miR-71通过IL-23/Th17信号通路对人胃早癌肿瘤浸润免疫细胞的影响

目的探讨mi R⁃71表达通过IL⁃23/Th17信号通路对人胃早癌肿瘤浸润免疫细胞的影响,以期为胃癌的早发现早治疗提供新的靶点。方法抽取我院胃早癌患者的血清作为胃癌组和健康者的血清作为对照组组,采用荧光定量PCR实验测定血清中miR⁃71的mRNA表达;采用HE染色法检测人胃早癌肿瘤免疫细胞浸润情况及并依据浸润情况分级;采用免疫组化法检测人胃早癌巨噬细胞和CD8+T细胞的浸润情况;采用western blot和蛋白免疫组化染色法检测miR⁃71表达对IL⁃23/Th17信号通路的影响。结果胃癌组TEMⅠ期和TEMⅡ期患者血清miR⁃71的mRNA表达相较对照组组极显著下调(P<0.01)。在癌巢中央、癌巢周边和远离癌巢处均可见肿瘤免疫细胞分布,根据免疫细胞不同浸润深度分为T1⁃T4级,发现胃癌患者的miR⁃71血清表达水平与免疫细胞浸润分级呈负相关趋势。CD8+T细胞和巨噬细胞也分布于癌内、癌周和远处,且巨噬细胞和CD8+T细胞数目:癌周>远处>癌内。TEMⅠ期组和TEMⅡ期组JAK⁃2和IL⁃23R蛋白表达水平相较对照组组极显著上调(P<0.01)。结论miR⁃71血清表达水平与人胃早癌肿瘤免疫细胞浸润深度呈负相关,而其机制与激活IL⁃23/Th17信号通路有关,有望作为胃早癌的生物分子诊断标志物。

miR-305-3p和miR-71-5p通过调控谷胱甘肽代谢途径参与斜纹夜蛾应对植物次生物质

昆虫和植物在长期进化过程中形成相互作用的关系。其中植物次生物质是植物防御昆虫的主要机制,而昆虫则以解毒酶来应对。为了发现可用于害虫防治的miRNA,通过对农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura进食芥菜Brassica juncea后中肠的测序分析,获得了一系列差异表达的miRNA。通过生物信息学分析,发现斜纹夜蛾miR-305-3p靶向了谷胱甘肽代谢中的谷氨酸半胱氨酸连接酶的催化亚基(Slgclc),这是一个谷胱甘肽从头合成的限速酶;而miR-71-5p靶向调控gclc和解毒酶表达的转录因子SlNrf2。用芥菜的次生物质吲哚-3-甲醇处理斜纹夜蛾Spli-221细胞株后,实时荧光定量PCR证明Slgclc和SlNrf2表达上调,miR-305-3p和miR-71-5p表达下调。分别在斜纹夜蛾Spli-221细胞中超表达miR-305-3p及miR-71-5p mimics,Slgclc或SlNrf2转录水平下调,并且miR-71-5p mimic处理抑制了SlNrf2下游基因Slgclc和解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的表达。结果表明:miR-305-3p和miR-71-5p响应植物次生物质而分别促进Slgclc和SlNrf2表达。然而双荧光素酶实验显示miR-305-3p并不与Slgclc直接结合,miR-71-5p也不与SlNrf2直接结合,推测miR-305-3p和miR-71-5p可能间接调控Slgclc和SlNrf2的表达。研究结果表明,斜纹夜蛾miR-305-3p和miR-71-5p通过调控解毒酶GSTs表达及其底物谷胱甘肽的生成,而参与昆虫抵抗植物次生物质。

细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征分析

目的分析在胰岛素、阿苯达唑和人工胃液刺激下,细粒棘球蚴原头节miR-71的分泌表达特征。方法从新疆屠宰场采集绵羊肝、肺细粒棘球蚴包囊,经固定、包埋及切片后,用miR-71探针进行杂交。与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗Digoxin抗体(Anti-Digoxin-FITC)作用,经4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核酸染料染色后,在荧光显微镜下观察miR-71在包囊壁和原头节中的定位,分析miR-71在原头节中的分布,确定miR-71在原头节中的表达情况。在人工胃液(人工胃液组)、胰岛素(胰岛素组)或阿苯达唑(阿苯达唑组)等不同条件下培养原头节,收集上清并用差速离心法分离外泌体,采用透射电镜观察外泌体形态结构,利用纳米粒径分析仪测定外泌体的粒径分布;利用外泌体生物标志分子烯醇化酶和14-3-3蛋白的抗体蛋白质免疫印迹(Western blotting)鉴定外泌体;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测外泌体中miR-71的丰度。结果原位杂交结果显示,miR-71在囊壁生发层和原头节中均有表达。人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体粒径分别为48.9、49.7和65.4 nm,均在40~120 nm内;外泌体形态呈由膜包裹的球形。Western blotting从外泌体中检出烯醇化酶和14-3-3蛋白,表明外泌体提取成功。qPCR结果显示,人工胃液组、胰岛素组和阿苯达唑组原头节分泌的外泌体中,miR-71的表达量分别是其对照组的1.84、1.87和2.38倍(t=12.8、26.7、29.3,均P<0.01)。结论miR-71在细粒棘球蚴囊壁和原头节中广泛表达,且可以通过外泌体进行分泌;经胰岛素、人工胃液和阿苯达唑刺激后其分泌表达水平升高。

egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白组的差异表达分析

为了探究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)来源的miR-71(egr-miR-71)对绵羊外周血单核细胞(PBMCs)蛋白组的影响。本研究使用密度梯度离心法分离得到绵羊PBMCs,并使用电穿孔法将egr-miR-71转染至绵羊PBMCs,用qPCR检测转染效率。基于iTRAQ方法,对比分析egr-miR-71过表达对绵羊PBMCs蛋白表达的影响,通过qPCR和Western-blotting对骨髓源性生长因子(MYDGF)转录水平和翻译水平进行验证。结果显示,绵羊PBMCs转染egr-miR-71模拟物后,miR-71的相对表达量极显著上调(P<0.01)。利用iTRAQ共鉴定出7642个蛋白质,其中157个呈差异表达,与对照组相比,68个蛋白显著上调,89个蛋白显著下调。下调的蛋白主要包括巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)、MYDGF、酰基辅酶A结合蛋白(ACBP)和碳酸酐酶(CAs)等。这些差异蛋白主要参与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、转化生长因子-β(TGF-β)等信号通路。qPCR和Western-blotting结果显示,与对照组相比,模拟物转染组中MYDGF转录和翻译水平均显著下调(P<0.05)。通过对转染egr-miR-71后绵羊PBMCs的蛋白进行组学分析,初步了解了egr-miR-71对绵羊PMBCs表达蛋白的调控,鉴定出的差异蛋白可能在细粒棘球蚴与宿主互作中发挥重要作用。这为深入研究细粒棘球绦虫的感染机制提供了思路,也为新型抗包虫病药物的研发提供了理论依据。

细粒棘球绦虫miR-71对绵羊外周血单核细胞的免疫调节作用

为了探究细粒棘球绦虫来源的miR-71(egr-mi R-71)对绵羊外周血单核细胞(PBMCs)的免疫调节作用,利用egr-mi R-71模拟物和阴性对照分别转染绵羊PBMCs,通过qPCR分析了对绵羊PBMCs中细胞因子和LPS/TLR4信号通路中关键基因表达的影响,并且还利用Griess试剂测定了NO的分泌水平。结果显示,egr-mi R-71的过表达会显著上调CD14,为阴性对照组的2.21倍(P<0.01),但IL-1α、IL-1β、TNF-α的表达则显著下调,分别是阴性对照组的74%、59%和76%(P<0.05)。NO的测定结果还显示,egr-mi R-71能明显促进NO的生成(P<0.05)。以上结果提示,egr-mi R-71对绵羊PBMCs具有免疫调节作用。

miR-34b调控肠道病毒71型在人横纹肌肉瘤细胞中的复制及机制

【背景】研究发现microRNAs(miRNAs)可以参与调控病毒在宿主细胞内感染和复制的过程。【目的】研究miR-34b对肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)在宿主细胞内的复制及其可能机制。【方法】在人横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中转染miR-34b mimics和Inhibitor,通过Western blot和Real-time PCR实验检验EV71病毒的复制和表达情况。随后利用双荧光素酶报告系统验证miR-34b与潜在靶点eIF4E的相互作用,并检测miR-34b对RD细胞中eIF4E mRNA表达水平的影响。【结果】miR-34b可以促进病毒在RD细胞中的复制和表达,而miR-34b抑制剂有抑制病毒复制的作用,细胞内miR-34b可以通过作用于靶基因eIF4E调控EV71在宿主细胞中的复制过程。【结论】揭示了miR-34b在EV71病毒复制过程中的调控作用及机制,研究EV71病毒与宿主miRNAs的相互作用机制为进一步阐明EV71病毒感染与复制机理奠定了基础。

人免疫球蛋白注射剂治疗肠道病毒71型手足口病患儿的临床研究

目的观察人免疫球蛋白注射剂(IVIG)治疗不同严重程度肠道病毒71型(EV71)手足口病(HFMD)患儿的临床疗效及安全性。方法选取124例EV71型HFMD患儿作为试验组,并按病情严重程度分为中枢神经系统受累组(MS组)40例、自主神经功能紊乱组(MD组)46例及神经源性肺水肿组(PE组)38例,选取同期普通手足病患儿32例作为对照组。对照组给予常规治疗;试验组在对照组治疗的基础上,给予2 g·kg-1 IVIG,连续静脉滴注2 d。用实时荧光聚合酶链反应法测定血清miR-155的表达水平,用流式细胞术检测外周血中T淋巴细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)比例。比较4组患儿的临床疗效,以及药物不良反应的发生情况。结果治疗后,MS组、MD组、PE组和对照组的总有效率分别为87.50%(35例/40例),86.96%(40例/46例),78.95%(30例/38例)和90.63%(29例/32例),差异均无统计学意义(均P>0.05)。治疗前,MS组、MD组、PE组和对照组的miR-155表达水平分别为2.04±0.71,3.41±1.16,5.10±1.64和1.12±0.43,Th17/Treg比值分别为0.18±0.04,0.27±0.06,0.51±0.09和0.14±0.04,MS组、MD组、PE组的上述指标与对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗后7 d,MS组、MD组、PE组和对照组的miR-155表达水平分别为0.98±0.40,1.74±0.55,2.07±0.61和0.96±0.37,Th17/Treg比值分别为0.07±0.02,0.08±0.02,0.09±0.03和0.07±0.02,PE组的上述指标与MS组和对照组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。4组患者治疗期间均未发生药物不良反应。结论EV71型HFMD患儿的血清miR-155表达水平和Th17/Treg比值随病情严重程度的增加而逐渐升高;IVIG可降低EV71型HFMD患儿的血清miR-155表达水平,调整患儿体内Th17/Treg平衡紊乱的情况。

多房棘球蚴成体未分化细胞的鉴定及其分布特征

利用有丝分裂分子标志———组蛋白H3(Ser10)标记多房棘球蚴成体未分化细胞(neoblast)。同时,利用成体未分化细胞可能的分子标志———miR-71和AGO-2,通过原位杂交方法分析其表达特征。结果显示,多房棘球蚴组蛋白H3阳性细胞没有明显的组织分布特征,而且数量少;AGO-2阳性细胞在组织分布和数量上与组蛋白H3阳性细胞相似,而miR-71阳性细胞在原头蚴中分布广泛,并且在不同发育阶段的原头蚴中miR-71的表达水平存在明显差异。这些研究结果表明,miR-71分子在多房棘球蚴成体未分化细胞中呈非特异表达,不能作为鉴定它的分子标志。