC细胞迁移、侵袭能力。结果与人正常肠黏膜上皮细胞系(FHC)细胞比较,RC细胞(SW837、SW1463及HR8348)中SNHG25的表达增高,且在HR8348细胞中表达明显高于其他RC细胞系(3.12±0.17、1.96±0.15、4.87±0.22比1.00±0.03,P<0.05),选择HR8348细胞进行后续实验。与sh-NC比较,sh-SNHG25-1/2/3组细胞中SNHG25表达均被下调,且sh-SNHG25-1下调效率最高(1.02±0.01比0.21±0.02、0.52±0.03、0.36±0.04,P<0.05);sh-SNHG25-1组细胞中RC细胞迁移数量和侵袭数量均减少(205.13±21.23比120.34±11.98和89.92±8.15比30.27±3.59,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,SNHG25与miR-330-3p、miR-330-3p与SMYD3均存在负向调控关系。与NC组比较,miR-330-3p mimics组细胞中miR-330-3p表达增加(1.03±0.01比1.67±0.15,P<0.05),迁移细胞数量和侵袭细胞数量减少(210.08±12.96比131.36±10.45和77.45±8.69比21.74±2.04,P<0.05);miR-330-3p inhibitor组细胞中miR-330-3p表达降低(1.03±0.01比0.43±0.05,P<0.05),迁移细胞数量和侵袭细胞数量增多(210.08±12.96比246.95±16.34和77.45±8.69比122.03±9.51,P<0.05);与miR-330-3p inhibitor比较,sh-SNHG25-1+miR-330-3p inhibitor组细胞中miR-330-3p表达增高(0.43±0.05比0.76±0.04,P<0.05),细胞侵袭和迁移数量减少(246.95±16.34比167.54±11.79和122.03±9.51比52.88±5.07,P<0.05)。与NC组相比,SMYD3组细胞中SMYD3 mRNA表达增高(1.02±0.03比2.34±0.19,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量增多(215.26±15.38比351.04±20.96和86.33±9.65比129.87±11.52,P<0.05);si-SMYD3组细胞中SMYD3 mRNA表达降低(1.02±0.03比0.31±0.04,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量减少(215.26±15.38比128.54±15.47和86.33±9.65比28.92±4.91,P<0.05)。与SMYD3组相比,SMYD3+miR-330-3p mimics组细胞中SMYD3 mRNA表达降低(2.34±0.19比0.72±0.07,P<0.05),细胞的迁移和侵袭数量减少(351.04±20.96比168.08±13.44和129.87±11.52比63.01±5.18,P<0.05)。结论下调SNHG25表达可能通过调控miR-330-3p/SMYD3轴抑制RC细胞侵袭及迁移。

circ_0091579/miR-330-3p/RNF126轴影响结直肠癌LoVo细胞的增殖、侵袭和凋亡

目的:探讨环状RNA circ0091579作为分子海绵吸附miR-330-3p介导环指蛋白126(ring finger protein 126,RNF126)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞增殖、凋亡、侵袭的影响。方法:选取2019年2月至2020年5月在大理大学第一附属医院行手术治疗的60例CRC患者的癌组织和癌旁组织。构建circ0091579、miR-330-3p的过表达或敲减的CRC LoVo细胞,qPCR检测CRC组织和细胞中circ0091579、miR-330-3p和RNF126的表达;MTT、Transwell、流式细胞术分别检测细胞的增殖、侵袭、凋亡情况;生物信息学方法预测circ0091579和miR-330-3p、miR-330-3p和RNF126的靶向关系并用双荧光素酶报告实验和RNA免疫沉淀实验验证。结果:CRC组织和多种细胞(HCT116、SW620、CW-2、LoVo细胞)中,circ0091579和RNF126均高表达、miR-330-3p均低表达(均P<0.05)。敲减circ0091579可以抑制LoVo细胞的增殖、侵袭而促进其凋亡(均P<0.05),但该影响在加入miR-330-3p后被逆转;过表达miR-330-3p使LoVo细胞增殖和侵袭能力减弱但凋亡程度加强(均P<0.05),该影响在加入RNF126后被抵消。circ0091579、miR-330-3p和RNF126之间存在靶向作用关系。结论:circ0091579通过mi R-330-3p/RNF126轴促进LoVo细胞增殖、迁移和侵袭而抑制其凋亡。

MicroRNA-330通过靶向SPATS2/c-myc/p21通路调控乳腺癌的增殖

本研究旨在是深入了解微RNA-330(miR-330)在乳腺癌病理下的作用途径,尤其是它如何影响SPATS2/c-myc/p21的通路从而控制乳腺癌的生长,以及miR-330-3p在癌细胞侵入功能上的影响。方法 创建乳腺癌细胞模型,采集了乳腺癌组织样本,并从其中提取了miR-330的表达水平进行数据分析。转染miR-330及其相关质粒,然后检测SPATS2/c-myc/p21通路中相关蛋白的表达,进一步开展了肿瘤增长的试验。考虑到miR-330-3p对癌细胞渗透能力的潜在影响,使用了95D和95C的癌细胞系,对miR-330-3p mimics和inhibitor进行了转染处理,进而检查了细胞的形态特征,并执行了Transwell的细胞侵袭试验,同时也对这些试验结果进行了对比分析。结果 根据研究,miR-330的呈现程度与乳腺癌的差异、大小、其淋巴细胞转移、远处转移以及T分期等方面的临床和病变特点有着显著的关联性。miR-330-3p mimics的研究结果揭示,95D细胞系的细胞浸润能力有所减弱,而miR-330-3p inhibitor对95C细胞系的细胞浸润能力产生了明显的增强效果。这暗示了miR-330-3时p在癌细胞的侵入及其扩散中有潜力扮演关键角色。结论 miR-330主要是利用SPATS2/c-myc/p21这一通道来调节乳腺癌的增长,但miR-330-3p很可能会显著影响癌细胞的渗透性能。因此,miR-330-3p预计将会是未来乳腺癌治疗研究以及临床实际应用中值得关注的潜在治疗目标。