miR⁃34a骨粉复合胶原基水凝胶促进辐照区骨缺损修复

目的探讨负载miR⁃34a的Bio⁃Oss■骨粉与转谷氨酰胺酶交联明胶(transglutaminase crosslinked gela⁃tin,Col⁃Tgel)的联合使用对辐照损伤大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化作用及对辐照区骨缺损修复的作用。方法本实验已获得单位实验动物伦理委员会批准。取2周龄SD大鼠长骨骨髓,培养BMSCs并进行鉴定。当BMSCs生长至贴满瓶底80%时,进行2 Gy剂量X线照射,制备BMSCs辐照损伤模型备用。将2.5、5μL Col⁃Tgel分别加入10 mg Bio⁃Oss■骨粉(P)中,制备复合骨替代材料PG⁃2.5和PG⁃5,通过体外和体内实验筛选骨粉与水凝胶合适比例。将lipofectamine 2000分别与Cy3⁃agomiR⁃34a、agomiR⁃34a或agomiR NC混合,然后将各组混合液分别加入10 mg Bio⁃Oss■骨粉(P)并进行冷冻干燥。将上述负载各组miR的10 mg Bio⁃Oss■骨粉和未负载miR的Bio⁃Oss■骨粉分别与2.5μL Col⁃Tgel混合,制备PG⁃Cy3⁃miR⁃34a、PG⁃miR⁃34a、PG⁃miR NC、PG组复合骨替代材料。将辐照后的BMSCs与PG⁃Cy3⁃miR⁃34a组复合骨替代材料共培养,使用共聚焦显微镜观察转染效果。将辐照后的BMSCs与PG⁃miR⁃34a组、PG⁃miR NC组、PG组复合骨替代材料共培养,使用RT⁃qPCR检测miR⁃34a表达、CCK⁃8检测细胞增殖,并在成骨诱导14 d后利用RT⁃qPCR检测成骨相关基因Runt相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的表达。取8周龄SD大鼠进行双侧胫骨15 Gy剂量X线照射,3周后在胫骨干骺端骨骺线下方2~3 mm处制备直径3 mm、深度2 mm的胫骨缺损,缺损区分别置入PG⁃miR⁃34a组、PG⁃miR NC组、PG组复合骨替代材料,植入8周后取材行micro⁃CT和HE切片观察体内骨缺损修复效果。结果2 Gy辐照影响BMSCs成骨分化能力,辐照组ALP染色浅于非辐照组,辐照组茜素红染色矿化结节少于非辐照组。10 mg Bio⁃Oss■骨粉与2.5μL Col⁃Tgel构建的复合材料具有较好的操作性能和成骨性能,并用于后续实验。PG⁃Cy3⁃miR⁃34a可将负载的Cy3⁃agomiR⁃34a转染入辐照损伤BMSCs中。PG⁃miR⁃34a可提高辐照损伤BMSCs中miR⁃34a的表达水平,对细胞增殖无抑制作用,并能显著促进成骨相关基因Runx2、ALP、OCN的表达。在辐照区骨缺损修复实验中,micro⁃CT显示PG⁃miR⁃34a组骨缺损区新生骨体积高于其他组,HE切片染色结果也验证了PG⁃miR⁃34a可促进骨缺损修复。结论miR⁃34a骨粉复合胶原基水凝胶可促进辐照损伤BMSCs体外成骨分化,促进辐照区骨缺损修复。

基于miR⁃34a/HMGB1轴探讨七氟醚对胃癌细胞恶性生物学活性的机制

目的基于miR⁃34a/HMGB1轴探究七氟醚对胃癌细胞恶性生物学活性的影响。方法将胃癌细胞分为NC组,SEV⁃1.7%组、SEV⁃3.4%组、SEV⁃5.1%组。miR⁃34a组、SEV⁃5.1%+anti⁃miR⁃34a组、SEV⁃5.1%+pcDNA⁃HMGB1组和SEV⁃5.1%+pcDNA⁃HMGB1+miR⁃34a组。CCK⁃8、Transwell小室法分别检测细胞增殖和侵袭移能力;qRT⁃PCR检测miR⁃34a表达;蛋白质印迹检测细胞中HMGB1蛋白表达;双荧光素酶报告系统实验检测miR⁃34a和HMGB1的靶向关系。结果和GES⁃1细胞系相比,胃癌SGC⁃7901细胞(0.23±0.03)中miR⁃34a表达降低,HMGB1蛋白(0.85±0.10)表达升高(P<0.05)。和NC组相比,SEV⁃1.7%组、SEV⁃3.4%组、SEV⁃5.1%组细胞中miR⁃34a表达均升高,细胞存活率、细胞侵袭数目和HMGB1蛋白表达均降低(P<0.05)。和SEV⁃5.1%组相比,SEV⁃5.1%+anti⁃miR⁃34a组细胞存活率[24 h、48 h分别为(92.46±8.27)%、(96.71±7.52)%]、细胞侵袭数目(126.42±10.84)和细胞中HMGB1蛋白(0.80±0.09)表达均明显增加(P<0.05)。向细胞中转染HMGB1⁃WT时,miR⁃34a组(0.34±0.05)荧光素酶活性明显低于miR⁃NC组(P<0.05)。和SEV⁃5.1%组相比,SEV⁃5.1%+pcDNA⁃HMGB1组细胞存活率[24 h、48 h分别为(90.18±8.06)%、(82.47±7.21)%]、细胞侵袭数目(122.18±10.62)和细胞中HMGB1蛋白(0.81±0.10)表达均明显升高(P<0.05);和SEV⁃5.1%+pcDNA⁃HMGB1组相比,SEV⁃5.1%+pcDNA⁃HMGB1+miR⁃34a组细胞存活率[24 h、48 h分别为(65.33±6.02)%、(28.41±3.26)%]、细胞侵袭数目(68.33±6.09)和细胞中HMGB1蛋白(0.34±0.04)表达均明显降低(P<0.05)。结论七氟醚可通过调节miR⁃34a/HMGB1轴抑制胃癌细胞增殖和侵袭。

Linc01419调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖与侵袭

目的:探讨长链非编码RNA Linc01419对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制。方法:通过UALCAN软件(https://ualcan.path.uab.edu/)分析TCGA数据库中Linc01419在膀胱癌组织与正常膀胱组织中的表达差异;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Linc01419在不同膀胱癌细胞系、22例经病理证实为膀胱癌的手术患者的肿瘤组织及癌旁正常膀胱组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)实验和Transwell小室侵袭实验检测敲低Linc01419表达对膀胱癌细胞增殖与侵袭的影响;采用双荧光素酶报告基因检测法分析Linc01419与miR-34a-5p及miR-34a-5p与E2F3之间的靶向调控关系。结果:UALCAN数据库分析显示相较正常膀胱组织,Linc01419在膀胱癌组织中显著高表达(P<0.001);RT-qPCR分析结果显示相较癌旁正常膀胱组织,Linc01419在22例膀胱癌组织中表达明显上调(P<0.001),与UALCAN数据库分析结果一致;Linc01419在4株膀胱癌细胞中的表达明显高于正常膀胱上皮细胞(P<0.01);敲低Linc01419表达,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及N-cadherin、PCNA蛋白的表达,而显著促进E-cadherin的蛋白表达(P<0.05);miR-34a-5p过表达对膀胱癌细胞具有类似的抑制作用;双荧光素酶报告基因实验、RIP及Pull-down实验证实Linc01419可靶向结合miR-34a-5p,而后者进一步介导了对E2F3的靶向调控;抑制miR-34a-5p表达,可显著削弱Linc01419沉默对膀胱癌细胞生物学行为及E-cadherin、N-cadherin、PCNA、E2F3表达的影响。结论:Linc01419在膀胱癌中异常高表达,其通过调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖和侵袭,很可能是膀胱癌发生、发展过程中的一个重要环节。

miR-34a-5p/PLCD3轴调控骨关节炎进展的机制

背景:目前已有针对miRNA/mRNA轴调节骨关节炎疾病进程的分子机制研究。先前生物信息学研究发现具有临床预测价值的mRNA(磷脂酶Cδ3:phospholipase C delta 3,PLCD3)及其靶向miRNA(miR-34a-5p),尚缺实验验证其调控骨关节炎的具体作用及机制。目的:探讨miR-34a-5p/PLCD3轴对骨关节炎进展的调控作用及机制。方法:选择15例膝骨关节炎患者的滑膜为骨关节炎组,同时选择同期因创伤致髌骨骨折行内固定术的15例年轻患者的健康滑膜为对照组,Real-time PCR法检测滑膜中PLCD3及miR-34a-5p的表达。通过细胞转染的方法,将人滑膜关节炎成纤维细胞(human fibroblast like synovial cells-osteoarthritis,HFLS-OA)进行处理,并分为miR-34a-5p模拟物组、pCDH-PLCD3组、miR-34a-5p模拟物+pCDH-PLCD3组、miR-34a-5p抑制剂组、si-PLCD3组、miR-34a-5p抑制剂+si-PLCD3组,通过Real-time PCR法检测PLCD3和miR-34a-5p表达的关系;通过CCK-8法、细胞划痕实验检测各组HFLS-OA细胞活力及细胞迁移的影响;使用Western Blot法检测凋亡标记蛋白表达水平;使用ELISA法检测炎症因子的表达。结果与结论:①PLCD3是miR-34a-5p的直接靶标,同时PLCD3和miR-34a-5p表达水平呈负相关。②PLCD3上调会促进HFLS-OA细胞的增殖并抑制细胞迁移,而miR-34a-5p上调会显著抑制HFLS-OA细胞的活性并增强细胞迁移;miR-34a-5p过表达使HFLS-OA细胞Casp3和Casp9蛋白水平显著升高,而PLCD3过表达则表现出相反趋势。③PLCD3过表达显著增加了HFLS-OA细胞白细胞介素6和肿瘤坏死因子α的表达,而miR-34a-5p模拟物则表现出保护活性。④结果说明,miR-34a-5p/PLCD3轴可能通过调节滑膜细胞的炎症过程或凋亡来影响骨关节炎的进展。

miR-34a通过激活lncRNA NORHA转录诱导猪卵巢颗粒细胞早期凋亡

【目的】探索miR-34a诱导GCs凋亡的RNA激活机制,为揭示猪卵泡闭锁的分子机理、筛选调控母猪繁殖的小核酸调节物提供依据。【方法】利用生物信息学方法分析猪miR-34a特征及其与潜在靶基因lncRNA NORHA启动子的结合情况。利用核质分离技术分析猪GCs中miR-34a的亚细胞定位。qPCR检测miR-34a对猪GCs中NORHA、凋亡标志基因BCL-2和BAX表达的影响。利用荧光素酶活性分析验证miR-34a对NORHA启动子转录活性的靶向调控关系。利用染色质免疫沉淀(ChIP)检测miR-34a对猪GCs中NORHA启动子miRNA反应元件(MRE)处AGO2和组蛋白修饰因子富集情况。利用western blot和流式细胞术分析miR-34a通过NORHA对下游因子FOXO1的表达和细胞凋亡的调控作用。【结果】猪miR-34a为基因间miRNA,其序列在哺乳动物中具有高度保守性。亚细胞定位分析显示,miR-34a在猪GCs中细胞核与细胞质均有分布。生物信息学分析显示miR-34a的MRE位于NORHA启动子-194 nt至-173 nt处,且两者结合自由能为-23.9 kcal·mol^(-1)。qPCR结果表明miR-34a显著上调猪GCs中NORHA的表达。荧光素酶活性分析显示,miR-34a极显著上调NORHA启动子报告载体活性,而对MRE突变型启动子活性没有显著影响。ChIP试验显示,miR-34a可增加NORHA启动子MRE处RNA诱导转录激活(RITA)复合物核心成员AGO2和转录激活型组蛋白H3K4me3的富集,而减少转录抑制型组蛋白H3K9me3的富集。共转试验显示,敲减NORHA可显著或极显著逆转由miR-34a过表达引起的FOXO1蛋白水平和早期凋亡率的上调,以及BCL-2/BAX比值的下调。【结论】细胞核miR-34a是猪GCs中的内源性小激活RNA(saRNA),通过靶向激活促凋亡lncRNA NORHA的转录,诱导猪GCs早期凋亡(细胞膜完整),可能参与猪卵泡闭锁的启动。

miR-34a-5p提高顺铂在宫颈癌细胞中的敏感性及其可能机制

目的:探究miR-34a-5p对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响及其可能机制。方法:分别使用0、1、2、4、8μg/mL浓度的顺铂处理Hela细胞,CCK8检测细胞活力,qRT-PCR检测miR-34a-5p表达。设计并合成miR-34a-5p mimics,将细胞分成Blank、NC、miR-34a-5p、AG490、miR-34a-5p+AG490组。CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Transwell实验检测侵袭细胞数,Western blot检测MDM4、STAT3、MRP1、Bax和BCL-2蛋白表达水平。结果:随着顺铂浓度的增加,Hela细胞活力和miR-34a-5p表达逐渐下降。与Blank/NC组相比,miR-34a-5p和AG490组细胞活力、侵袭细胞数、MRP1、BCL-2、MDM4、p-STAT3/STAT3蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著上升(P<0.05);与miR-34a-5p/AG490组相比,miR-34a-5p+AG490组细胞活力、侵袭细胞数、MRP1、BCL-2、MDM4、p-STAT3/STAT3蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著上升(P<0.05)。结论:miR-34a-5p可增加宫颈癌细胞对顺铂化疗的敏感性,其机制可能与MDM4/JAK/STAT3信号通路相关。

miR-34a阻断Wnt/β-catenin信号通路下调PD-L1表达抑制肺腺癌细胞的生长和转移

目的:研究miR-34a对肺腺癌细胞增殖、转移及凋亡的影响及其作用机制。方法:选取105例肺腺癌患者,根据患者PD-L1表达分为高、中、低三组,收集患者腺癌组织及癌旁组织,运用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)和Western blot法(WB)检测miR-34a和Wnt信号相关基因mRNA和蛋白表达量。构建miR-34a mimcs-pCMV、miR-34a inhibitor-pCMV载体和空载pCMV,利用脂质体转染肺腺癌A549细胞,采用MTT法检测miR-34a高表达、低表达和阴性对照NC组细胞增殖活性,采用Transwell小室实验、细胞划痕实验、EdU实验检测细胞侵袭、迁移和增殖能力;采用qPCR和WB法检测各组细胞中PD-L1、Wnt信号相关基因以及肺腺癌相关基因及蛋白表达水平;采用双荧光素酶系统检测miR-34a和Wnt1、PD-L1靶向结合作用。结果:在三组患者中miR-34a的表达与PD-L1表达水平呈负相关(P<0.05),而Wnt信号通路相关蛋白的表达水平与PD-L1表达呈正相关(P<0.05)。与对照NC组相比,miR-34a mimcs组细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力均显著降低,而miR-34a inhibitor组细胞的增殖及迁移、侵袭能力显著提高(均P<0.05);qPCR和WB结果显示,PD-L1、Wnt通路相关蛋白Wnt1、β-catenin、GSK-3β、PTEN,凋亡相关蛋白Bcl-2,肺腺癌相关驱动基因EGFR、ROS1、ALK,转移相关基因MMP2、Vimentin的表达量在miR-34a mimcs组中显著低于它们在miR-34a inhibitor组中的表达水平;而细胞凋亡相关的Cleaved caspase-3、p53蛋白表达量则在miR-34a mimcs组显著高于miR-34a inhibitor组。双荧光素酶报告基因实验验证miR-34a与Wnt1和PD-L1均能特异性结合,Wnt1和PD-L1是miR-34a调控的靶基因。结论:miR-34a能够抑制PD-L1蛋白和肺腺癌相关驱动基因的表达,并通过调控Wnt1蛋白抑制Wnt信号通路从而抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程;同时诱导细胞凋亡相关基因表达,促进肺腺癌细胞的凋亡。

急性冠状动脉综合征患者PCI治疗前后血清miR-34a、miR-146a水平变化及近期预后预测价值

目的探讨急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清微小RNA-34a(miR-34a)、微小RNA-146a(miR-146a)水平变化及近期预后预测价值。方法选取2018年2月~2020年6月收治的拟行经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术的ACS患者86例,所有研究对象均采用Judkins法进行冠脉造影,并根据造影图像结果中冠脉血管狭窄程度分为单支病变组(23例),双支病变组(36例),三支病变组(27例);同时对冠脉造影结果进行Gensini评分,<50分为轻度病变组(46例),50~90分为中度病变组(30例),>90分为重度病变组(10例)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测ACS患者PCI术前、术后1个月的miR-34a、miR-146a的表达水平。并随访ACS患者术后1年内主要不良心血管事件(MACE)的发生情况,并根据是否发生MACE事件分为MACE组与非MACE组,比较两组血清miR-34a、miR-146a的表达水平。结果ACS患者PCI术前血清miR-34a、miR-146a水平明显高于PCI术后(P<0.001);ACS患者冠脉中度病变组血清miR-34a、miR-146a表达水平高于轻度病变组(P<0.001),而重度病变组中血清miR-34a、miR-146a表达水平明显高于中度病变组与轻度病变组(P<0.001);ACS患者冠脉双支病变组血清miR-34a、miR-146a表达水平高于单支病变组(P<0.05);而三支病变组中血清miR-34a、miR-146a表达水平明显高于双支病变组与单支病变组(P<0.05);MACE组患者血清miR-34a、miR-146a表达水平显著高于非MACE组(P<0.001)。结论PCI可明显降低ACS患者体内血清miR-34a、miR-146a的表达水平。而血清miR-34a、miR-146a的表达水平随着冠脉病变程度的加重而增高,故可通过血清miR-34a、miR-146a来预测冠脉的病变程度。同时监测ACS患者PCI术后的血清miR-34a、miR-146a的表达水平也具有重要意义,能预防MACE事件的发生。

特发性扩张型心肌病患者miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平及其与心衰的关系

目的 探讨特发性扩张型心肌病(IDCM)患者miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平及其与心衰的关系。方法 选取2019年1月至2023年1月绵阳市游仙区中医医院和四川省人民医院联合收治的IDCM患者136例(IDCM组),根据IDCM患者是否继发心力衰竭分为心衰组40例和非心衰组96例。选取同期68名无心脏病的健康志愿者设为对照组。比较IDCM组与对照组、心衰组与非心衰组的血清miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平、N末端B型利钠肽(NT-proBNP)、超敏肌钙蛋白T(hs-TnT)、左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)。分析血清miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平与心功能指标的相关性。采用ROC曲线分析miR-34a-5p、miR-17-5p对IDCM继发心衰的预测价值。结果 IDCM组的血清miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。IDCM组的血清NT-proBNP、hs-TnT水平高于对照组,LVEF低于对照组,LVEDD高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。心衰组的血清miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平高于非心衰组,差异有统计学意义(P<0.05)。心衰组的血清NT-proBNP水平高于非心衰组,LVEF低于非心衰组,LVEDD高于非心衰组,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平与血清NT-proBNP水平呈正相关(r=0.498,r=0.306,P<0.001)。血清miR-34a-5p联合miR-17-5p预测IDCM继发心衰的灵敏度为0.875,特异度为0.802。结论 IDCM患者存在miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平上调情况,且miR-34a-5p、miR-17-5p表达水平与心衰具有关联,对预测心衰有一定价值。

miR-34a-5p靶向Notch1对H/R诱导的人心肌细胞凋亡的影响及机制

目的探讨微小RNA(miR)-34a-5p/跨膜融合蛋白1(Notch1)信号轴介导内质网应激对缺氧/复氧(H/R)人心肌细胞的改善作用。方法人心肌细胞随机分为对照组(Control组)、缺氧复氧组(H/R组)、模拟物阴性对照组(mimic NC组)、模拟物组(mimic组)、抑制物阴性对照组(inhibitor NC组)、抑制物组(inhibitor组)。除Control组外,其余组细胞建立H/R损伤模型。定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测miR-34a-5p和Notch1表达量,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,双荧光素酶基因报告法检测miR-34a-5p和Notch1的靶向关系,蛋白印迹法检测转录激活因子6(ATF6)、肌醇需求酶1(IRE1)、蛋白激酶样内质网激酶(PERK)以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)表达量。结果与Control组比较,H/R组miR-34a-5p表达量、细胞凋亡率以及ATF6、IRE1、PERK和GRP78蛋白表达量均升高,细胞存活率以及Notch1 mRNA和蛋白表达量均降低(P<0.05);与H/R组和mimic NC组比较,mimic组miR-34a-5p表达量、细胞凋亡率以及ATF6、IRE1、PERK和GRP78蛋白表达量均升高,细胞存活率以及Notch1 mRNA和蛋白表达量均降低(P<0.05);与H/R组和inhibitor NC组比较,inhibitor组miR-34a-5p表达量、细胞凋亡率以及ATF6、IRE1、PERK和GRP78蛋白表达量均降低,细胞存活率以及Notch1 mRNA和蛋白表达量均升高(P<0.05)。结论下调miR-34a-5p可抑制H/R人心肌细胞凋亡,其可能是通过靶向激活Notch1介导内质网应激发挥作用。

调脾安肠方对裸鼠结肠癌肝转移灶miR-34a-5p、Notch1/NF-κB表达的影响

目的探讨调脾安肠方对裸鼠结肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastasis,CLM)灶组织中MicroRNA-34a-5p(miR-34a-5p)及其靶基因Notch1/核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路表达的影响。方法选取30只雄性Balb/c裸鼠随机分为空白组、模型组、中药组,每组10只。脾脏原位注射HCT-116人结肠癌细胞(细胞数约为1×107个/mL)法构建CLM模型。中药组在CLM造模完成2周后开始调脾安肠方(2 g/mL,每日0.2 mL)灌胃2周,空白组和模型组同期予等体积0.9%生理盐水灌胃。苏木素—伊红染色观察肝转移灶病理组织形态;蛋白免疫印迹法测定肝转移灶Notch1、NF-κB p65蛋白水平;实时荧光定量PCR测定肝转移灶miR-34a-5p及Notch1、NF-κB p65 mRNA水平。结果与模型组比较,中药组裸鼠镜下病理转移灶面积明显减小,核分裂像减少,提示调脾安肠方抑制了结直肠癌细胞在肝脏的定植和迁移。与空白组比较,模型组肝转移灶中miR-34a-5p含量显著降低(P<0.01),Notch1、NF-κB p65蛋白表达升高(均P<0.05),Notch1、NF-κB p65的mRNA表达显著升高(均P<0.01)。与模型组比较,中药组Notch1蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),NF-κB p65的mRNA表达显著降低(P<0.01)。miR-34a-5p与Notch1 mRNA在结肠癌肝转移灶组织中表达水平呈负相关(r^(2)=0.8845,P<0.05),Notch1与NF-κB p65在结肠癌肝转移灶组织中mRNA表达水平呈显著正相关(r^(2)=0.9291,P<0.01)。结论中药复方调脾安肠方能抑制裸鼠结肠癌肝转移灶形成,其机制可能与通过抑癌基因miR-34a-5p靶向负性调节Notch1/NF-κB通路表达有关。

有氧运动通过miR-34a/SIRT1通路调控自噬改善急性心肌梗死大鼠心肌损伤的作用机制

目的探讨有氧运动改善急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌损伤的调控机制。方法将24只雄性SD大鼠随机均分为假手术组、模型组和有氧运动组,每组8只。通过结扎冠状动脉左前降支构建AMI模型,并对有氧运动组AMI大鼠进行持续4周的有氧运动干预;采用HE染色法和Masson染色法观察各组大鼠的心脏组织学形态和纤维化程度;通过ELISA检测大鼠血浆脑钠肽(BNP)含量;通过经胸超声心动图(TTE)评估缩短分数(FS)、射血分数(EF);RTqPCR检测miR-34a水平;Western blot(WB)检测自噬相关蛋白的表达。利用H9C2细胞构建缺氧细胞模型,转染miR-34a抑制剂和siSIRT1,RT-qPCR检测各组细胞中miR-34a的表达;ELISA检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平;WB检测各组细胞自噬相关蛋白表达。结果与模型组相比,有氧运动组的心脏组织形态、纤维化、BNP表达及自噬水平均得到明显改善,且有氧运动组的miR-34a表达下调,差异均有统计学意义(P<0.01);与缺氧+miRNA NC组相比,缺氧+miR-34a抑制剂组的LDH和细胞自噬水平降低,SOD和SIRT1表达升高(均P<0.01);与缺氧+miR-34a抑制剂+siNC组相比,缺氧+miR-34a抑制剂+siSIRT1组的LDH和细胞自噬水平升高,而SOD和SIRT1表达降低(均P<0.01)。结论有氧运动可通过miR-34a/SIRT1通路抑制心肌细胞自噬水平,进而改善AMI大鼠的心肌损伤。这为研究有氧运动改善AMI心肌损伤提供了新的机制,并且有助于AMI的防治。

姜黄素通过上调miR-34a抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的恶性生物学行为

目的探讨姜黄素对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞恶性生物行为的影响及其可能作用机制。方法CCK8法检测姜黄素(0、6.25、12.5、25、50和100μmol·L^(-1))作用下细胞活力并筛选出后续姜黄素处理浓度(0、6.25、12.5、25μmol·L^(-1)),流式细胞法、划痕实验、Transwell实验和Western blot分别检测细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白水平。使用qRT-PCR法检测SH-SY5Y细胞miR-34a表达水平,构架miR-34a低表达SH-SY5Y细胞系(miR-34a inhibitor组)及其阴性对照(NC组)、对照组(Control组),三组细胞系均给予姜黄素(25μmol·L^(-1))处理分别记为黄素+miR-34a inhibitor组、姜黄素+NC组、姜黄素组,另设置空白对照组,采用上述相同方法检测各组细胞凋亡、迁移、侵袭及相关蛋白水平和p-p65、p-IκBα蛋白水平。结果当姜黄素干预浓度达到12.5μmol·L^(-1)时,SH-SY5Y细胞存活率显著低于无姜黄素处理的细胞(P<0.05);姜黄素(12.5、25μmol·L^(-1))组细胞凋亡率、Cleaved cas3/cas3、Cleaved cas9/cas9、E-cadherin蛋白表达和miR-34a表达水平均显著高于姜黄素(0μmol·L^(-1))组(P<0.01),划痕细胞闭合率、侵袭细胞数目和N-cadherin、Snail蛋白表达均显著低于黄素(0μmol·L^(-1))组(P<0.05);姜黄素组细胞凋亡率和Cleaved cas3/cas3、Cleaved cas9/cas9、E-cadherin蛋白表达均显著高于空白对照组(P<0.01),而划痕细胞闭合率、侵袭细胞数目和N-cadherin、Snail、p-p65/p65、p-IκBα/IκBα蛋白表达均显著低于空白对照组(P<0.01);姜黄素+miR-34a inhibitor组细胞凋亡率和Cleaved cas3/cas3、Cleaved cas9/cas9、E-cadherin蛋白表达均显著低于姜黄素+NC组(P<0.01),而划痕细胞闭合率、侵袭细胞数目和N-cadherin、Snail、p-p65/p65、p-IκBα/IκBα蛋白表达均显著高于姜黄素+NC组(P<0.01)。结论姜黄素可以促进SH-SY5Y细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭,可能与上调miR-34a表达抑制NF-κB信号通路有关。

miR-34a/SIRT1在重症监护病房获得性衰弱中的作用及其机制

目的探讨miR-34a/SIRT1在重症监护病房获得性衰弱(ICU-AW)中的作用及其机制。方法(1)诱导C2C12小鼠骨骼肌细胞分化成肌管,并分为ICU-AW模型组[ICU-AW组,用脂多糖(LPS)干预12 h]与正常对照组(等量无菌水干预12 h)。采用Western blotting检测两组肌肉环指蛋白1(MuRF-1)、萎缩相关基因1(Atrogin-1)蛋白、沉默调节蛋白1(SIRT1)表达水平,RT-qPCR检测两组微小核糖核酸-34a(miR-34a)及MuRF-1、Atrogin-1、SIRT1 mRNA的表达水平,并在光镜下观察两组小鼠C2C12骨骼肌细胞生长及分化情况。(2)将ICU-AW细胞分为对照组(siRNA的转染剂干预)、Scra siRNA组(转染剂和非特异性siRNA干预)、miR-34a siRNA组(miR-34a siRNA转染剂和特异性siRNA干预)、Vehicle组(SIRT1激动剂的溶剂二甲基亚砜干预)及SRT1720组(SIRT1激动剂SRT1720干预)。采用Western blotting检测各组SIRT1、Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平,RT-qPCR检测各组miR-34a及MuRF-1、Atrogin-1、SIRT1 mRNA表达水平。(3)将ICU-AW细胞分为对照组(miR-34a siRNA的转染剂干预)、miR-34a siRNA组(转染剂和特异性siRNA干预)、miR-34a siRNA+Vehicle组(转染剂、特异性siRNA和二甲基亚砜干预)及miR-34a siRNA+EX-527组(转染剂、特异性siRNA和SIRT1抑制剂EX-527干预),采用Western blotting检测并比较各组Atrogin-1、MuRF-1蛋白表达水平,RT-qPCR检测并比较各组Atrogin-1、MuRF-1 mRNA表达水平。结果光镜下可见第4天C2C12小鼠骨骼肌细胞肌管分化形成,与正常对照组比较,ICU-AW组肌管明显萎缩。RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与正常对照组比较,ICU-AW组Atrogin-1、MuRF-1 mRNA及蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05),miR-34a相对表达水平明显升高(P<0.001),SIRT1 mRNA及蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01)。RT-qPCR检测结果显示,与对照组(转染剂干预)比较,miR-34a siRNA组的miR-34a及Atrogin-1、MuRF-1 mRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01或P<0.001),SIRT1 mRNA和蛋白相对表达水平明显升高(P<0.01);与Vehicle组比较,SRT1720组SIRT1 mRNA和蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05),而Atrogin-1、Mu RF-1 mRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.05)。与miR-34a siRNA组比较,Scra siRNA组miR-34a及Atrogin-1、MuRF-1 mRNA和蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05、P<0.01或P<0.001),而SIRT1 mRNA和蛋白相对表达水平明显降低(P<0.01)。RT-qPCR及Western blotting检测结果显示,与miR-34a siRNA+Vehicle组比较,miR-34a siRNA+EX-527组Atrogin-1、MuRF-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论ICU-AW状态下miR-34a过度激活,通过抑制SIRT1的表达导致骨骼肌萎缩,可能在ICU-AW发病过程中起重要作用。

柴胡皂苷D调控miR-34a对胶质瘤细胞C6增殖与自噬的影响

目的:探讨柴胡皂苷D调控miR-34a对胶质瘤细胞C6增殖与自噬的影响。方法:分别以终浓度为0、3、6、9、12、15μmol/L的柴胡皂苷D作用胶质瘤细胞C6后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力;Western blot和RT-qPCR检测胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin1表达情况。将胶质瘤细胞C6分成4组:对照组(Control组)、柴胡皂苷D组(Ssd组)、柴胡皂苷D+miR-34a阴性对照转染组(Ssd+miR-34a NC组)、柴胡皂苷D+miR-34a inhibitor转染组(Ssd+miR-34a inhibitor组),CCK-8法检测miR-34a NC和miR-34a inhibitor在柴胡皂苷D处理后对胶质瘤细胞C6增殖能力的影响;Western blot检测各组胶质瘤细胞C6中自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达情况。结果:经过不同浓度的柴胡皂苷D处理48 h后,胶质瘤细胞C6增殖能力明显下降,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平均升高(P<0.05);胶质瘤细胞C6中miR-34a表达水平升高(P<0.05)。转染后,Ssd组胶质瘤细胞C6增殖率、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平与Ssd+miR-34a NC组比较,差异无统计学意义(P>0.05);Ssd组、Ssd+miR-34a NC组胶质瘤细胞C6增殖率低于Control组和Ssd+miR-34a inhibitor组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin1表达水平均高于Control组和Ssd+miR-34a inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05);Ssd+miR-34a inhibitor组胶质瘤细胞C6增殖率低于Control组,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值高于Control组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:柴胡皂苷D可能是通过调控miR-34a来抑制胶质瘤细胞C6增殖和诱导自噬发生。

超声造影定量参数联合外周血单个核细胞miR-34a、miR-146a对PTC诊断和淋巴结转移的评估价值

目的探讨超声造影定量参数联合外周血单个核细胞(PBMC)miR-34a、miR-146a对乳头状甲状腺癌(PTC)诊断和淋巴结转移的评估价值。方法选取104例PTC患者,根据病理诊断分为甲状腺癌组69例和良性组35例;根据是否发生淋巴结转移,将69例甲状腺癌患者分为未转移组33例和转移组36例。比较各组超声造影定量参数峰值强度(PI)、达峰时间(TTP)、平均通过时间(MTT)、曲线下面积(AUC)和PBMC中miR-34a、miR-146a水平。采用ROC分析超声造影参数联合P BMC miR-34a、miR-146a对PTC诊断和淋巴结转移的评估价值。结果与良性组比较,甲状腺癌组超声造影定量参数及P BMC miR-34a水平均降低(P<0.05),而miR-146a水平升高(P<0.05)。与未转移组比较,淋巴结转移组PI、AUC、miR-146a水平升高(P<0.05),而TTP、MTT、miR-34a水平降低(P<0.05)。超声造影定量参数与PBMC miR-34a、miR-146a对PTC诊断和淋巴结转移的AUC均高于各项指标单独检测值(P<0.05)。结论联合应用超声造影定量参数与PBMC miR-34a、miR-146a指标检测能增强PTC早期诊断与淋巴结转移的评估效能。

LINC00665靶向调控miR-34a-5p对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的:探讨LINC00665靶向调控微小RNA(miR)-34a-5p对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:选取食管癌病人肿瘤组织及癌旁组织,采用qRT-PCR法检测组织中LINC00665、miR-34a-5p表达水平。以食管癌细胞株EC9706为研究对象,设置对照组、阴性转染(siNC)组、LINC00665小干扰RNA载体(siLINC00665)组、siLINC00665+inhibitor阴性转染(anti-NC)组、siLINC00665+miR-34a-5p inhibitor(anti-miR-34a-5p)组,CCK-8法检测各组细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移数;Western blotting检测基质金属蛋白酶2(MMP-2)、细胞周期素D1(CyclinD1)、p21蛋白表达水平;双荧光素酶实验验证LINC00665和miR-34a-5p的靶向关系。结果:食管癌病人肿瘤组织LINC00665表达水平较癌旁组织明显增加,miR-34a-5p表达水平明显下降(P<0.01)。与对照组、siNC组相比,siLINC00665组细胞OD值(24、48 h)、侵袭和迁移数、CyclinD1、MMP-2蛋白、LINC00665表达均降低,p21蛋白、miR-34a-5p表达均增加(P<0.05);与siLINC00665+anti-NC组相比,siLINC00665+anti-miR-34a-5p组细胞OD值(24、48 h)、侵袭和迁移数、CyclinD1、MMP-2蛋白、LINC00665表达均增加,p21蛋白、miR-34a-5p表达均降低(P<0.05)。双荧光素酶实验证实LINC00665和miR-34a-5p靶向关系。结论:沉默LINC00665可靶向上调miR-34a-5p表达,进而抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭能力。

miR-34a抑制BCL-2激活NLRP1炎症小体诱导大鼠癫痫的发生

目的:探究miR-34a影响癫痫的相关机制。方法:通过MicroRNA微阵列芯片和RT-PCR分析miR-34a在癫痫大鼠中的表达量,并观察miR-34a与癫痫发作频率和脑电图的关系;预测miR-34a的靶基因,采用双荧光素酶报告基因实验观察其与靶基因的结合情况,观察过表达和抑制miR-34a对靶基因的影响,随后过表达和抑制靶基因,观察其对下游因子的影响,最终探究miR-34a影响癫痫的相关机制。结果:微阵列芯片和RT-PCR检测表明miR-34a在癫痫中呈高表达(P<0.05),miR-34a表达水平与癫痫发作频率呈正相关(R=0.783,P=0.003),抑制miR-34a的表达可明显减少癫痫的发作频率(P<0.05)。在线数据库TargetScan和miRDB显示miR-34a与BCL-2具有结合区域,双荧光素酶报告基因实验证明两者具有结合关系,当miR-34a过表达时,BCL-2表达量会下调,相反,当miR-34a抑制时,BCL-2表达量会上调。癫痫大鼠脑组织中NLRP1及下游相关因子Caspase-3、Caspase-1、IL-1β、IL-18高表达(P<0.05),当BCL-2抑制时,NLRP1及下游的相关因子表达量会更高,当BCL-2抑制时,结果则相反。结论:高表达的miR-34a通过抑制BCL-2,活化NLRP1炎症小体从而诱发癫痫发生。

膝关节骨性关节炎患者关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p表达水平及临床意义

目的 分析膝关节骨性关节炎(KOA)患者关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p的表达及其临床意义。方法 收集2020年1月—2022年6月武汉市第一医院骨科就诊的KOA患者90例的临床资料,按X线片Kellgren-Lawrence(KL)标准分级分为轻度KOA组(1~2级患者)和重度KOA组(3~4级患者),各45例,另选取同期医院健康体检者45例作为健康对照组。利用qRT-PCR检测各组关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p的表达量,通过ELISA法检测各组关节液中IL-1β的表达量,Spearman分析关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p表达水平与IL-1β、KL分级的相关性,受试者工作特征曲线(ROC)分析关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p表达对KOA严重程度的诊断价值。结果 膝关节液中miR-34a-5p、IL-1β表达水平比较,重度KOA组>轻度KOA组>健康对照组(F/P=19.21/<0.001、14.86/<0.001);膝关节液中miR-149-5p表达水平比较,重度KOA组<轻度KOA组<健康对照组(F/P=63.81/<0.001)。Spearman相关性分析显示,miR-34a-5p表达水平与IL-1β、KL分级呈显著正相关(r/P=0.835/<0.001、0.835/<0.001),miR-149-5p的表达水平与IL-1β、KL分级呈显著负相关(r/P=-0.828/<0.001、-0.943/<0.001)。ROC曲线分析显示,miR-34a-5p、miR-149-5p及二者联合预测KOA严重程度的曲线下面积分别为0.902、0.850、0.976,二者联合预测KOA严重程度的价值高于单项指标(Z/P=240.70/0.046,224.13/0.005)。结论 KOA患者关节液中miR-34a-5p、miR-149-5p的表达异常,且与KOA的临床分级和IL-1β显著相关,可作为诊断和监测KOA疾病活动的潜在标志物。

miR-34a-5p通过靶向IMP3、PD-L1对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的探究miR-34a-5p通过靶向胰岛素样生长因子ⅡmRNA结合蛋白3(IMP3)、程序性死亡配体-1(PD-L1)表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法利用Human Protein Atlas和GEPIA在线分析TCGA数据库和GTEx项目中乳腺癌及正常组织IMP3、PD-L1的表达水平、患者的预后生存期;qRT-PCR、Western blot检测160例患者乳腺癌组织及癌旁正常组织中miR-34a-5p、IMP3、PD-L1 mRNA与蛋白表达;Pearson检验分析miR-34a-5p分别与IMP3 mRNA、PD-L1 mRNA的相关性;免疫组化检测患者乳腺癌及正常组织IMP3、PD-L1、白细胞分化抗原44变异体6(CD44v6)的表达,分析IMP3、PD-L1表达水平与患者临床病理参数的关系;靶基因预测、双荧光素酶报告实验验证miR-34a-5p对IMP3、PD-L1的靶向调控作用。MCF7细胞分为control组、miR-NC组、miR-34a-5p组、miR-NC+pcDNA-NC组、miR-NC+IMP3组、miR-NC+PD-L1组、miR-34a-5p+pcDNA-NC组、miR-34a-5p+IMP3组和miR-34a-5p+PD-L1组,采用MTT法、克隆形成、划痕、Transwell小室实验测定细胞增殖活力、迁移、侵袭能力;Western blot检测IMP3、PD-L1、CD44v6、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达水平。结果生物数据库显示乳腺癌组织IMP3、PD-L1表达水平越高,患者生存期越短(P<0.05);qRT-PCR、Western blot结果显示,乳腺癌组织miR-34a-5p表达水平明显低于正常组织,IMP3、PD-L1 mRNA与蛋白表达水平明显高于正常组织,miR-34a-5p表达分别与IMP3 mRNA、PD-L1 mRNA呈明显负相关(P<0.05);免疫组化结果显示,乳腺癌组织IMP3、PD-L1、CD44v6呈阳性表达,且IMP3、PD-L1表达越高,TNM分期越晚,肿瘤分化程度越低、越容易发生淋巴结和远处转移(P<0.05);双荧光素酶实验验证了miR-34a-5p对IMP3、PD-L1的靶向调控作用;与control组和miR-NC组相比,miR-34a-5p组的细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低,E-cadherin蛋白表达明显升高,与miR-NC+pcDNA-NC组相比,miR-NC+IMP3组和miR-NC+PD-L1组细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9蛋白表达明显升高,E-cadherin蛋白表达明显降低,与miR-34a-5p+pcDNA-NC组相比,miR-34a-5p+IMP3组和miR-34a-5p+PD-L1组细胞活力、单克隆形成数目、划痕愈合率、细胞侵袭数目、IMP3、PD-L1、CD44v6、MMP-2、MMP-9水平升高,E-cadherin水平降低(P<0.05)。结论miR-34a-5p能够通过靶向调控IMP3、PD-L1表达抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质化(EMT)。