miR-1-3p对乾华肉用美利奴羊次级毛囊发育相关基因的调控研究

为了探讨miR-1-3p及其靶基因与乾华肉用美利奴羊次级毛囊发生发育关系,该研究采集2周岁乾华肉用美利奴羊皮肤样品,利用生物信息学方法预测miR-1-3p的靶基因,荧光定量PCR检测miR-1-3p及其靶基因相对表达量,通过Western blot对miR-1-3p的靶基因成纤维细胞生长因子14(fibroblast growth factor 14,FGF 14)进行蛋白定量检测,并利用双荧光素酶报告基因试验验证miR-1-3p与候选靶基因的靶向关系。结果表明:通过Targetscan v7.0、miRanda和RNA223个靶基因预测软件确定FGF 14为miR-1-3p的候选靶基因;miR-1-3p在毛囊生长期低表达,在休止期高表达;FGF 14基因mRNA在毛囊生长期高表达,休止期低表达,与FGF 14蛋白表达规律一致。双荧光素酶报告基因试验结果表明miR-1-3p的靶基因为FGF 14。可见,乾华肉用美利奴羊次级毛囊miR-1-3p与FGF 14存在靶向调控关系,miR-1-3p可能是通过负调控FGF 14实现对乾华肉用美利奴羊次级毛囊发生发育进行调控。

乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库构建及miR-1-3p靶基因预测

本试验旨在构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊不同发育时期的小RNA文库和预测筛选miRNA的候选靶基因。通过高通量测序技术构建乾华肉用美利奴羊次级毛囊小RNA文库;采用荧光定量PCR对高通量测序结果进行验证;利用miRDeep2软件对miRNA(长度为20~24 nt的小RNA)进行鉴定;利用Targetscan v7.0、RNA22 v2.0和MiRanda三个在线靶基因预测软件对miR-1-3p的靶基因进行预测分析。成功获得乾华肉用美利奴羊次级毛囊生长期、退行期、休止期小RNA纯净reads分别为10279515、11712215和10926258。分别基于荧光定量与高通量测序的5个miRNA的相对表达量结果趋势基本一致。从次级毛囊生长期、退行期和休止期分别鉴定获得miRNA 1250、1304个和1266个。确定成纤维细胞生长因子14(FGF14)和类胰岛素生长因子Ⅰ受体(IGF1R)为miR-1-3p的候选靶基因。研究结果为后续靶基因验证及确定调控乾华肉用美利奴羊毛囊周期性发育的候选基因奠定基础。

布托啡诺通过微小RNA-1-3p(miR-1-3p)上调连接子蛋白43(Cx43)通路减轻SD大鼠缺血性心律失常

目的探讨布托啡诺减轻缺血性心律失常的作用及其对微小RNA 1-3p/连接子蛋白43(miR-1-3p/Cx43)通路的调控作用。方法SD大鼠分为对照组(处理和造模相同但不进行冠状动脉结扎操作)、布托啡诺组(在针穿过心肌表层后股静脉注射50μg/kg布托啡诺)、抑制剂组(实验前5 d经尾静脉给予80 mg/kg的miR-1-3p的抑制物,其他同对照组);模型组(采用结扎法制备大鼠缺血性心律失常模型)、布托啡诺预处理组(在缺血处理前5 min给予50μg/kg的布托啡诺,其他同模型组)、抑制剂预处理组(实验前5 d给予80 mg/kg的miR-1-3p的抑制物,其他同模型组)。根据心电图结果对各组大鼠进行室性心律失常评分,Targetscan数据库预测Cx43的上游微小RNA(miRNA),利用实时定量PCR检测Cx43 mRNA及miR-1-3p水平,Western blot法检测心肌组织中Cx43表达,通过双荧光素酶报告实验验证Cx43 mRNA与miR-1-3p的结合。结果布托啡诺明显降低缺血性心律失常大鼠的室性早搏次数、室性心律失常评分、室颤持续时间、室速持续时间,并且明显提高Cx43蛋白在心肌组织中的表达;随后检测发现miR-1-3p和Cx43 mRNA的3′非翻译区(3′UTR)存在2个结合位点;布托啡诺显著下调心肌组织中miR-1-3p水平;而抑制miR-1-3p水平显著降低缺血性心律失常大鼠的室性心律失常评分的总分,同时显著上调Cx43 mRNA和蛋白的表达。结论布托啡诺通过miR-1-3p介导上调Cx43表达而改善大鼠缺血性心律失常。

急性ST段抬高型心肌梗死患者血清miR-1-3p、H-FABP水平变化及临床意义

目的探讨急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者血清miR-1-3p、心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的表达,并分析二者对STEMI的诊断价值。方法选取2016年12月~2019年6月在大连医科大学附属第一医院(以下简称“我院”)诊治的120例STEMI患者为STEMI组,另选取同期我院120例心功能正常者为非STEMI组。采用实时荧光定量PCR法检测血清miR-1-3p表达,采用酶联免疫吸附法检测血清H-FABP、N端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平,采用全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)水平;采用彩色超声诊断仪测量左室射血分数(LVEF)、左室舒张末期内径(LVEDD)。采用Pearson相关性分析STEMI患者血清miR-1-3p、H-FABP与脂代谢指标、心功能指标的相关性;并采用受试者操作特征曲线(ROC)分析血清miR-1-3p、H-FABP及联合检测STEMI的诊断价值。结果STEMI组血清miR-1-3p表达及LVEF低于非STEMI组,血清H-FABP、TC、LDL-C、NT-proBNP水平及LVEDD高于非STEMI组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。两组血清TG比较,差异无统计学意义(P>0.05)。STEMI组血清miR-1-3p与TC、LDL-C、NT-proBNP、LVEDD、H-FABP均呈负相关(r<0,P<0.05),与LVEF呈正相关(r>0,P<0.05);血清H-FABP与TC、LDL-C、NT-proBNP、LVEDD均呈正相关(r>0,P<0.05),与LVEF、miR-1-3p呈负相关(r<0,P<0.05);二者与TG均无明显相关性(P>0.05)。ROC分析显示,血清miR-1-3p、H-FABP对STEMI均有一定的诊断价值,二者联合检测的诊断价值高于单独检测[AUC=0.815,95%CI(0.728~0.846)]。结论STEMI患者血清miR-1-3p呈低表达,H-FABP呈高表达,二者均与患者的脂代谢指标、心功能指标存在一定的相关性,二者联合检测可进一步提高对STEMI的诊断价值。

has-miR-1-3p通过调控BDNF/TrkB信号通路抑制人滋养细胞增殖和侵袭

目的:探讨has-miR-1-3p对人滋养细胞HTR-8/SVneo增殖和侵袭的影响及其相关机制。方法:HTR-8/Svneo细胞分为两组,分别转染has-miR-1-3p模拟物作为实验组及无义miRNA为对照组,采用CCK8和Transwell实验分别检测对细胞增殖和侵袭能力的影响。通过在线分析网站预测has-miR-1-3p的靶基因,采用双荧光素酶报告实验和Western blot实验验证has-miR-1-3p对靶基因的调控。结果:与对照组相比,has-miR-1-3p模拟物显著降低了HTR-8/Svneo细胞增殖和侵袭能力;双荧光素酶报告实验和Western blot实验结果表明has-miR-1-3p能够靶向抑制BDNF的表达,抑制TrkB的磷酸化;上调BDNF可降低has-miR-1-3p对HTR-8/Svneo细胞增殖和侵袭能力的抑制。结论:has-miR-1-3p通过调控BDNF/TrkB信号通路抑制人滋养细胞增殖和侵袭。

MiR-1-3p通过靶向FZD7增强卵巢癌细胞对铁死亡的敏感性

目的:卷曲蛋白7(Frizzled 7,FZD7)在多种癌症中异常表达和激活。在卵巢癌中,FZD7的过表达可降低铂耐药性卵巢癌细胞对铁死亡的敏感性,从而使癌细胞存活,但FZD7是否抑制卵巢癌细胞铁死亡及其相关机制尚未被阐明。本研究通过探究FZD7及其上游调控因子miR-1-3p对卵巢癌细胞铁死亡的影响,旨在明确miR-1-3p及FZD7参与卵巢癌细胞铁死亡的分子机制。方法:以人卵巢癌细胞系HO8910和SKOV3为研究对象,第1部分实验将空白质粒和FZD7过表达质粒分别转染人卵巢癌细胞;第2,3部分实验将miR-1-3p模拟物阴性对照、miR-1-3p模拟物、miR-1-3p抑制剂阴性对照和miR-1-3p抑制剂分别转染人卵巢癌细胞;第4部分实验将miR-1-3p模拟物、miR-1-3p模拟物+FZD7过表达质粒分别转染人卵巢癌细胞,另设正常培养的对照组。采用铁死亡诱导剂Erastin或RSL3分别孵育经不同处理后的人卵巢癌细胞构建人卵巢癌细胞铁死亡模型。使用real-time RT-PCR检测FZD7和miR-1-3p的mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测FZD7的蛋白质表达水平,CCK-8实验检测细胞活力,脂质过氧化比色测定试剂盒检测细胞内MDA水平,铁检测试剂盒检测细胞内Fe2+水平,双荧光素酶实验检测miR-1-3p和FZD7的靶向关系。结果:FZD7的过表达提高经Erastin或RSL3处理的人卵巢癌细胞系HO8910或SKOV3细胞的活力(P<0.05、P<0.01或P<0.001),并降低细胞内MDA的水平(P<0.01)。FZD7是miR-1-3p的直接靶点,miR-1-3p通过与FZD7的3'非翻译区(3'-untranslated region,3'UTR)位点结合,抑制FZD7的表达(P<0.01)。MiR-1-3p模拟物降低经Erastin或RSL3处理的人卵巢癌细胞系HO8910或SKOV3细胞的活力(P<0.05、P<0.01或P<0.001),提高细胞内MDA的水平(P<0.01),而miR-1-3p抑制剂则显著提高经Erastin或RSL3处理的人卵巢癌细胞系HO8910或SKOV3细胞的活力(P<0.05、P<0.01或P<0.001),降低细胞内MDA的水平(P<0.01)。MiR-1-3p模拟物增强人卵巢癌细胞对Erastin或RSL3诱导细胞铁死亡敏感性的作用可以被FZD7的过表达所取消(P<0.05或P<0.01)。结论:MiR-1-3p靶向FZD7增强卵巢癌细胞对铁死亡的敏感性。

miR-1-3p通过靶向调控CDK9对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-1-3p与细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)的靶向调控关系及其对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和凋亡的影响。方法:培养人肺上皮细胞株BEAS-2B及人NSCLC细胞株A549、H1299、HCC827和H460,并将miR-1-3p mimic及其阴性对照(miR-NC)转染至A549细胞,qPCR法检测细胞miR-1-3p表达水平,Western blot法检测细胞CDK9蛋白表达水平,生物信息学方法预测miR-1-3p可能的靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miR-1-3p与CDK9的靶向调控关系。将miR-1-3p mimic和pCEP4-CDK9质粒分别或同时转染至A549细胞,CCK-8法检测细胞增殖率,平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平。结果:与BEAS-2B细胞相比,A549、H1299、HCC827和H460细胞中miR-1-3p表达降低(P<0.05),CDK9蛋白表达升高(P<0.05),A549细胞水平变化最为显著。CDK9是miR-1-3p的靶基因,可被miR-1-3p靶向负调控抑制其蛋白表达。miR-1-3p过表达可显著抑制A549细胞增殖及细胞克隆形成能力,提高A549细胞凋亡率,促进cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达,抑制Bcl-2蛋白表达。过表达CDK9可明显逆转miR-1-3p对A549细胞增殖的抑制作用及凋亡的促进作用。结论:miR-1-3p可抑制NSCLC细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与靶向抑制CDK9蛋白表达有关。

miR-1-3p/206/613对LXRα和OATP1B1蛋白表达的影响及其机制研究

目的:探究miR-1-3p、miR-206和miR-613对肝X受体α(LXRα)和有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)蛋白表达及OATP1B1转运能力的影响及其机制研究。方法:通过生物信息学数据库预测可靶向作用于LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR的miRNAs;采用RT-q PCR、Western blot方法检测miR-1-3p/206/613及LXRα和OATP1B1蛋白水平;采用LC-MS/MS方法检测Hep G2细胞中瑞舒伐他汀(RSV)的含量;应用双荧光素酶报告基因法,研究miR-1-3p/206/613影响LXRα和OATP1B1表达的分子机制。结果:预测结果表明miR-1-3p/206/613与LXRα和OATP1B1 mRNA 3'-UTR互补配对,且具有较高的特异性、保守性及结合稳定性。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics能明显下调Hep G2细胞中LXRα蛋白表达水平16.5%、16.0%、25.1%,OATP1B1蛋白30.4%、30.5%、44.4%;相反,miR-1-3p/206/613 inhibitors明显上调LXRα蛋白表达水平13.3%、13.3%、16.0%,OATP1B1蛋白25.0%、25.6%、30.4%。当RSV浓度为5、60、125μmol/L时,miR-1-3p/206/613mimics显著减少Hep G2细胞对RSV的摄取至对照组的0.50、0.19、0.30倍,0.49、0.24、0.23倍和0.64、0.48、0.31倍;与之相反,miR-1-3p/206/613inhibitors上调1.26、1.59、2.07倍,1.97、2.44、2.63倍,2.22、2.86、2.93倍。与对照组相比,miR-1-3p/206/613 mimics或miR-1-3p/206/613 inhibitors,p GL/LXRα-WT报告基因荧光素酶活性分别下降38.5%、32.5%、32.8%或升高137.0%、75.8%、55.7%,而p GL/LXRα-Mut报告基因荧光素酶活性未见明显改变;同上,p GL/OATP1B1-WT报告基因荧光素酶活性下降24.3%、28.9%、32.1%或升高33.5%、48.3%、61.6%,而p GL/OATP1B1-Mut报告基因荧光素酶活性也未见明显改变。结论:miR-1-3p/206/613既可通过直接靶向作用于OATP1B1 mRNA 3'-UTR而调控OATP1B1的蛋白表达和转运功能,也可通过靶向作用于LXRαmRNA 3'-UTR而发挥间接调控作用。

脓毒症患者早期外周血外泌体中miR-1-3p的表达分析

目的本研究通过提取脓毒症患者与健康人的外周血中的外泌体,并对提取的外泌体中含有miR-1-3p进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测,探讨miR-1-3p与脓毒症关系。方法纳入2019年1月至8月本院重症医学科脓毒症患者17例,另取9例健康志愿者为对照组。按脓毒症诊疗常规处理,检测血常规、C-反应蛋白、降钙素原(PCT)、白介素6(IL6)等指标。患者及9例健康志愿者均留取2mL血样,并离心3000r/min15min,取上清液,置于-80°C冰箱中备用,将血清通过商业化试剂盒分别提取外周血中外泌体后,对外泌体中含有miR-1-3p表达进行荧光定量PCR检测。结果与健康者比较,脓毒症患者的外周血外泌体中miR-1-3p相对表达量明显增高,有统计学意义(P<0.001),另外患者外周血外泌体miR-1-3p相对表达量与外周血WBC、PCT、hsCRP缺乏相关性(P>0.05),而与IL-6具有明显相关性(r=0.514,P=0.035)。结论脓毒症患者外周血中外泌体miR-1-3p表达量增高,且与早期炎症指标IL-6相关性强,miR-1-3p可能参与了脓毒症早期炎症反应。

lncRNA-HOTAIR通过靶向负调控miR-1-3p抑制脂多糖诱导的H9c2大鼠心肌细胞增殖并促进炎症反应

目的探讨长链非编码RNA-HOX转录本反义基因间RNA(lncRNA-HOTAIR)是否通过靶向微小RNA miR-1-3p调控脓毒症的炎症反应。方法利用0.5μg/mL脂多糖(LPS)诱导H9c2大鼠心肌细胞,建立脓毒症心肌细胞损伤模型,将H9c2细胞分为对照组、LPS组、LPS联合HOTAIR小干扰RNA阴性对照(si-NC)组、LPS联合HOTAIR小干扰RNA(si-HOTAIR)组、LPS联合miR-1-3p阴性对照(miR-NC)组、LPS联合miR-1-3p组、LPS联合si-HOTAIR和miR-1-3p拮抗剂阴性(anti-miR-NC)组、LPS联合siHOTAIR和anti-miR-1-3p组。实时定量PCR检测HOTAIR和miR-1-3p表达,CCK-8法检测细胞增殖,Western blot法分析KI-67抗原(ki67)、P21、B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)的蛋白表达,流式细胞术评估细胞凋亡,ELISA测定炎性因子白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。双荧光素酶报告实验分析HOTAIR和miR-1-3p的靶向关系。结果LPS组H9c2细胞中HOTAIR表达量高于对照组,miR-1-3p表达量低于对照组。与LPS联合si-NC组比较,LPS联合si-HOTAIR组LPS处理H9c2细胞增殖活性、ki67、Bcl2表达量增多,P21表达量、凋亡率、BAX表达量、IL-6和TNF-α水平降低。HOTAIR靶向调控miR-1-3p的表达。LPS联合miR-1-3p组较LPS联合miR-NC组的H9c2细胞增殖活性、ki67、Bcl2表达量升高,P21表达量、凋亡率、BAX表达量、IL-6、TNF-α水平降低。与LPS联合si-HOTAIR和anti-miR-NC组比较,LPS联合si-HOTAIR和anti-miR-1-3p组H9c2细胞增殖活性降低、ki67、Bcl2表达减少,P21、BAX表达,细胞凋亡、IL-6、TNF-α水平增加。结论HOTAIR通过靶向负调控miR-1-3p的表达,抑制LPS诱导的H9c2心肌细胞增殖,并诱导细胞凋亡和炎症反应。

LncRNA FAM225A靶向miR-1-3p基因调控结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡

目的探讨FAM225A对结直肠癌(CRC)细胞恶性生物学行为的影响及机制。方法培养正常人胚胎结肠细胞FHC和CRC细胞SW480、HCT116;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测FAM225A和miR-1-3p表达水平;将SW480、HCT116细胞随机分为control组、si-NC组、si-FAM225A组、miR-NC组、miR-1-3p组、si-FAM225A+anti-miR-NC组、si-FAM225A+anti-miR-1-3p组;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;流式细胞术检测SW480、HCT116细胞的凋亡情况;Transwell检测SW480、HCT116细胞的迁移和侵袭细胞数目;双荧光素酶报告实验检测FAM225A和miR-1-3p的靶向关系。结果与FHC相比,SW480、HCT116细胞中FAM225A表达水平显著升高,miR-1-3p表达水平显著降低(P<0.05)。FAM225A低表达或miR-1-3p高表达,SW480、HCT116细胞的活性降低,克隆形成数目及迁移、侵袭数目均显著减少,而细胞凋亡率升高(P<0.05)。FAM225A靶向调控miR-1-3p,miR-1-3p低表达能逆转FAM225A低表达对SW480、HCT116细胞的作用。结论抑制FAM225A表达可通过上调miR-1-3p抑制CRC SW480、HCT116细胞的恶性生物学行为。

miR-141-3p对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的抑制和改善作用

背景:研究表明,胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子有抑制纤维环细胞凋亡的作用。miR-141-3p微小RNA在骨髓基质细胞中随着年龄的增加而增加,且与炎症信号通路的活化存在一定关系,提示其可能成为腰椎间盘突出症的治疗靶点。目的:探究miR-141-3p通过调控胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子对腰椎间盘突出症大鼠背根神经节炎症及下肢疼痛的影响。方法:选取50只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常组、模型组、miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组、miR-141-3p mimics组,每组10只。除正常组外,其余大鼠采用自体髓核移植法进行腰椎间盘突出症建模。建模成功后,对miR-NC组、miR-141-3p inhibitor组和miR-141-3p mimics组大鼠鞘内分别注射10μL 20μmol/L miR-NC,miR-141-3p inhibitor,miR-141-3p mimics,均每天注射1次,连续注射28 d;正常组、模型组同期同位置注射同体积生理盐水。采用热缩足潜伏期阈值评价大鼠下肢疼痛,实时荧光定量PCR检测背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达,ELISA法检测背根神经节组织炎症因子,免疫印迹法检测背根神经节组织胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子蛋白表达,并分析miR-141-3p与胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子的相关性。结果与结论:miR-NC组各项指标与模型组比较,差异均无显著性意义。①大鼠热缩足潜伏期阈值:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。②背根神经节组织miR-141-3p mRNA表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。③背根神经节组织肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素1含量:模型组明显高于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显高于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显低于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。④背根神经节组织胰岛素样生长因子1、血小板源性生长因子蛋白表达:模型组明显低于正常组(P<0.05),miR-141-3p inhibitor组明显低于miR-NC组(P<0.05),miR-141-3p mimics组明显高于miR-141-3p inhibitor组(P<0.05)。⑤胰岛素样生长因子1与miR-141-3p呈正相关(r=0.904,P<0.001),血小板源性生长因子与miR-141-3p呈正相关(r=0.879,P<0.001)。⑥结论:miR-141-3p可显著改善腰椎间盘突出症大鼠下肢疼痛,抑制背根神经节炎症,其机制可能与促进胰岛素样生长因子1/血小板源性生长因子表达有关。

水飞蓟素通过调控miR-124-3p/WEE1轴影响胶质瘤细胞恶性生长的机制研究

目的探讨水飞蓟素(SM)对胶质瘤细胞恶性生长的影响以及对miR-124-3p/WEE1轴的调控机制。方法将胶质瘤U87细胞分为对照组,SM低、中、高浓度组,SM高浓度+miR-124-3p抑制剂组(SM高+miR-124-3p inhibitor组)。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白的表达,实时定量PCR检测细胞中miR-124-3p和WEE1 mRNA水平,荧光素酶活性实验验证miR-124-3p和WEE1之间的靶向关系,建立NOD/SCID小鼠颅内移植瘤模型并进行给药和分析。结果与对照组比较,不同浓度SM处理组的细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、cyclin D1蛋白表达、WEE1 mRNA表达水平降低,G0/G1周期细胞数、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及miR-124-3p表达升高(P<0.05);进一步转染miR-124-3p inhibitor后发现,SM对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用被逆转。小鼠体内实验显示,SM处理组肿瘤的质量和体积均低于模型组(P<0.05),且小鼠体质量无显著变化(P>0.05)。结论SM可通过上调miR-124-3p靶向下调WEE1抑制胶质瘤细胞的恶性生长。

糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制研究

目的 探究糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制。方法 用小鼠单侧肾切除+腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)模型,选择糖尿病肾病小鼠模型组共45只小鼠,雌性CBA/J 30只,雄性DBA/2 15只,另选正常健康小鼠10只作为正常对照组。将造模的糖尿病肾病小鼠分为模型组、糖肾地黄汤高剂量组(TSDHDHD组)、糖肾地黄汤中剂量组(TSDHDMD组)、糖肾地黄汤低剂量组(TSDHDLD组),每组10只。HE染色检测小鼠的病理学变化,应用全自动生化分析仪对所获得小鼠血清空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG),甘油三酯(Triglyceride, TG),胆固醇(Cholesterol, TC)水平,RT-PCR法分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2mRNA的表达,免疫印迹法(Westernblot, Wb)分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2的蛋白表达。采用SPSS 23.0统计软件。结果 对照组中细胞排列致密整齐、完整,存在少量脂肪细胞(P>0.05);与对照组比较,模型组细胞结构较为散乱,且由稀疏变细,近端脂肪细胞数目增多,差异存在统计学意义(P<0.05);相比模型组,各剂量组糖肾地黄汤脂肪细胞数目下降,比较存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05)。治疗前与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平升高(P<0.05),模型组与不同剂量糖肾地黄汤组相比无统计学差异(P>0.05);与治疗前相比,治疗12周后不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平均降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平明显升高,Bax/Bcl-2mRNA水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达明显升高,Bax/Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2水平降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 糖肾地黄汤可能通过调节lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴,从而达到延缓糖尿病肾病进展的目的。

LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究长链非编码RNA(PURPL)调节微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:细胞实验:将si-NC、si-PURPL、si-PURPL+inhibitor NC、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor分别转染至肝癌细胞Huh-7细胞并命名为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,未做任何处理的Huh-7细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1的关系;qRT-PCR检测人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Huh-7中LncRNA PURPL、miR-342-3p表达;Western blot检测L02细胞、Huh-7细胞PIK3R1蛋白水平;MTT法检测Huh-7细胞增殖情况;流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率;Transwell检测Huh-7细胞侵袭数量;划痕试验测定Huh-7细胞迁移。体内实验:构建裸鼠异种移植模型,分组同细胞实验,检测肿瘤体积和肿瘤重量。结果:细胞实验结果显示:与si-NC组相比,si-PURPL组Huh-7细胞OD490值、划痕愈合率、侵袭细胞数量、LncRNA PURPL、PIK3R1水平显著下降(P<0.05),Huh-7细胞凋亡率、miR-342-3p相对表达量显著升高(P<0.05),而抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的效果;LncRNA PURPL负向调控miR-342-3p/PIK3R1轴。体内结果显示:si-PURPL组裸鼠肿瘤体积和质量较si-NC组下降(P<0.05);抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL对体内肿瘤生长的抑制作用。结论:沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7细胞的恶性生物学行为,其机制可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。

miR-141-3p靶向调控HMGB1对LPS诱导的A549细胞损伤的影响

目的探讨miR-141-3p通过靶向调控高迁移率族蛋白1(HMGB1)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞损伤的影响。方法以Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞作为研究对象,将miR-141-3p mimics、mimics NC、HMGB1基因过表达质粒(pcDNA3.1-HMGB1)和空载质粒(Vector)分别或共转染至A549细胞中,再采用10μg/ml LPS处理24 h。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测各组细胞增殖活性;比色法检测各组细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性;流式细胞术检测各组细胞凋亡水平;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞中白介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证miR-141-3p与HMGB1之间的靶向调控关系。结果LPS干预后,A549细胞增殖活性及细胞中miR-141-3p表达水平降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平及上清液中LDH活性升高(P<0.05)。过表达miR-141-3p可增强LPS处理后的A549细胞增殖活性(P<0.05),降低细胞凋亡率及细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α水平和上清液中LDH活性(P<0.05)。然而,HMGB1基因过表达可逆转miR-141-3p对LPS诱导A549细胞损伤的改善作用。双荧光素酶报告基因实验证实,HMGB1是miR-141-3p下游靶基因。结论miR-141-3p可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,降低炎症因子表达水平,改善A549细胞损伤,其作用机制可能与靶向调控HMGB1表达有关。

NEAT1、miR-27a-3p在阿尔茨海默病患者血清和脑脊液中的表达关系

目的:探究长链非编码RNA核富含丰富的转录本1(long chain non-coding RNA nuclear-enriched abundant transcript 1, LncRNA NEAT1)、miR-27a-3p在阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)患者血清和脑脊液中的表达关系及意义。方法:选择2019年10月至2021年9月天津市第五中心医院神经内科收治的AD患者66例作为病例组,根据临床痴呆评定量表(clinical dementia rating, CDR)评分分为轻度组(≤1分,n=41)与中重度组(>1分,n=25);另取同期门诊其他就诊患者血清和脑脊液标本66例志愿者作为对照组。收集所有受试者的一般资料并评估认知程度,采用实时荧光定量PCR检测血清和脑脊液miR-27a-3p、NEAT1表达水平,酶联免疫吸附试验检测脑脊液β-淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,BACE1)、β淀粉样蛋白(amyloid β,Aβ)40和Aβ42水平,采用Spearman法分析血清miR-27a-3p、NEAT1水平与简易精神状态检测量表的相关性,采用Pearson法分析血清miR-27a-3p、NEAT1水平与Aβ沉积平均标准摄取值比率(standardized uptake value ratio, SUVR)及脑脊液miR-27a-3p、NEAT1、BACE1、Aβ42、Aβ40水平的相关性。结果:MMSE评分[21 (17,25),9(7,11)vs. 27 (21,34)]、MoCA评分[17 (12,21),10 (7,13)vs. 27 (21,31)]、血清miR-27a-3p水平(0.55±0.13,0.46±0.06 vs. 0.97±0.22)、脑脊液miR-27a-3p(0.48±0.10,0.35±0.10 vs. 1.03±0.31)、Aβ42水平[(303.55±36.77) ng/L,(231.45±34.14) ng/L vs.(499.99±53.63) ng/L]及Aβ42/Aβ40比值(0.030±0.008, 0.022±0.007 vs. 0.048±0.010)轻度组、中重度组AD患者均低于对照组(P均<0.05),且中重度组AD患者较轻度组低(P均<0.05);血清NEAT1水平(2.31±0.64,3.13±0.76 vs. 1.05±0.20)、SUVR(1.50±0.29,1.76±0.52 vs. 0.74±0.15)及脑脊液NEAT1(3.51±1.24,4.30±1.65 vs. 1.01±0.23)、BACE1水平[(55.78±5.98)μg/L,(72.32±16.08)μg/L vs.(21.39±3.73)μg/L]轻度组、中重度组AD患者均高于对照组(P均<0.05),且中重度组AD患者较轻度组高(P均<0.05)。AD患者血清NEAT1水平与SUVR及脑脊液NEAT1、BACE1呈正相关(r=0.350,0.606,0.341,P<0.05),与MMSE评分、MoCA评分呈负相关(r=-0.473,-0.482,P均<0.05);血清miR-27a-3p水平与脑脊液miR-27a-3p水平、MMSE评分、MoCA评分呈正相关(r=0.695,0.424,0.412,P<0.05),与SUVR及脑脊液BACE1水平呈负相关(r=-0.521、-0.447,P均<0.05)。结论:NEAT1、miR-27a-3p在AD患者血清及脑脊液中表达趋势具有一致性,NEAT1水平均升高,miR-27a-3p水平均降低,二者水平呈负相关,与AD患者脑中Aβ沉积程度有关,并参与AD的病情进展。

miR-19b-3p靶向IGF-1参与绒毛膜癌发生发展的机制研究

目的探究miR-19b-3p靶向胰岛素样生长因子-1(IGF-1)参与绒毛膜癌增殖、侵袭和转移的机制。方法以人绒毛膜癌细胞系JEG-3为研究对象,A组:miR-19b-3p mimics组,B组:miR-19b-3p mimics NC组,C组:miR-19b-3p inhibitor组,D组:miR-19b-3p inhibitor NC组,E组:空白对照组。A组、B组、C组、D组按照分组情况进行相应转染,E组不做任何处理。分别用Real-time PCR和Western blot检测五组miR-19b-3p RNA和IGF-1蛋白表达水平,采用CCK-8法测定细胞增殖,采用划痕实验和Transwell小室侵袭实验测定细胞迁移和侵袭能力,并进行比较;采用双荧光素酶(Dualluciferase)报告实验验证miR-19b-3p对IGF-1的靶向关系。结果与E组的(0.98±0.13)相比,A组miR-19b-3p mRNA表达水平(2.23±0.16)明显上调,C组miR-19b-3p mRNA表达水平(0.73±0.08)明显下调(P<0.05)。与E组的(1.03±0.03)nmol/L相比,A组IGF-1蛋白表达水平(1.48±0.12)nmol/L明显上调,C组IGF-1蛋白表达水平(0.76±0.05)nmol/L明显下调(P<0.05)。72 h时,与E组的(5.03±0.14)%相比,A组细胞增殖活力(10.34±0.87)%明显增加,C组细胞增殖活力(2.42±0.13)%明显下调(P<0.05);与E组的(1.09±0.07)mm相比,A组细胞划痕迁移距离(1.45±0.08)mm明显增加,C组细胞划痕迁移距离(0.73±0.07)mm明显减少(P<0.05)。与E组的(103.00±7.00)个相比,A组侵袭细胞数(173.00±4.00)个明显增加,C组侵袭细胞数(82.00±1.00)个明显减少(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示:miR-19b-3p转染WT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.57±0.08)Kat低于miR-NC的(0.95±0.06)Kat(P<0.05);miR-19b-3p转染MUT-IGF-1的细胞荧光素酶活性(0.98±0.05)Kat与miR-NC的(0.96±0.06)Kat比较无明显差异(P>0.05)。结论miR-19b-3p靶向上调IGF-1促进绒毛膜癌JEG-3细胞增殖、侵袭、迁移。

miR-132-3p/CAMTA1对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠施万细胞的调控作用

目的探讨miR-132-3p通过钙调素结合转录因子1(CAMTA1)对I-125粒子处理的面神经损伤大鼠(FNI)中施万细胞的调控作用。方法用I-125粒子辐射大鼠施万细胞,并在细胞中转染miR-132-3p mimic、miR-132-3p inhibitor以及sh-CAMTA1。免疫荧光检测S100B和β-TubulinⅢ荧光强度。RT-qPCR检测miR-132-3p的表达,Western blot检测CAMTA1蛋白表达。EdU染色评估细胞增殖,Transwell检测细胞迁移。同时,构建FNI大鼠模型并在大鼠面部植入I-125粒子,HE、LFB染色以及IF染色评估大鼠面神经组织的病理损伤。StarBase v2.0数据库和双荧光素酶报告实验验证miR-132-3p和CAMTA1的靶向关系。结果S100B和β-TubulinⅢ在大鼠施万细胞中显著表达。I-125粒子辐射组中miR-132-3p表达降低(P<0.001),抑制细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.001)。过表达miR-132-3p或敲降CAMTA1显著促进施万细胞的增殖(P<0.001)和迁移(P<0.05),敲降miR-132-3p则具有相反的作用。机制研究显示,miR-132-3p靶向负调控CAMTA1。体内实验结果显示,过表达miR-132-3p通过抑制CAMTA1的蛋白表达,减弱I-125粒子对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。结论过表达miR-132-3p抑制CAMTA1的表达,促进施万细胞的增殖和迁移,抑制I-125对FNI大鼠面神经损伤的促进作用。

miR-26b-3p靶向CREB1调控神经胶质瘤细胞的增殖、迁移及侵袭

目的探讨miR-26b-3p靶向调控环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)表达水平影响胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的分子机制。方法运用RT-qPCR和Western blotting检测不同级别胶质瘤中miR-26b-3p和CREB1的表达情况;生物信息学方法分析miR-26b-3p与CREB1结合的靶向序列。采用双荧光素酶报告基因检测miR-26b-3p对CREB1的靶向调控机制;将胶质瘤U251细胞分为对照组、miR-26b-3p mimic组及miR-26b-3p inhibitor组,采用Western blotting检测CREB1的表达变化,采用CCK-8法检测各组细胞增殖能力的影响,采用划痕实验检测各组细胞迁移能力的影响,采用Transwell检测各组细胞侵袭能力的影响,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡的影响。结果miR-26b-3p的表达随着胶质瘤级别的增加而降低(P<0.05),而CREB1的表达则逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05);双荧光素酶报告基因结果显示miR-26b-3p可显著影响CREB13′UTR表达载体的荧光素酶活性,CREB1是miR-26b-3p下游靶基因。抑制miR-26b-3p表达可上调CERB1的表达,进而抑制细胞凋亡,促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。过表达miR-26b-3p可下调CERB1的表达,促进细胞凋亡,抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭(P<0.05)。结论miR-26b-3p可靶向调控CREB1的表达调节胶质瘤细胞的凋亡、增殖、迁移和侵袭,进而参与胶质瘤的发生发展。