Circ_0072088靶向miR⁃377促进肝癌细胞进展的机制研究

目的研究环状RNA 0072088(circ_0072088)在肝癌细胞及异种移植瘤模型中的生物学功能,并探讨其参与调控肝细胞癌(HCC)发生进展的关键机制。方法培养人正常肝细胞(THLE⁃2)和HCC细胞系(Huh⁃7、Hep G2、Hep 3B),采用RT⁃qPCR方法检测circ_0072088、miR⁃377和含三方基序23基因(TRIM23)mRNA表达水平;Western blot检测TRIM23蛋白表达水平。取Hep G2细胞分为sh⁃NC组、sh⁃circ_0072088组、mimic NC组、miR⁃377 mimic组,Huh⁃7细胞分为mimic NC组、miR⁃377 mimic组和circ_0072088+miR⁃377 mimic组。分别采用CCK8法、克隆形成试验测定各组细胞的增殖能力变化情况;Transwell实验检测迁移能力变化情况;根据circ_0072088与miR⁃377的结合位点设计并合成了circ_0072088⁃WT和circ_0072088⁃MT双荧光素酶报告质粒,并分别与miR⁃377 mimic或mimic NC共转染Hep G2细胞后使用双荧光素酶报告试剂盒测量荧光素酶活性;RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)测定Ago2或IgG RIP复合物中circ_0072088和miR⁃377的富集水平。在异种移植瘤裸鼠模型中探讨circ_0072088的体内功能。结果circ_0072088在HCC中较瘤旁组织表达上调。与THLE⁃2细胞比较,HCC细胞系(Huh⁃7、Hep G2、Hep 3B)circ_0072088的mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(t=13.77、30.11、33.27,P均<0.001)。与sh⁃NC组比较,Hep G2转染sh⁃circ_0072088后细胞中circ_0072088 mRNA表达降低,差异有统计学意义(t=23.31,P均<0.001),细胞增殖活力(48、72 h)、克隆形成能力和迁移能力降低,差异均有统计学意义(t=11.78、8.42、12.64,P均<0.01),TRIM23蛋白表达水平明显降低。RIP检测结果显示,相对于lgG,circ_0072088(t=60.59)和miR⁃377(t=35.68)在Ago2免疫沉淀中富集,差异均有统计学意义(P均<0.001)。双荧光素酶检测结果显示,与转染mimic⁃NC组比较,转染miR⁃377 mimic组含有circ_0072088⁃WT质粒细胞的荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(t=21.88,P<0.001)。RT⁃qPCR及Western blot结果显示,与mimic NC组相比,miR⁃377 mimic组中TRIM23 mRNA(t=8.45,P<0.001)和蛋白表达水平明显降低。在异种移植瘤裸鼠模型中,与sh⁃NC组相比,sh⁃circ_0072088组移植的肿瘤体积减小,肿瘤组织中circ_0072088和TRIM23 mRNA表达降低,而miR⁃377 mRNA表达升高,差异有统计学意义(t=8.63、5.56、5.52、11.97,P均<0.001),TRIM23的蛋白水平下降。结论circ_0072088通过结合miR⁃377,间接上调TRIM23的表达,从而促进HCC细胞的增殖和迁移。

circDNMT1 调节 miR-377-3p/PUM1 轴对三阴性乳腺癌细胞增殖、凋亡和上皮-间质转化的影响

目的探讨circDNMT1调节miR-377-3p/PUM1轴对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖、凋亡和上皮-间质转化(EMT)的影响。方法收集儋州市人民医院2018年至2021年收治的24例TNBC患者的TNBC组织和其邻近正常组织,采用qRT-PCR、Western blot法分别检测组织及小鼠正常乳腺上皮细胞系HC11和TNBC细胞系4T1、Eph41424、JC中circDNMT1表达、miR-377-3p表达、PUM1蛋白表达。将4T1细胞分为4T1组(未转染)、si-NC组(转染si-NC)、si-DNMT1组(转染si-DNMT1)、si-DNMT1+anti-NC组(同时转染si-DNMT1和anti-NC)、si-DNMT1+anti-miR-377-3p组(同时转染si-DNMT1和anti-miR-377-3p),qRT-PCR检测各组4T1细胞中circDNMT1、miR-377-3p表达;CCK-8检测各组4T1细胞增殖情况;流式细胞术检测各组4T1细胞凋亡情况;Western blot检测各组4T1细胞PUM1、EMT相关蛋白及凋亡相关蛋白表达;TargetScan网站预测miR-377-3p与circDNMT1、PUM1的结合位点,双荧光素酶报告验证miR-377-3p与circDNMT1、PUM1的靶向关系。BALB/c小鼠接种4T1细胞后随机分为空白对照组(注射等量生理盐水)、阴性对照组(尾静脉注射si-NC)、DNMT1沉默组(尾静脉注射si-DNMT1)、联合对照组(尾静脉注射si-DNMT1和anti-NC)、联合沉默组(尾静脉注射si-DNMT1和anti-miR-377-3p),记录小鼠肿瘤质量,采用苏木精-伊红染色观察肿瘤形态变化。结果在TNBC组织和细胞中circDNMT1、PUM1上调,miR-377-3p下调,且在4T1细胞中表达差异最显著,因此本研究选择4T1细胞进行后续实验。与4T1组、si-NC组比较,si-DNMT1组4T1细胞中miR-377-3p表达、4T1细胞凋亡率及Bax、cleaved caspase-3、E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05),circDNMT1水平、PUM1蛋白表达水平、24 h和48 h OD值、Bcl-2蛋白表达水平、N-cadherin蛋白表达水平、Vimentin蛋白表达水平均显著减少/降低(P<0.05);与si-DNMT1组、si-DNMT1+anti-NC组比较,si-DNMT1+anti-miR-377-3p组4T1细胞中miR-377-3p表达、4T1细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平、cleaved caspase-3蛋白表达水平、E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05),PUM1蛋白表达水平、24 h和48 h OD值、Bcl-2蛋白表达水平、N-cadherin蛋白表达水平、Vimentin蛋白表达水平均显著增加/升高(P<0.05)。与miR-NC+WT-circDNMT1组比较,miR-377-3p mimic+WT-circDNMT1组细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05);与miR-NC+WT-PUM1组比较,miR-377-3p mimic+WT-PUM1组细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。空白对照组、阴性对照组小鼠肿瘤细胞排列密集,边界清晰;DNMT1沉默组、联合对照组肿瘤细胞排列疏松,胞核固缩,细胞碎片增多;联合沉默组小鼠肿瘤细胞排列比较密集,边界趋于清晰。与空白对照组、阴性对照组比较,DNMT1沉默组小鼠肿瘤质量显著减少(P<0.05);与DNMT1沉默组、联合对照组比较,联合沉默组小鼠肿瘤质量显著增加(P<0.05)。结论沉默circDNMT1可能通过上调miR-377-3p来抑制PUM1表达,进而抑制TNBC细胞增殖和EMT,促进细胞凋亡。

长链非编码RNA CCAT1靶向调控miR-377对前列腺癌PC3细胞生物学行为的影响

目的探讨长链非编码RNA CCAT1靶向调控miR-377对前列腺癌PC3细胞生物学行为的影响。方法选取前列腺癌组织78例为病理组,同时获取78例相邻的非恶性组织标本为癌旁组织,应用RT-PCR法测定2组标本miR-377、InRNA CCAT1表达水平,分析不同临床病理特征前列腺癌患者IncRNA RNA CCAT1、miR-377表达水平差异。设PC3前列腺癌细胞组、InRNA-NC组、InRNA CCAT1 mimics组、InRNA CCAT1 inhibitor组。培养72 h后,采用CCK-8测定法检测细胞增殖水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,transwell测定法评估细胞侵袭能力,RT-PCR法及蛋白印迹法测定细胞miR-377、InRNA CCAT1、RUNX1表达水平。结果病理组miR-377水平低于癌旁组,InRNA CCAT1水平高于癌旁组(P<0.05)。病理学分级越高、TNM分期越高、有淋巴血管间隙浸润、有淋巴结转移、有复发的前列腺癌患者miR-377表达水平越低,InRNA CCAT1表达水平越高(P<0.05)。与PC3前列腺癌细胞组、InRNA-NC组比较,InRNA CCAT1 mimics组细胞OD值、存活率、穿膜数、InRNA CCAT1、凋亡率升高,miR-377、RUNX1蛋白降低(P<0.05),InRNA CCAT1 inhibitor组细胞OD值、存活率、穿膜数、InRNA CCAT1、凋亡率降低,miR-3771、RUNX1蛋白升高(P<0.05);与InRNA CCAT1 mimics组比较,InRNA CCAT1 inhibitor组细胞OD值、存活率、穿膜数、InRNA CCAT1、凋亡率降低,miR-377、RUNX1蛋白升高(P<0.05)。结论InRNA CCAT1在前列腺癌组织中高表达,miR-377在前列腺癌组织中低表达,InRNA CCAT1、miR-377表达水平与前列腺癌患者临床病理特征具有一定相关性。InRNA CCAT1靶向抑制miR-377、RUNX1表达进而促进前列腺癌PC3细胞恶性生物学行为。

结肠癌患者血清miR-139-3p和miR-377-3p表达水平及肠道菌群的变化及其与复发转移的关系

目的分析结肠癌患者血清miR-139-3p和miR-377-3p表达水平与临床病理的关系、肠道菌群的变化及其与复发转移的关系。方法选取2019年3月至2021年3月入该院接受根治术治疗的结肠癌患者共126例作为结肠癌组,另选取同期在该院接受体检的体检健康者共83例作为健康对照组。观察两组血清miR-139-3p和miR-377-3p的表达水平及肠道菌群状态情况,对比不同临床特征的结肠癌患者血清指标表达水平,对比不同复发转移情况的结肠癌患者肠道菌群的变化情况,分析结肠癌患者血清miR-139-3p和miR-377-3p表达水平与其临床病理及肠道菌群表达的相关性。结果结肠癌组血清miR-139-3p和miR-377-3p较健康对照组均呈更高表达,差异有统计学意义(均P<0.05);结肠癌组术前、术后的双歧杆菌数量均低于健康对照组,大肠杆菌数量均高于健康对照组,差异有统计学意义(均P<0.05);结肠癌组中发生复发转移、低分化、临床分期处于Ⅲ期的患者血清miR-139-3p和miR-377-3p呈更高表达,差异有统计学意义(均P<0.05);Spearman相关系数分析显示,血清miR-139-3p、miR-377-3p表达水平与结肠癌患者临床分期、复发转移均呈正相关,与临床分化程度呈负相关(均P<0.05);复发转移组患者双歧杆菌数量较未复发转移组明显更低,大肠杆菌数量较未复发转移组相比明显升高,差异有统计学意义(均P<0.05);Pearson相关系数分析显示,血清miR-139-3p、miR-377-3p与结肠癌患者大肠杆菌数量呈正相关,上述两项指标与双歧杆菌数量呈负相关(均P<0.05)。结论结肠癌根治术后双歧杆菌属高表达和大肠杆菌属低表达意味着结肠癌患者复发转移风险更低,血清miR-139-3p和miR-377-3p与结肠癌患者临床分期、肿瘤分化程度、复发转移及肠道菌群变化均密切相关,后续临床针对结肠癌患者可通过监测上述两项血清指标及肠道菌群来辅助评估患者临床病情严重程度,对优化完善诊疗方案、降低患者复发转移风险具有积极作用。

山萘酚调控VPS9D1-AS1/miR-377-3p对人宫颈癌细胞系SiHa增殖和凋亡的影响

目的探讨山萘酚调控长链非编码RNAVPS9D1反义RNA 1(VPS9D1-AS1)/miR-377-3p对人宫颈癌细胞系增殖和凋亡的影响。方法将人宫颈癌细胞系SiHa分为对照组、山萘酚低、中和高剂量组(5、10和20μmol/L山萘酚)、si-NC组(转染si-NC)、si-VPS9D1-AS1组(转染si-VPS9D1-AS1)、山萘酚+pcDNA-VPS9D1-AS1组(20 mg/L山萘酚+转染pcDNA-VPS9D1-AS1)、山萘酚+anti-miR-377-3p组(20 mg/L山萘酚+转染anti-miR-377-3p)。RT-qPCR、MTT法和集落形成实验分别测定VPS9D1-AS1、miR-377-3p表达、细胞活性和集落形成;流式细胞测量术、划痕试验、Transwell小室法和Western blot分别测定细胞凋亡、迁移、侵袭和Bax及Bcl-2表达;荧光素酶活性检测分析VPS9D1-AS1对miR-377-3p的靶向作用。结果与对照相比,低、中和高剂量山萘酚降低SiHa细胞中VPS9D1-AS1表达水平,集落形成数、细胞活性、Bcl-2蛋白表达水平、迁移距离和侵袭细胞数,且提高了miR-377-3p表达水平、凋亡率和Bax蛋白表达水平;作用均呈浓度依赖性(P<0.05)。SiHa细胞中沉默VPS9D1-AS1后,miR-377-3p表达水平、凋亡率和Bax蛋白表达水平高于si-NC组,且集落形成数、Bcl-2蛋白表达水平、细胞活性、迁移距离和侵袭细胞数低于si-NC组(P<0.05)。VPS9D1-AS1能靶向miR-377-3p。山萘酚处理的SiHa增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响能被过表达VPS9D1-AS1或抑制miR-377-3p所逆转。结论山萘酚通过靶向miR-377-3p下调VPS9D1-AS1,减轻宫颈癌细胞系增殖、迁移和侵袭,以及加速凋亡。

结直肠癌患者血清miR-21-5p、miR-377-3p表达与Wnt/β-catenin信号通路和预后的关系分析

目的研究结直肠癌(CRC)患者血清微小RNA(miR)-21-5p、miR-377-3p表达及与Wnt/β-连环蛋白(catenin)通路及预后的关系。方法选取2017年1月—2018年1月中国人民解放军联勤保障部队第九八九医院肿瘤科收治的CRC患者92例作为CRC组,医院同期健康体检者60例作为健康对照组。检测血清miR-21-5p、miR-377-3p表达量及Wnt/β-catenin通路指标Wnt3a、β-catenin、c-myc、细胞周期素D1(Cyclin D1)mRNA表达量。Pearson相关分析miR-21-5p、miR-377-3p与Wnt3a、β-catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达的相关性。比较不同临床病理特征CRC患者血清miR-21-5p、miR-377-3p表达差异。Kaplan-Meier曲线及Logrank检验分析不同血清miR-21-5p、miR-377-3p表达CRC患者预后的差异。多因素Cox回归分析CRC患者预后的影响因素。结果与健康对照组比较,CRC组患者血清miR-21-5p、Wnt3a、β-catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达量显著升高,miR-377-3p表达量显著降低(t/P=29.202/<0.001、52.006/<0.001、45.973/<0.001、39.196/<0.001、23.119/<0.001、38.120/<0.001)。血清miR-21-5p与Wnt3a、β-catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达呈正相关(r/P=0.404/<0.001、0.410/0.002、0.529/<0.001、0.378/<0.001),miR-377-3p与Wnt3a、β-catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA表达呈负相关(r/P=-0.347/0.007、-0.408/<0.001、-0.450/<0.001、-0.419/<0.001)。TNM分期Ⅲ~Ⅳ期和伴淋巴结转移CRC患者血清miR-21-5p表达明显高于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移患者,而血清miR-377-3p表达明显低于TNM分期Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移患者,差异具有统计学意义(t/P=19.741/<0.001、18.534/<0.001、11.799/<0.001、17.639/<0.001)。血清miR-21-5p高表达患者3年生存率低于低表达患者(χ^(2)/P=17.700/<0.001),miR-377-3p低表达患者3年生存率低于高表达患者(χ^(2)/P=21.380/<0.001)。多因素Cox回归分析显示,肿瘤TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、伴淋巴结转移、miR-21-5p升高是CRC患者预后的独立危险因素[OR(95%CI)=1.875(1.322~2.662)、1.662(1.163~2.374)、1.847(1.366~2.500)],miR-377-3p升高是CRC患者预后的独立保护因素[OR(95%CI)=0.518(0.363~0.739)]。结论CRC患者血清miR-21-5p表达升高,miR-377-3p表达降低,两者可通过调控Wnt/β-catenin通路促进CRC的肿瘤进展,可作为辅助评估CRC患者预后的肿瘤标志物。

老年腔隙性脑梗死患者血清微小RNA-377和微小RNA-137水平及临床意义

目的分析老年腔隙性脑梗死(LI)患者血清微小RNA(miR)-377、miR-137水平及临床意义。方法选择2021年2月至2022年12月哈励逊国际和平医院收治的老年LI患者248例作为LI组,另选择同期来我院体检的健康者110例作为健康组;根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将老年LI患者248例分为神经缺损组60例(≥2分)和无神经缺损组188例(<2分)。检测血清miR-377、miR-137水平;用Pearson相关性分析和Spearman相关性分析;logistic回归分析老年LI患者神经缺损影响因素;ROC曲线评估血清miR-377、miR-137水平对老年LI及神经缺损诊断的预测价值。结果LI组血清miR-377、miR-137水平低于健康组(P<0.01)。miR-377和miR-137联合评估老年LI的曲线下面积(AUC)为0.782(95%CI:0.735~0.824),高于二者单一检测(P<0.01)。神经缺损组脑动脉硬化、血红蛋白降低、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)1、IL-6、IL-17、C反应蛋白(CRP)、改良的Rankin量表(mRS)评分高于无神经缺损组(P<0.05,P<0.01),血清miR-377、miR-137水平低于无神经缺损组(0.61±0.25 vs 0.89±0.28,0.61±0.24 vs 0.85±0.27,P<0.01)。血清miR-377与miR-137水平呈正相关(P<0.01);血清miR-377、miR-137水平与TNF-α、IL-6、CRP、mRS评分均呈负相关(P<0.01)。miR-377、miR-137、TNF-α、IL-6、CRP是老年LI患者神经缺损的影响因素(P<0.01)。miR-377、miR-137联合评估老年LI患者神经缺损的AUC为0.812(95%CI:0.758~0.859),高于二者单一检测(P<0.05,P<0.01)。结论血清miR-377、miR-137水平在老年LI及其神经缺损患者血清中表达较低,检测其水平具有一定临床预测价值。

血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与糖尿病性黄斑水肿程度的相关性

目的:探讨血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与糖尿病性黄斑水肿(DME)程度的相关性。方法:前瞻性研究。选取2021-02/2022-02三六三医院收治的初诊为DME患者60例60眼(如双眼发病取严重眼入组,若两眼程度一致取右眼),其中轻度24眼,中度21眼,重度15眼;另选同期本院收治的未发生DME的2型糖尿病患者60例60眼作为对照组。收集所有患者基本临床资料,包括BMI、吸烟史、饮酒史、高血压、高血脂、糖尿病病程、糖化血红蛋白、空腹血糖、Hcy;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平。结果:DME组患者糖尿病病程、糖化血红蛋白、空腹血糖、同型半胱氨酸(Hcy)均显著高于对照组(均P<0.05);DME组患者血清中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平均低于对照组(均P<0.05);重度组患者血清和房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平显著低于中度组和轻度组,中度组显著低于轻度组(均P<0.05);血清中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与CMT呈负相关(r=-0.342、-0.374,均P<0.05),房水中miR-377-3p和miR-365-3p表达水平与CMT呈负相关(r=-0.425、-0.503,均P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,糖尿病病程、空腹血糖及Hcy是2型糖尿病患者发生DME的危险因素,血清中miR-377-3p和miR-365-3p是2型糖尿病患者发生DME的保护因素(P<0.05)。结论:DME患者血清和房水中miR-377-3p、miR-365-3p均低表达,并与DME患者严重程度呈负相关。

苦瓜皂苷调控circ_0008274/miR-377对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨苦瓜皂苷对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能作用机制。方法:体外培养结肠癌细胞Caco-2,分为对照组、苦瓜皂苷L组、苦瓜皂苷M组、苦瓜皂苷H组、si-NC组、si-circ_0008274组、苦瓜皂苷H+pcDNA-circ_0008274组;MTT法、平板克隆实验、流式细胞术分别检测细胞增殖、克隆形成及凋亡;qRT-PCR法检测circ_0008274、miR-377的表达量;双荧光素酶报告实验检测circ_0008274与miR-377的靶向关系。结果:与对照组比较,苦瓜皂苷L组、苦瓜皂苷M组、苦瓜皂苷H组细胞增殖抑制率、miR-377的表达量、细胞凋亡率升高(P<0.05),克隆形成数减少(P<0.05),circ_0008274的表达量降低(P<0.05);与si-NC组比较,si-circ_0008274组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率升高(P<0.05),克隆形成数减少(P<0.05);circ_0008274可靶向调控miR-377的表达;与苦瓜皂苷H组比较,苦瓜皂苷H+pcDNA-circ_0008274组miR-377的表达量、细胞增殖抑制率、细胞凋亡率降低(P<0.05),克隆形成数增多(P<0.05)。结论:苦瓜皂苷可通过抑制circ_0008274表达而促进miR-377表达来诱导结肠癌细胞凋亡、抑制细胞增殖。

CircCPA4调节miR-377-3p/GGA3轴对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的 探讨CircCPA4调节miR-377-3p/GGA3轴对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法 qRT-PCR、Western blot分别检测肺癌组织、相邻正常组织、人肺癌A549细胞、人正常肺上皮细胞BEAS-2B中CircCPA4、miR-377-3p、GGA3表达;将A549细胞分为NC组(未做任何处理)、si-NC组(转染si-NC)、si-CircCPA4组(转染si-CircCPA4)、si-CircCPA4+inhibitor NC组(转染si-CircCPA4+inhibitor NC)、si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor组(转染si-CircCPA4+miR-377-3p inhibitor)。双荧光素酶报告基因实验检测CircCPA4、miR-377-3p、GGA3的关系;qRT-PCR检测A549细胞中CircCPA4、miR-377-3p表达;CCK-8法检测A549细胞增殖情况;流式细胞术检测A549细胞凋亡;Transwell检测A549细胞侵袭、迁移数量;Western blot检测A549细胞GGA3、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的蛋白水平。结果 在肺癌组织和肺癌A549细胞中CircCPA4、GGA3水平显著上调(P<0.05),miR-377-3p表达量显著下调(P<0.05)。与NC组、si-NC组比较,si-CircCPA4组A549细胞OD_(450)值、迁移、侵袭细胞数量、CircCPA4表达量、GGA3、N-cadherin、Vimentin蛋白水平显著下降(P<0.05),A549细胞凋亡率、miR-377-3p表达量、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);而miR-377-3p表达下调消除了沉默CircCPA4对A549细胞恶性生物学行为的抑制作用;CircCPA4靶向调节miR-377-3p/GGA3轴。结论 沉默CircCPA4可能通过上调miR-377-3p来抑制GGA3表达,抑制A549细胞增殖、EMT,促进细胞凋亡。

miR-377-5p通过下调VEGF-C对结肠癌的血管和淋巴管生成的影响研究

目的探讨miR-377-5p通过下调VEGF-C对结肠癌的血管和淋巴管生成的影响研究。方法该实验分为3组,miR-377-5p干扰组、miR-377-5p阴性对照组和miR-377-5p过表达组。采用实时荧光RT-PCR、Western blot、CCK-8、流式细胞、细胞划痕、Transwell、血管生成实验检测miR-377-5p m RNA和蛋白表达、细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管和淋巴管生成。结果与正常结肠组织对比,结肠癌组织中miR-377-5p m RNA和miR-377-5p蛋白的表达明显低于正常结肠组织(均P<0.05);与miR-377-5p干扰组相比,miR-377-5p阴性对照组和miR-377-5p过表达组中的m RNA及蛋白显著升高(均P<0.05),与miR-377-5p阴性对照组相比,miR-377-5p过表达组的m RNA及蛋白明显增加(P<0.05);与miR-377-5p干扰组相比,miR-377-5p阴性对照组和miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞增殖能力明显降低(P<0.05),与miR-377-5p阴性对照组相比,miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞增殖能力显著降低(P<0.05);与miR-377-5p干扰组相比,miR-377-5p阴性对照组和miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞增殖凋亡明显升高(P<0.05),与miR-377-5p阴性对照组相比,miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞凋亡能力显著升高(P<0.05);伤口愈合实验显示,miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞的迁移能力显著低于miR-377-5p干扰组和miR-377-5p阴性对照组(P<0.05);miR-377-5p过表达组的结肠癌细胞的侵袭能力也明显低于miR-377-5p干扰组和miR-377-5p阴性对照组(P <0.05);miR-377-5p过表达组的VEGF-A、VEGF-C和P-Akt、VEGFR-3蛋白水平显著低于miR-377-5p干扰组和miR-377-5p阴性对照组(P<0.05);miR-377-5p过表达组的MVD(微血管密度)和LMVD(淋巴微血管密度)显著低于miR-377-5p干扰组和miR-377-5p阴性对照组(P<0.05)。结论 miR-377-5p在结肠癌中低表达,抑制了结肠癌细胞的增殖、细胞迁移和侵袭,促进了结肠癌细胞的凋亡能力,并直接靶向VEGF-C抑制肿瘤的血管和淋巴管生成。

miR-377-3p对前列腺癌细胞增殖和凋亡影响的分子机制研究

目的探讨miR-377-3p在多种前列腺癌细胞系中的表达及对前列腺癌细胞增殖和凋亡的影响,以及其可能的分子机制。方法通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-377-3p在正常前列腺细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系LNCaP、PC-3和DU-145中的表达,选取其中两种表达miR-377-3p最少的LNCaP和PC-3为对象,分为两组:对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-377-3p)。细胞计数试剂盒(CCK-8)实验和克隆形成实验检测前列腺癌细胞活力和增殖能力。流式细胞术检测细胞凋亡情况。miRNA靶基因预测软件预测miR-377-3p可能的靶基因。qRT-PCR检测p21活化蛋白激酶2(PAK2)基因的表达。Western blotting法检测PAK2、p-Akt和p-ERK蛋白的表达情况。结果 miR-377-3p在前列腺癌细胞系中的表达量均低。实验组细胞活力明显被抑制,增殖能力明显降低。实验组细胞凋亡显著增加。实验组PAK2 mRNA及其蛋白的表达明显降低,PAK2mRNA在LNCaP细胞中对照组和实验组的表达量分别为(1.00±0.10)和(0.60±0.23)(P<0.05),在PC-3细胞中对照组和实验组的表达量分别为(1.01±0.14)和(0.46±0.14)(P<0.01)。p-Akt和p-ERK蛋白表达明显降低。结论 miR-377-3p在多种前列腺癌细胞系中呈低表达,抑制前列腺癌细胞系LNCaP和PC-3的增殖能力,促进细胞凋亡,其可能的分子机制是靶向抑制PAK2基因,可能成为具有前列腺癌靶向治疗意义的分子。

探究外泌体hsa-miR-377在糖尿病肾病中的表达及其相关临床意义

目的本研究旨在探究糖尿病肾病患者和健康体检者血液样本中外泌体hsa-miR-377的表达量,以表明其参与糖尿病肾病的致病过程中。方法本研究通过收集临床糖尿病肾病患者和健康体检者的血液样本进行外泌体分离鉴定,通过透射电子显微镜对血液样本获得的离心小球进行分析,再进行RT-PCR分析外泌体中小RNA分子的表达。结果TEM发现糖尿病肾病的血液样本中存在外泌体,且外泌体形态在镜下很明显,RT-PCR对外泌体中小RNA分子的表达结果显示外泌体中hsa-miR-377的表达量(0.65±0.05)普遍高于正常体检者血液样品(0.29±0.05)(P<0.01)。结论外泌体hsa-miR-377可能参与糖尿病肾病的致病过程,且可能是糖尿病肾病的一个潜在诊断标志物。

豆根管食通口服液对食管鳞癌细胞miR-377的影响研究

目的观察豆根管食通口服液对食管鳞癌细胞株KYSE450的细胞增殖、细胞凋亡及对miR-377、CD133和VEGF表达的影响。方法先制备豆根管食通口服液含药血清,然后分为高中低三个浓度,分别作用24 h、48 h、72 h,筛选出最佳浓度和最佳作用时间,然后将KYSE450细胞株分为空白组、豆根管食通中剂量组、氟尿嘧啶组。采用MTT方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞增殖的影响,采用流式细胞仪检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞凋亡的影响,采用RT-PCR方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞miR-377的影响,采用WB方法检测豆根管食通口服液含药血清对KYSE450细胞CD133和VEGF表达的影响。结果筛选出最佳浓度为豆根管食通中剂量组,最佳作用时间为48 h;MTT结果显示,豆根管食通口服液对KYSE450细胞能够明显抑制细胞增殖,豆根管食通口服液含药血清中剂量组的细胞凋亡率为(18.8±2.66)%,高于空白组(P <0.01),促进miR-377表达,与空白对照组相比(P <0.05),抑制CD133表达(P <0.05),抑制VEGF表达(P <0.01)。结论豆根管食通口服液对食管鳞癌KYSE450细胞株有抗增殖、促凋亡的作用,其机制可能是通过上调miR-377的表达,进而抑制CD133和VEGF表达。

miR-377介导Syk对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化病变的影响

目的研究微小RNA-377(miR-377)介导脾酪氨酸激酶(Syk)对基因敲除(ApoE-/-)小鼠动脉粥样硬化病变的影响。方法将实验对象分为对照组(ApoE-/-小鼠)、miR-377组(注入miR-377的ApoE-/-小鼠)、Syk组(注入Syk的ApoE-/-小鼠)和Syk+miR-377组(注入miR-377和Syk的ApoE-/-小鼠)。通过制备miR-377和Syk质粒注入到ApoE-/-小鼠,通过qPCR和Western blot检测ApoE-/-小鼠Syk mRNA和蛋白的表达,检测炎症因子和脂质、氧化物歧化酶的水平。通过HE染色和油红O染色检测miR-377对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化主动脉斑块和表面积的影响。结果miR-377组的Syk mRNA相对表达明显低于对照组,miR-377组的Syk蛋白水平表达明显低于对照组。Syk组TNF-α水平明显低于对照组和miR-377组。miR-377组的1L-6水平明显高于对照组,Syk组和miR377+Syk组低于对照组。miR-377组的1L-1β水平明显低于对照组。miR-377组的TC水平明显低于对照组,Syk组的1L-1β水平高于对照组和miR-377组。miR-377组的LDL水平明显低于对照组,miR-377组的HDL水平明显低于对照组,Syk组的HDL水平明显高于对照组和miR-377组。miR-377组SOD的水平明显高于对照组。对照组、Syk组有明显的主动脉斑块,经过miR-377处理过的miR-377组和miR377+Syk组未见明显的主动脉斑块。miR-377处理的ApoE-/-小鼠,动脉粥样硬化斑块面积显著减少。syk处理的ApoE-/-小鼠斑块面积增加。对照组的硬化斑块面积/总面积之比为25.63%,miR-377组中为7.81%,Syk组为35.19%,Syk+miR-377组为9.73%。结论Syk基因的过表达会导致动脉粥样硬化细胞脂质的积累和氧化应激的增加,miR-377能够通过抑制Syk基因的表达来调控动脉粥样硬化的发展。

卵巢癌组织中miR-377的表达及其与临床病理参数的关系

目的:考察卵巢癌组织中miR-377的表达,分析miR-377表达与临床病理参数及预后的相关性。方法:收集卵巢癌组织及同期正常卵巢组织标本各50例,分别设为卵巢癌组及对照组,并收集病人临床病理参数资料。采用RT-qPCR技术检测2组样本的中miR-377的表达水平,分析miR-377与卵巢癌病人相关临床病理参数的关系,采用生存曲线图分析miR-377表达与预后的关系,并采用多因素COX回归分析卵巢癌预后的独立危险因素。结果:卵巢癌组miR-377表达低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。卵巢癌组miR-377表达与肿瘤的TNM分期、临床分期、是否转移有关(P<0.05~P<0.01),与病人的年龄、卵巢癌类型等临床病理参数无关(P>0.05)。miR-377低表达者5年总生存率55.88%显著低于高表达者75.00%(P<0.01)。多因素COX回归分析显示,miR-377低表达与TNM分期是卵巢癌预后的独立危险因素(P<0.01)。结论:miR-377在卵巢癌病人组织中的表达显著降低,miR-377表达水平与卵巢癌病人的TNM分期、临床分期及病理分级有关,且miR-377低表达与TNM分期可视为卵巢癌预后的独立危险因素。

bta-miR-377靶向调控牛下丘脑CART基因表达的研究

【目的】分析bta-miR-377与牛卵泡发育的关键调控因子可卡因-苯丙胺调节转录肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)间的靶标关系,明确bta-miR-377对牛CART表达影响的作用机制。【方法】本研究通过生物信息学手段预测bta-miR-377与牛CART基因mRNA的结合位点,并对miR-377在不同物种间的序列保守性进行分析;利用双荧光素酶报告基因法验证bta-miR-377与CART基因的靶标关系;选择3头健康西门塔尔母牛,采集其下丘脑组织,分析bta-miR-377和CART基因在牛下丘脑中的内源表达情况;以PC12和293T细胞为模型进行细胞功能验证,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测分别转染bta-miR-377 mimics和NC mimics后的PC12细胞中CART基因mRNA和293T细胞中CART蛋白表达丰度变化。【结果】bta-miR-377在CART 3′-UTR上存在靶向结合位点,并能极显著下调CART 3′-UTR野生型重组双荧光质粒的相对荧光活性(P<0.01),且结合位点序列在多个物种中高度保守;在牛与大鼠间,miR-377种子区序列保守性较低;bta-miR-377和CART在牛下丘脑中均有表达;过表达bta-miR-377 mimics能够极显著下调CART基因mRNA的表达(P<0.01),显著下调CART蛋白的表达(P<0.05),bta-miR-377与CART的表达存在负相关关系。【结论】bta-miR-377和CART在牛下丘脑组织中均有表达,bta-miR-377能够通过与CART 3′-UTR特异性结合抑制PC12细胞中CART mRNA的表达。

bta-miR-377琼脂糖凝胶电泳条件优化

bta-miR-377与下丘脑分泌的可卡因苯丙胺调节转录肽(Cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)存在靶向结合关系。为分析bta-miR-377在牛下丘脑组织中的表达情况,为后续探讨bta-miR-377与CART相互作用进而影响牛卵泡发育的作用机制奠定基础,经Trizol法提取牛下丘脑总RNA,采用茎环结构法设计特异性引物,并利用半定量RT-PCR技术克隆bta-miR-377,观察不同条件琼脂糖凝胶电泳后Marker和目的条带的分离情况,其中凝胶浓度为2.0%、2.5%;电压为100、80 V;时间为40、60、80 min;同时通过Image J软件对不同条件下获得的bta-miR-377条带进行灰度值分析,结合电泳结果确定最佳分离条件。结果显示,利用茎环结构法能够达到延长bta-miR-377片段的目的,且特异性强;凝胶浓度为2.5%、电压为80 V、时间为80 min时,bta-miR-377条带分离效果好且表达量高,该条件下条带的灰度值与其他组相比差异显著,与电泳分析结果一致,说明低浓度凝胶的分辨率低,长时间高压会导致DNA降解进而使条带弥散,而适当电压下电泳时间过短会使DNA分子无法聚集而使条带过宽,说明适宜的电泳条件是鉴定目的 miRNA表达的关键。综上可见,bta-miR-377在牛下丘脑中有表达,丰富了动物生殖生理学中下丘脑-垂体-性腺轴的内分泌调控理论。

miR-377靶向ZEB2调节结肠癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化

目的:探讨miR-377对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响及潜在作用机制。方法:RT-qPCR检测结肠癌细胞系HT29、SW480、SW620和HCT116和人小肠上皮细胞HIEC miR-377表达。将miR-377 mimic、阴性对照物、pmirGLO-wt-ZEB2、pmirGLO-mut-ZEB2转染至HCT116细胞,双荧光素酶报告实验检测miR-377与ZEB2的靶向作用,伤口愈合实验、Transwell、Western blot检测miR-377和ZEB2对细胞迁移、侵袭、上皮-间质转化相关蛋白表达的影响。结果:与HIEC细胞相比,结肠癌细胞系miR-377表达降低(P<0.05)。与对照组相比,miR-377 mimic和pmirGLO-WT-ZEB2共转染的HCT116细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05),但ZEB2结合位点突变逆转了miR-377 mimic对荧光素酶活性的抑制作用(P>0.05);miR-377 mimic显著降低了HCT116细胞ZEB2蛋白表达(P<0.05)。与NC+Vector组相比,miR-377+Vector组细胞划痕愈合率、侵袭细胞数显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著升高(P>0.05),N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著降低(P<0.05)。与miR-377+Vector组相比,miR-377+ZEB2组细胞划痕愈合率、侵袭细胞数显著高于miR-377+Vector组(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著降低(P<0.05),N-cadherin、Vimentin蛋白表达显著升高(P<0.05),miR-377+ZEB2组与NC+Vector组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:miR-377通过靶向作用于ZEB2调节结肠癌细胞上皮-间质转化相关蛋白表达,进而影响结肠癌细胞迁移、侵袭,为结肠癌临床治疗提供了新的策略。

miR-377-5p通过下调HIF-1α及其相关VEGF信号通路抑制肝细胞癌HepG2细胞的增殖和侵袭

目的:探讨miR-377-5p与缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)的靶向关系以及通过控血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信号通路对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞增殖、侵袭和EMT的调控作用。方法:qPCR检测35例人HCC组织及癌旁组织标本中miR-377-5p的表达水平。将HepG2细胞分为对照组、mimic NC组、miR-377-5p mimic组,qPCR检测转染效率;EdU染色、Transwell和Western blotting(WB)检测miR-377-5p过表达对HepG2细胞增殖、侵袭及其增殖相关蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志蛋白E-cadherin、N-cadherin表达的影响;qPCR、WB检测miR-377-5p过表达对HepG2细胞中,缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)表达的影响。荧光素酶报告基因实验验证miR-377-5p与HIF-1α基因的靶向关系。结果:HCC组织中miR-377-5p表达水平较癌旁组织降低(P<0.01)。与对照组相比,miR-377-5p mimic组HepG2细胞中miR-377-5p水平明显升高,细胞的增殖、侵袭能力降低(均P<0.01),EMT、N-cadherin表达水平降低(均P<0.01)而E-cadherin表达水平显著升高(P<0.01);miR-377-5p mimic组中HIF-1αmRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.01或P<0.05)。miR-377-5p靶向抑制HIF-1α基因表达,并抑制VEGF通路的激活(均P<0.05)。结论:miR-377-5p通过靶向抑制HIF-1α基因表达和下调VEGF信号通路从而抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和EMT。