真武汤介导lncRNA NEAT1/miR-31-5p/IGFBP7分子轴抑制慢性心力衰竭进程的机制研究

目的:探讨真武汤通过lncRNA NEAT1/miR-31-5p/IGFBP7分子轴抑制慢性心力衰竭(CHF)进程的机制。方法:将雄性SD大鼠分为对照组、模型组、阳性对照组和真武汤低、中、高剂量组,每组各10只。除对照组外,其余各组采用腹腔注射阿霉素的方法建立CHF模型,阳性对照组给予美托洛尔灌胃,真武汤低、中、高剂量组给予真武汤(生药含量6、12、18 g/kg)灌胃。检测各组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(LVFS),血清脑钠肽(BNP)水平,心脏体重比,心肌病理改变,心肌中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平及lncRNA NEAT1、miR-31-5p、IGFBP7表达水平。培养大鼠心肌H9c2细胞,采用双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA NEAT1靶向miR-31-5p、miR-31-5p靶向IGFBP7。结果:与模型组比较,真武汤低、中、高剂量组的LVEF、LVFS增加,血清BNP水平降低(P<0.05);与模型组比较,真武汤低、中、高剂量组的心肌TNF-α、IL-1β、MDA水平降低,SOD水平增加(P<0.05);与模型组比较,真武汤低、中、高剂量组的心肌lncRNA NEAT1、IGFBP7表达降低,miR-31-5p表达增加(P<0.05)。H9c2心肌细胞中,lncRNA NEAT1靶向miR-31-5p、miR-31-5p靶向IGFBP7。结论:真武汤可能通过lncRNA NEAT1/miR-31-5p/IGFBP7分子轴改善CHF大鼠心功能并减轻炎症反应、氧化应激反应。

慢病毒介导miR-140-5p过表达对内毒素诱导大鼠肝损伤的保护作用

目的:探究慢病毒介导miR-140-5p过表达对内毒素诱导大鼠肝损伤的保护作用。方法:40只大鼠随机分为对照组、模型组、miR-NC组和miR-140-5p-mimic组,每组10只。miR-NC组、miR-140-5p-mimic组分别尾静脉注射慢病毒空载体miR-NC、重组miR-140-5p,对照组、模型组尾静脉注射生理盐水。3 d后模型组、miR-NC组、miR-140-5p-mimic组大鼠腹腔注射10 mg/kg脂多糖,对照组大鼠腹腔注射生理盐水。注射后12 h处死所有大鼠,检测血清ALT、AST、内毒素、TNF-α、IL-6、IL-1β、SOD、MDA、CAT水平,HE、TUNEL染色观察肝组织病理形态与细胞凋亡情况。TargetScanHuman预测miR-140-5p和TLR4的结合位点,双荧光素酶报告基因检测分析miR-140-5p和TLR4的靶向调节关系。qRT-PCR检测肝组织miR-140-5p水平,qRTPCR、Western blot检测肝组织TLR4、MyD88、NF-κB mRNA和蛋白表达,Western blot检测p-NF-κB表达。结果:对照组肝小叶清晰可见,无肝细胞变性、坏死,无炎症细胞浸润;模型组、miR-NC组可见明显肝细胞坏死、空泡变性、充血,炎症细胞渗入肝窦;miR-140-5p-mimic组肝细胞充血、坏死、空泡变性和炎症细胞浸润情况较模型组、miR-NC组明显减少。miR-140-5p能够直接靶向作用于TLR4。与对照组相比,模型组、miR-NC组、miR-140-5p-mimic组ALT、AST、内毒素、凋亡细胞数、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、TLR4、MyD88 mRNA与蛋白、NF-κB mRNA、p-NF-κB水平升高(P<0.05),SOD、CAT水平降低(P<0.05);与模型组、miR-NC组相比,miR-140-5p-mimic组ALT、AST、内毒素、凋亡细胞数、TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、TLR4、MyD88 mRNA与蛋白,以及NF-κB mRNA、p-NF-κB水平降低(P<0.05),SOD、CAT水平升高(P<0.05)。结论:过表达miR-140-5p能够降低内毒素诱导肝损伤大鼠的炎症反应、氧化应激水平,保护肝细胞,减轻肝脏的病理性损伤,其作用机制可能与TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关。

ciRS-7通过抑制miR-7表达增强子宫内膜癌细胞对内质网应激抗性

目的:探究环状RNA ciRS-7与子宫内膜癌(EC)细胞内质网(ER)应激之间的关系。方法:通过慢病毒转染细胞的方法构建稳定过表达ciRS-7的EC细胞系Ishikawa,集落形成试验检测过表达ciRS-7的Ishikawa细胞增殖活性变化,划痕试验检测Ishikawa细胞迁移能力变化,Transwell试验检测Ishikawa细胞侵袭能力变化,qRT-PCR检测Ishikawa细胞内miR-7表达水平变化。对Ishikawa细胞进行血清饥饿24h处理,通过Western blot检测Ishikawa细胞ER应激相关蛋白和凋亡相关蛋白表达水平,qRT-PCR检测Ishikawa细胞内miR-7表达水平。通过细胞免疫荧光试验比较饥饿处理的ciRS-7过表达细胞和和未经饥饿处理的空白组细胞内Ki-67和抗凋亡蛋白表达水平。构建稳定过表达ciRS-7和miR-7的Ishikawa细胞株,在饥饿处理细胞诱导ER应激后,Western blot检测ER应激相关蛋白和促凋亡蛋白表达水平。构建稳定敲低ciRS-7的Ishikawa细胞株,在饥饿处理细胞诱导ER应激后,通过qRT-PCR检测细胞miR-7水平,Western blot检测ER应激相关蛋白和促凋亡蛋白表达水平。结果:过表达ciRS-7的Ishikawa细胞增殖活性显著提升,迁移和侵袭能力显著增强;ciRS-7的过表达导致miR-7水平显著降低。血清饥饿24h成功诱导Ishikawa细胞ER应激水平升高。过表达ciRS-7的Ishikawa细胞内miR-7水平显著低于阴性对照组细胞,对ER应激抗性更强,促凋亡蛋白表达水平显著低于阴性对照组细胞。CiRS-7和miR-7双重过表达细胞对饥饿诱导的ER应激抗性降低,凋亡蛋白表达水平显著升高。敲低ciRS-7导致细胞miR-7水平升高,细胞对饥饿诱导的ER应激抗性减弱,细胞凋亡增加。结论:ciRS-7的表达能够促进EC细胞增殖、迁移和侵袭,并且通过抑制miR-7的表达增强EC细胞对饥饿诱导的ER应激抗性。

利多卡因通过 FOXO1/miR-203b/Cacna1f 信号轴在带状疱疹后遗神经痛 中的作用机制

目的研究带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)感染神经后,利多卡因通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在后遗神经痛中的作用机制。方法构建VZV感染的大鼠带状疱疹后遗神经痛(post herpetic neuralgia,PHN)动物模型,造模成功后,检测SD大鼠背跟神经节在感染VZV后的差异基因表达水平,结合生物信息学分析与疼痛相关的基因FOXO1(保护性)、Cacna1f(钙离子通道蛋白)和miRNA(Targetscan数据库分析并进行Realtime PCR验证),并利用双荧光素酶报告基因验证上、下游调控靶点。同时检测利多卡因组FOXO1、Cacna1f和miRNA的表达情况。结果SD大鼠PHN造模成功,且共鉴定出差异表达基因89个。生物信息分析结果显示,VZV感染后,FOXO1的表达下调,Cacna1f的表达上调;而利多卡因治疗组与VZV感染组比较,FOXO1的表达上调,Cacna1f的表达下调。Targetscan数据库分析结果显示,Cacna1f基因具有6个miRNA的结合位点,且仅有miR-203b的表达水平显著下降。通过双荧光素酶报告基因发现,在PHN中FOXO1对miR-203b具有转录调控作用,同时miR-203b可靶向于Cacna1f分子。结论FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在PHN中起重要的疼痛信号传递作用,利多卡因可通过作用于该轴减弱疼痛信号的转导,FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴可以作为治疗PHN的靶点通路。

LINC01915介导miR-92a影响结直肠癌裸鼠肿瘤生长的实验研究

目的探讨基因间区长链非编码核糖核酸01915(LINC01915)过表达靶向抑制微小核糖核酸-92a(miR-92a)控制结直肠癌裸鼠肿瘤生长的作用与分子机制。方法取100只5周龄裸鼠经皮下接种人结直肠癌细胞HT29建立结直肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,将建模成功的裸鼠随机分为LINC01915上调组(转染pcDNA-LINC01915)、LINC01915下调组(转染si-LINC01915)、LINC01915上调对照组(转染pcDNA)、LINC01915下调对照组(转染si-NC)、miR-92a上调组(转染miR-92a mimic)、miR-92a下调组(转染miR-92a inhibitor)、miR-92a上调对照组(转染miR-92a mimic NC)、miR-92a下调对照组(转染miR-92a inhibitor NC)以及空白对照组(注射生理盐水)。观察记录裸鼠肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线;通过苏木精-伊红(HE)染色观察肿瘤组织病理学改变;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)及蛋白质印迹法(WB)检测裸鼠肿瘤组织Kruppel样因子4(KLF4)、生存素(Survivin)、细胞增殖核抗原(Ki-67)及半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)信使核糖核酸(mRNA)或蛋白表达;通过荧光素酶活性实验验证LINC01915和miR-92a的靶向关系。结果重复测量方差分析结果显示,各组结直肠癌裸鼠肿瘤体积变化存在时间效应、组间效应及交互效应,差异均有统计学意义(P<0.05)。多变量方差分析结果显示,转染第9、12、15天时:与空白对照组和LINC01915上调对照组相比,LINC01915上调组结直肠癌裸鼠肿瘤体积缩小(P<0.05);与空白对照组和LINC01915下调对照组相比,LINC01915下调组结直肠癌裸鼠肿瘤体积均增大(P<0.05);与空白对照组和miR-92a上调对照组相比,miR-92a上调组结直肠癌裸鼠肿瘤体积均增大(P<0.05);与空白对照组和miR-92a下调对照组相比,miR-92a下调组结直肠癌裸鼠肿瘤体积均缩小(P<0.05)。各对照组裸鼠肿瘤组织腺体排列紊乱并伴随炎症细胞浸润,有少量杯状细胞;LINC01915上调组和miR-92a下调组裸鼠肿瘤组织腺体排列整齐,结构更加完整,可见少量杯状细胞及炎症细胞浸润;LINC01915下调组和miR-92a上调组裸鼠肿瘤组织腺体排列更加紊乱,杯状细胞几乎消失,可见大量炎症细胞浸润。与空白对照组和LINC01915上调对照组相比,LINC01915上调组结直肠癌裸鼠肿瘤组织KLF4、Caspase-3 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05),miR-92a表达和Survivin、Ki-67 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05);与空白对照组和LINC01915下调对照组相比,LINC01915下调组结直肠癌裸鼠肿瘤组织KLF4、Caspase-3 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05),miR-92a表达和Survivin、Ki-67 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);与空白对照组和miR-92a上调对照组相比,miR-92a上调组结直肠癌裸鼠肿瘤组织KLF4、Caspase-3 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05),miR-92a表达和Survivin、Ki-67 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05);与空白对照组和miR-92a下调对照组相比,miR-92a下调组结直肠癌裸鼠肿瘤组织KLF4、Caspase-3 mRNA及蛋白表达均升高(P<0.05),miR-92a表达和Survivin、Ki-67 mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05)。荧光素酶活性实验结果显示LINC01915可直接靶向调控miR-92a。结论上调LINC01915可抑制结直肠癌裸鼠肿瘤生长,可能是通过靶向下调miR-92a的表达,促进KLF4、Caspase-3表达,抑制Survivin、Ki-67表达而发挥作用。

miR-21、miR-26a及miR-200a在子痫前期患者中的表达水平及与病情的相关性

目的分析miR-21、miR-26a及miR-200a在子痫前期(PE)患者血清中的表达,并探讨其临床意义。方法选取2019年3月至2021年3月在南京市妇幼保健院治疗的PE患者103例,分为轻度PE组(57例)和重度PE组(46例),另选取同期正常孕妇50例作为对照组。检测各组孕妇血清miR-21、miR-26a及miR-200a表达水平,分析其与年龄、孕周、BMI、血压、24h尿蛋白及不良妊娠结局的相关性,并分析血清miR-21、miR-26a及miR-200a对PE的诊断价值。结果重度PE组BMI、舒张压、收缩压以及24h尿蛋白高于轻度PE组及对照组,且差异具有统计学意义(F值分别为4.116、141.063、143.118和342.736,P<0.05)。对照组、轻度PE组及重度PE组孕妇血清中miR-21、miR-26a及miR-200a的表达水平依次升高。Pearson相关性分析结果显示,血清miR-21、miR-26a及miR-200a的表达水平与血压、24h尿蛋白及不良妊娠结局发生率呈正相关(r值介于0.446~0.832之间,P<0.001)。经受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析发现,血清miR-21、miR-26a及miR-200a联合诊断PE的曲线下面积(AUC)为0.967,敏感度为98.10%,特异性为92.30%。结论PE患者血清miR-21、miR-26a及miR-200a的表达高于正常孕妇,且与患者的临床指标及不良妊娠结局相关,检测血清miR-21、miR-26a、miR-200a水平对早期诊断PE及评估患者预后具有十分重要的意义。

miR-137靶向MITF调控山羊黑色素细胞生成黑色素的机制研究

旨在探讨miR-137在黑山羊被毛颜色形成中的调控作用,为研究黑色素生成的分子机制提供新的视角。本研究选取4日龄黑山羊肩后约5 cm处皮肤组织分离黑色素细胞,通过免疫组化和免疫荧光试验对黑色素细胞定位,采用多巴染色和免疫荧光的方法鉴定山羊黑色素细胞,裂解黑色素细胞测定黑色素的含量,通过细胞转染、实时荧光定量PCR、Western blot等方法探究miR-137通过靶向黑素细胞诱导转录因子(melanocyte inducing transcription factor,MITF)对黑色素细胞生成黑色素的调控机制。结果显示,在毛乳头上方及外毛根鞘处有黑色素细胞的存在,黑色素细胞呈两极或三极状,多巴染色鉴定黑色素细胞呈棕黑色阳性,免疫荧光鉴定毛色生成有关的标记基因表达阳性。转染过表达载体后的山羊黑色素细胞与NC组相比,黑色素含量降低(P<0.05),同时,inhibitor组趋势相反(P<0.05)。通过RT-qPCR与Western blot对黑色素细胞生成相关基因的表达水平进行分析,结果显示,过表达或抑制miR-137对靶基因MITF的mRNA表达水平影响并不显著(P>0.05)。而过表达miR-137对黑色素细胞生成的标志基因TYR、TYRP-1、TYRP-2的mRNA表达起抑制作用(P<0.05),同时,inhibitor组趋势相反(P<0.05)。MITF的蛋白质表达水平mimic组显著低于mimic NC组(P<0.05),inhibitor组的蛋白质表达水平显著高于inhibitor NC组(P<0.05),mimic组黑色素细胞生成的标志基因TYR、TYRP-1、TYRP-2的蛋白质表达水平显著低于mimic NC组(P<0.05),inhibitor组高于inhibitor NC组(P<0.05)。本研究发现,miR-137不影响MITF的mRNA表达量,而是通过靶向MITF间接抑制山羊黑色素细胞黑色素的生成,这为研究miR-137在山羊肤色和毛色形成中的作用提供了理论依据。

miR-221对奶牛乳腺上皮细胞乳脂、乳蛋白合成的影响及作用机制

文章利用体外分离培养奶牛乳腺上皮细胞研究miR-221对乳脂和乳蛋白合成的影响。将miR-221转染至奶牛乳腺上皮细胞中,应用QRT-PCR检测miR-221表达量,应用Western blot技术和组织细胞甘油三酯(TG)含量酶法分别检测β-酪蛋白和甘油三酯含量。利用双荧光素酶试验分析miR-221和IGF-1的靶向关系,检测转染miR-221后IGF-1和相关泌乳信号通路蛋白表达的变化。结果表明,在奶牛乳腺上皮细胞中转染miR-221后,miR-221表达显著上升,β-酪蛋白和甘油三酯含量显著降低;泌乳调节相关基因IGF-1与miR-221具有靶向关系,过表达miR-221后,IGF-1、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR的表达也显著降低,表明miR-221可能通过靶向抑制IGF-1进而影响AKT/mTOR信号通路来影响乳脂和乳蛋白合成。

益气养阴化浊通络方通过调控miR-21a-5p/FoxO1/PINK1介导 的线粒体自噬减轻糖尿病肾病小鼠的足细胞损伤

目的探讨益气养阴化浊通络方(YYHT)对高糖诱导小鼠肾足细胞(MPC5)损伤的保护作用及潜在机制。方法大鼠分别灌胃19、38、76 g/kg YYHT及生理盐水1周制备低、中、高浓度含药血清和空白血清。体外培养MPC5,分为对照组(5.5 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-inhibitor-NC+空白血清)、模型组(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-inhibitor-NC+空白血清)、YYHT-L(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-inhibitor-NC+低浓度含药血清)、YYHT-M(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-inhibitor-NC+中浓度含药血清)、YYHT-H(30 mmol/L D-葡萄糖+NC+高浓度含药血清)、miR-21a-5p抑制剂组(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5pinhibitor+空白血清)。qRT-PCR检测miR-21a-5p表达及FoxO1、PINK1、Parkin的mRNA表达,Western blotting检测足细胞标志蛋白(Nephrin、Podocin)及FoxO1、PINK1、Parkin蛋白表达,MDC染色检测自噬荧光。将MPC5分为阴性对照组(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-NC+空白血清)、miR-21a-5p-mimic组(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-mimic+空白血清)、YYHT-L(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-mimic+低浓度含药血清)、YYHT-M(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5pmimic+中浓度含药血清)、YYHT-H(30 mmol/L D-葡萄糖+miR-21a-5p-mimic+高浓度含药血清),荧光素酶报告基因实验检测miR-21a-5p/FoxO1转录调控,RIP检测miR-21a-5p与靶基因FoxO1结合。结果与对照组相比,模型组miR-21a-5p表达升高(P<0.05),FoxO1、PINK1、Parkin mRNA表达降低(P<0.05),FoxO1、PINK1、Parkin、Nephrin、Podocin蛋白表达及自噬荧光降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量YYHT含药血清及miR-21a-5p-inhibitor促进Nephrin及Podocin蛋白表达(P<0.05),抑制miR-21a-5p表达(P<0.05),增强FoxO1、PINK1、Parkin的mRNA和蛋白表达及自噬荧光(P<0.05)。与miR-21a-5p-NC组相比,miR-21a-5p-mimic组抑制FoxO1转录(P<0.05),促进miR-21a-5p与FoxO1的结合(P<0.05);与miR-21a-5p组相比,YYHT含药血清组促进FoxO1转录(P<0.05),抑制miR-21a-5p与FoxO1的结合(P<0.05)。结论益气养阴化浊通络方可能通过调节miR-21a-5p/FoxO1/PINK1介导的线粒体自噬,减轻高糖诱导的小鼠肾足细胞损伤。

血清miR-372、miR-125b、miR-592表达水平对口腔癌的临床诊断价值

目的探讨血清miR-372、miR-125b、miR-592表达水平对口腔癌的临床诊断价值。方法选择2021年7月—2023年10月安徽医科大学第一附属医院和安徽医科大学第二附属医院收治的218例口腔病患者为研究对象,按口腔病是否发生癌病变分为口腔癌组(103例)和癌前病变组(115例)两组,实时荧光定量PCR检测血清miR-372、miR-125b、miR-592;多因素Logistic回归模型分析口腔癌发生的影响因素;ROC曲线分析血清miR-372、miR-125b、miR-592对口腔癌的诊断价值。结果口腔癌组患者的血清miR-372和miR-125b水平高于癌前病变组,而血清miR-592低于癌前病变组,差异有统计学意义(P<0.05);口腔癌组患者血清血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原(CA125)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL-8)水平显著高于癌前病变组,差异有统计学意义(P<0.05);口腔癌患者临床分期、分化程度与miR-372表达有关(χ^(2)=7.009、8.786,P<0.05);临床分期、淋巴结转移与miR-125b、miR-592表达有关(χ^(2)=10.310、9.993、5.946、9.062,P<0.05)。多因素分析显示,miR-372(OR=1.316)、miR-125b(OR=1.258)、miR-592(OR=0.907)、CEA(OR=1.792)、CA125(OR=1.854)、TNF-α(OR=1.539)和IL-8(OR=1.445)均为口腔癌发生的影响因素(P<0.05)。ROC结果显示,血清miR-372、miR-125b、miR-592诊断口腔癌的AUC分别为0.789、0.790、0.808,三者联合诊断口腔癌的敏感度为90.29%,特异度为83.48%,AUC为0.880,显著高于miR-372(Z=2.285,P=0.022)、miR-125b(Z=2.114,P=0.035)、miR-592(Z=1.870,P=0.042)单独诊断的AUC。结论口腔癌患者血清miR-372和miR-125b水平较高,miR-592水平较低,血清miR-372、miR-125b、miR-592对口腔癌诊断价值较高。

microRNA miR-92a-1-p5导入蚜虫条件筛选

微小RNA(microRNA,miRNA)在蚜虫发育过程中具有重要调控作用,近年来利用miRNA作为靶标进行害虫防治逐渐受到人们的重视,但miRNA导入蚜虫的方式有很大局限。为探索miRNA导入蚜虫的最适条件,以豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)为研究对象,探究显微注射、饲喂、纳米系统递送三种方式对microRNA miR-92a-1-p5的导入效果;同时将不同浓度的miRNA模拟物或抑制剂通过纳米递送系统导入蚜虫体内,定量PCR(Quantitative PCR,qRT-PCR)筛选miRNA导入蚜虫的最佳浓度。结果发现,蚜虫体壁薄且体液多,显微注射方式会导致内容物流出过多而死亡,因此显微注射方式不适于蚜虫miRNA的导入。使用豌豆苗幼嫩组织吸收miRNA抑制剂后再饲喂蚜虫,发现处理48 h后miR-92a-1-p5表达量下降45.3%,其靶标基因flightin表达量上升65.6%,呈显著负调控(P<0.01),表明该方式适合miRNA在蚜虫中的有效导入。使用纳米材料包裹miRNA模拟物或抑制剂后在蚜虫背板点滴,可实现miRNA在蚜虫中的有效过表达或干涉,且最适浓度为160 ng/μL。综上所述,植物吸收miRNA后饲喂蚜虫的方式和纳米递送系统介导miRNA导入的方式,均能实现miRNA在豌豆蚜中的有效导入,纳米递送系统操作更简单,效率更高。研究为miRNA导入蚜虫方式提供了参考,也为miRNA用于害虫防治提供了新的思路。

清达颗粒通过调控miR-124/STAT3信号轴减轻自发性高血压大鼠脑损伤

目的探讨清达颗粒(QDG)对自发性高血压大鼠(SHR)脑损伤的保护作用及其对miR-124/STAT3信号轴的影响。方法6只5周龄WKY大鼠为WKY组,12只5周龄SHR大鼠分为SHR组、SHR+QDG组,6只/组。SHR+QDG组大鼠每天给予QDG灌胃,灌胃剂量为0.9 g/(kg·d),连续灌胃12周,其余组大鼠每天给予等体积生理盐水灌胃。利用鼠尾无创血压仪监测血压,HE染色观察脑皮质区病理,TUNEL染色检测皮质区凋亡,Q-PCR检测miR-124、STAT3 mRNA的表达,免疫组化和Western blotting检测NeuN、STAT3、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达;利用氧糖剥夺/复氧(OGD/R)构建神经元HT22细胞损伤模型,分为Control组、QDG组、OGD/R组、OGD/R+QDG组。利用CCK-8法检测细胞活力,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡,Q-PCR检测miR-124、STAT3、Bcl-2、Bax mRNA的表达,Western blotting检测STAT3、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达。结果体内实验中,与WKY组比较,SHR组大鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压均升高(P<0.05),脑皮质区神经元出现核固缩,数量减少,凋亡率升高(P<0.05),NeuN、miR-124、Bcl-2的表达降低,STAT3、Bax、cleaved caspase-3的表达升高(P<0.05)。与SHR组比较,清达颗粒能降低SHR大鼠的收缩压、舒张压及平均动脉压(P<0.05),改善SHR大鼠脑皮质区的病理损伤,降低皮质区的凋亡率(P<0.05),升高皮质区的NeuN、miR-124、Bcl-2的表达(P<0.05),降低STAT3、Bax、cleaved caspase-3的表达(P<0.05)。体外实验中,与Control组比较,OGD/R组凋亡率升高,miR-124、Bcl-2表达降低,STAT3、Bax、cleaved caspase-3表达升高(P<0.05);与OGD/R组比较,清达颗粒能降低OGD/R诱导的HT22细胞凋亡,升高miR-124、Bcl-2表达,降低STAT3、Bax、cleaved caspase-3表达(P<0.05)。结论清达颗粒可能通过调控miR-124/STAT3信号轴,抑制神经元的凋亡,从而减轻SHR大鼠的脑损伤。

miR-155-5p介导PIK3R1负调控PI3K/AKT信号通路促进原发性干燥综合征人唾液腺上皮细胞增殖

目的探讨miR-155-5p靶向作用于PIK3R1调控PI3K/AKT信号通路对原发性干燥综合征人唾液腺上皮细胞(pSSHSGECs)的影响。方法通过双荧光素酶验证miR-155-5p与PI3K/AKT通路的靶向关系。利用TRAIL及INF-γ刺激细胞,模拟pSS-HSGECs细胞模型;空白组:HSGECs,模型组:TRAIL+INF-γ+HSGECs,空转组:TRAIL+INF-γ+HSGECs+miR-155-inhibitor-NC;miR-155抑制组:TRAIL+INF-γ+IHSGECs+miR-155-inhibitor;CKK-8法、流式细胞术、平板克隆形成实验分别检测细胞活力、细胞周期及凋亡率、细胞增殖能力。ELISA、RT-PCR方法分别检测相关细胞因子、miR-155-5p表达。蛋白质免疫印迹法检测PI3K/AKT信号通路蛋白表达。结果双荧光素酶检测结果表明,miR-155-5p与PI3K/AKT通路存在靶向关系,且PIK3R1mRNA为二者的结合位点。与空白组相比,模型组细胞活力、细胞克隆形成能力、IL-10、IL-4水平降低;细胞凋亡率、细胞周期G2期比例、TNF-α、IL-6、miR-155-5p、PIK3R1 mRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比率、PIK3R1mRNA蛋白相对表达显著升高(P<0.01)。与模型组及空转组相比,miR-155抑制组细胞活力、G1期比例、克隆形成能力、IL-10和IL-4水平上升;同时细胞凋亡率、细胞周期G2期比例、TNF-α、IL-6、miR-155-5p、PIK3R1 mRNA表达、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比率及PIK3R1蛋白相对表达下降(P<0.05)。结论miR-155-5p可靶向作用于PI3K1mRNA,负向调节PI3K/AKT信号通路的过表达,改善pSSHSGECs增殖与凋亡异常,调节炎症反应。

电刺激诱导miR-741-3p调控Radil促进施万细胞的迁移

背景:越来越多的动物实验和临床研究证实电刺激可以促进周围神经损伤修复,具体的机制尚未完全明确。目的:探讨电刺激诱导miR-741-3p调控Radil对施万细胞迁移的影响。方法:①12只雄性SD大鼠,随机分为电刺激组和对照组,电刺激组在坐骨神经挤压伤后连续电刺激7 d,对照组在坐骨神经挤压后不做任何处理。术后第7天取损伤处神经,利用荧光原位杂交技术检测两组miR-741-3p的表达差异。②通过miRDB、TargetScan和miRWalk数据库预测miR-741-3p靶基因。③将miR-741-3p模拟物及其对照、miR-741-3p抑制物及其对照、Radil siRNA及其对照、miR-741-3p抑制物+Radil siRNA及miR-741-3p抑制物+siRNA对照对施万细胞进行转染,采用RT-PCR检测转染效率,Transwell小室检测施万细胞的迁移能力。结果与结论:①电刺激组神经残端miR-741-3p荧光强度低于对照组;②数据库预测结果显示有69个基因可能是miR-741-3p靶基因,Radil是预测靶基因之一,主要参与细胞黏附和迁移;③与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组施万细胞迁移数增多(P<0.05);与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组施万细胞迁移数减少(P<0.05);与siRNA对照组相比,Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05);④与miR-741-3p抑制物对照组相比,miR-741-3p抑制物组Radil的表达水平升高;与miR-741-3p模拟物对照组相比,miR-741-3p模拟物组Radil的表达水平降低;⑤与miR-741-3p抑制物+siRNA对照组相比,miR-741-3p抑制物+Radil siRNA组施万细胞迁移数减少(P<0.05)。结果表明,电刺激通过下调miR-741-3p调控Radi的表达来促进施万细胞迁移。

miR-192-5p在增生性瘢痕组织及成纤维细胞中的表达及调控

背景:研究表明,miRNAs的表达与肝纤维化、肾纤维化及皮肤纤维化发生有关;并证实在痛风性关节炎中miR-192-5p与表皮调节素存在靶向调控关系。目的:探讨miR-192-5p在增生性瘢痕中的表达及调控作用,并验证miR-192-5p与表皮调节素之间存在靶向调控关系。方法:①在新疆医科大学第一附属医院收集6例增生性瘢痕组织及6例正常皮肤组织,采用qRT-PCR法检测miR-192-5p与表皮调节素mRNA表达。②组织块法获取原代增生性瘢痕成纤维细胞,传代培养至3-6代用于后续实验,实验分为3个组:阴性对照组、miR-192-5p模拟物组和miR-192-5p抑制物组,分别转染对应的序列。采用CCK-8法和EdU试剂盒检测细胞增殖活力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞凋亡,qRT-PCR和Western blot法检测表皮调节素、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-SMA的基因和蛋白表达,生物信息学网站预测miR-192-5p靶点,双荧光素酶实验验证靶向结合。结果与结论:①与正常皮肤组织及其成纤维细胞相比,miR-192-5p和表皮调节素在增生性瘢痕和增生性瘢痕成纤维细胞中均呈高表达(P<0.05或P<0.01);②过表达miR-192-5p后,与阴性对照组比较,细胞增殖能力增强(P<0.05),EdU阳性细胞率增加(P<0.01);抑制miR-192-5p后细胞活力降低(P<0.05),EdU阳性细胞率减少(P<0.05);③过表达miR-192-5p 24 h后,与阴性对照组比较,模拟物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率减小(P<0.05),miR-192-5p抑制物组细胞划痕间面积、细胞凋亡率增加(P<0.01);④转染48 h后,miR-192-5p模拟物组表皮调节素mRNA及蛋白水平显著降低、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和α-平滑肌肌动蛋白mRNA及蛋白水平显著增高(P<0.05或P<0.01);miR-192-5p抑制物组上述4项指标呈现相反的变化(P<0.05或P<0.01);⑤Targetscan网站预测表皮调节素与miR-192-5p有潜在结合位点;⑥双荧光素酶实验显示,miR-192-5p能够与表皮调节素靶向结合。结果说明:miR-192-5p过表达可降低表皮调节素的表达,二者可能存在负向调控;提示通过调控表皮调节素可能起到抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖的作用。

miR-27a-3p激活MAPK信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖

背景:目前多项研究证实了丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与了细胞的增殖过程,且miRNA参与增生性瘢痕的发生发展,因此深入探讨了miR-27a-3p和丝裂原活化蛋白激酶信号通路在病理性瘢痕形成中的作用。目的:探究miR-27a-3p通过丝裂原活化蛋白激酶信号通路对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:收集皮肤标本并分别分离出原代成纤维细胞,倒置显微镜观察原代细胞,免疫荧光予以验证;采用qRT-PCR检测miR-27a-3p在组织中的相对表达水平;利用数据库预测miR-27a-3p的靶基因,再将预测的靶基因进行基因本体功能富集分析及京都基因与基因组百科全书生物通路富集分析;设置分组为:空白对照组、阴性对照组、miR-27a-3p过表达组、miR-27a-3p抑制组、miR-27a-3p过表达+p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+细胞外信号调节蛋白激酶抑制剂组、miR-27a-3p过表达+c-Jun氨基末端激酶抑制剂组,Western blot检测细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38激酶总量及其磷酸化水平,采用CCK-8法和EdU检测细胞增殖情况。结果与结论:①与正常皮肤成纤维细胞相比,增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活性更强(P<0.05),增殖速度也更快(P<0.001);②与正常皮肤相比,miR-27a-3p在增生性瘢痕中呈高表达(P<0.001);③与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p能促进细胞的增殖活性(P<0.001)和增殖水平(P<0.001);④与阴性对照组相比,敲低miR-27a-3p能抑制细胞的增殖活性(P<0.05)和增殖水平(P<0.001);⑤与阴性对照组相比,过表达miR-27a-3p促进细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);与阴性对照组相比,敲减miR-27a-3p能抑制细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平(P<0.05);⑥与miR-27a-3p过表达组相比,细胞外调节蛋白激酶、c-Jun氨基末端激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶的特异性抑制剂可逆转miR-27a-3p对成纤维细胞的增殖活性(P<0.01)和增殖水平(P<0.001);⑦提示miR-27a-3p通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。

miR-192-5p靶向CKIP-1促进骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化

背景:酪蛋白激酶2结合蛋白1(casein kinase 2-interaction protein-1,CKIP-1)是一种重要的骨形成负调控基因,其敲除鼠骨质显著增强、骨形成和骨密度也显著提高。而miRNA作为较早发现的小分子调控物,对大多数编码基因具有调控作用,在成骨分化中发挥重要作用。目的:探讨miRNA/CKIP-1对骨质疏松患者骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其分子机制。方法:采用miRNA-Seq技术检测2022年3-6月在开封市中心医院骨外科就诊32例骨质疏松患者及同期体检中心健康人群骨髓间充质干细胞中miRNA的变化情况;利用Targetscan网站预测靶向调控CKIP-1的miRNA,利用荧光素酶报告基因实验检测miRNA与CKIP-1启动子区DNA的结合;在骨髓间充质干细胞中转染miR-192-5p类似物(miR-192-5p mimics)/阴性对照(NC mimics)或miR-192-5p抑制剂(miR-192-5p inhibitor)/阴性对照(NC inhibitor),成骨诱导后第7,14天,通过实时荧光定量PCR技术及茜素红染色检测成骨标志基因Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素、抗骨桥蛋白、骨唾液蛋白及CKIP-1的表达水平和骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的情况;采用蛋白质免疫印迹实验及茜素红染色检测miR-192-5p/CKIP-1/轴对细胞成骨分化的的调控作用。结果与结论:与健康组相比,骨质疏松组有16个miRNA表达明显升高,53个miRNA表达明显降低(P<0.05);利用Targetscan网站预测,并通过荧光素酶报告基因实验验证,发现miR-192-5p与CKIP-1有互补的核苷酸序列(P<0.05);过表达miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),抑制miR-192-5p,Runx2、骨钙素、骨桥素和骨唾液蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),而沉默CKIP-1的表达后,Runx2、骨钙素及骨桥素的蛋白水平增加(P<0.05),逆转了敲低miR-192-5p对细胞成骨分化的抑制作用。上述结果证实,miR-192-5p在骨质疏松症中表达降低;miR-192-5p通过靶向抑制CKIP-1的表达,促进骨髓间充质干细胞成骨分化。

MiR-31-5p调控非小细胞肺癌吉非替尼耐药机制的研究

目的:探讨miR-31-5p对吉非替尼耐药的影响及其作用机理。方法:利用TargetScan、miRDB、mirDIP和ENCORI等在线工具预测PRSS8的靶向miRNAs,并从高通量数据库(GEO)搜索并下载与吉非替尼耐药相关的miRNA芯片数据,筛选差异表达的miRNAs。利用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)检测miR-31-5p在吉非替尼敏感的NSCLC(PC9)和对吉非替尼产生耐药的NSCLC(PC9/GR)表达。将PC9/GR细胞分为两组,分别转染miR-31-5p NC、miR-31-5p mimic;应用CCK8技术测定经转染处理后的细胞对吉非替尼的敏感性;应用蛋白免疫印迹分析法(WB)测定细胞PRSS8、BAX、BCL-2的表达。结果:生信分析表明miR-31-5p为靶向PRSS8且在吉非替尼耐药细胞中异常表达的miRNA。实时定量PCR分析表明,miR-31-5p在PC9/GR细胞中的表达量相比PC9细胞有所降低(P<0.0001)。miR-31-5p mimic组细胞增殖速度明显低于NC组(均P<0.0001)。在miR-31-5p mimic组中,与NC组相比,BAX蛋白的表达水平显示出上升趋势(P<0.001),而BCL-2水平下降(P<0.05)。进一步研究发现,miR-31-5p mimic组PRSS8 mRNA(P<0.0001)、蛋白均下调(P<0.05)。结论:非小细胞肺癌耐药细胞PC9/GR中miR-31-5p表达明显下降,且miR-31-5p通过降低PRSS8的表达可能有助于逆转PC9/GR细胞对吉非替尼药物耐药的情况。

尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c在早期糖尿病肾病诊断中的价值

目的探讨尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c在早期糖尿病肾病(DN)诊断中的价值。方法选取2021年1月—2022年12月金华市人民医院2型糖尿病(T2DM)患者260例,根据其就诊时的微量尿蛋白排泄率(UAER)分为单纯T2DM组(135例)、早期DN组(82例)、临床期DN组(43例)。另选取同期金华市人民医院健康体检者50名作为正常对照组。收集所有研究对象的一般资料,并检测尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c和尿液肌酐(UCr)、尿液尿素氮(UUN)、尿液转化生长因子-β1(TGF-β1,以UCr校正)、糖化血红蛋白(HbA_(1c))、血清尿酸(UA)。采用Pearson相关分析评价各项指标之间的相关性。采用多元逐步回归分析评价尿液TGF-β1的影响因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c诊断早期DN的效能。结果正常对照组、单纯T2DM组、早期DN组和临床期DN组尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-200c相对表达量依次升高(P<0.001),miR-29c相对表达量依次降低(P<0.001)。单纯T2DM组、早期DN组和临床期DN组UUN、UCr、校正TGF-β1和HbA_(1c)、UA水平均高于正常对照组(P<0.05)。单纯T2DM组、早期DN组和临床期DN组UUN、UCr、UA、校正TGF-β1水平和UAER依次升高(P<0.001)。尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-200c与UCr、校正TGF-β1均呈显著正相关(P<0.01),miR-29c与UCr、校正TGF-β1均呈显著负相关(P<0.001),与UUN、UA均无相关性(P>0.05)。HbA_(1c)、UCr和尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c是尿液校正TGF-β1水平的独立影响因素(P<0.01)。尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c单项检测和联合检测诊断早期DN的曲线下面积(AUC)分别为0.823、0.855、0.799、0.557、0.923。结论尿外泌体miR-27a、miR-27b、miR-29c、miR-200c联合检测对早期DN有较好的诊断价值。

miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p表达在急性脑梗死患者诊疗中的价值研究

目的 探讨miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p表达在急性脑梗死(ACI)患者诊疗中的应用价值。方法 选取2020年1月至2022年12月南通市第三人民医院全科医学科收治的ACI患者100例作为研究对象,定义为ACI组,根据ACI患者3个月改良Rankin评分量表(mRS评分)将其分为预后良好组(mRS评分≤2分)68例与预后不良组(mRS>2分)32例,另选同期于南通市第三人民医院全科医学科体检的健康者100例作为对照组。记录各组miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p表达水平并进行比较,采用Pearson相关分析探讨两变量的相关性,通过绘制受试者工作特征(ROC)曲线评价miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p联合检测在ACI诊断中的效能,采用多因素Logistic回归分析探讨ACI预后的危险因素。结果 ACI组平均年龄、吸烟史比例、合并高血压比例、miR-140-3p与miR-128-3p及miR-27-3p表达水平均明显高于对照组(均P<0.05)。miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p联合检测用于诊断ACI的曲线下面积(AUC值)为0.965,敏感度为99.00%,特异度为98.00%,表明miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p联合检测用于诊断ACI的效能更高。预后不良组平均年龄、入院时NIHSS评分、梗死体积、吸烟史比例、合并高血压比例、miR-27-3p、miR-128-3p、miR-140-3p表达水平及3个月mRS评分均明显高于预后良好组(均P<0.05)。经Pearson相关分析表明ACI患者miR-27-3p、miR-128-3p、miR-140-3p表达水平均分别与入院时NIHSS评分、梗死体积、3个月mRS评分呈正相关(均P<0.05)。经多因素Logistic回归分析表明年龄(OR:1.546;95%CI:1.124~1.969)、入院时NIHSS评分(OR:1.721;95%CI:1.229~2.308)、梗死体积(OR:1.853;95%CI:1.436~2.786)、吸烟史(OR:1.517;95%CI:1.168~1.825)、miR-27-3p (OR:2.481;95%CI:1.452~3.201)、miR-128-3p (OR:1.692;95%CI:1.288-2.431)及miR-140-3p (OR:2.032;95%CI:1.141~1.976)均为ACI患者预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论 ACI患者miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p表达水平均明显升高,通过三指标联合检测可提高对ACI的诊断效能,而预后不良ACI患者miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p表达水平则升高更为明显,并分别与入院时NIHSS评分、梗死体积、3个月mRS评分呈正相关,且miR-27-3p、miR-128-3p及miR-140-3p均为ACI患者预后的独立危险因素,应予以重点关注。