黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

miR-125a-5p通过靶向STAT3减轻戊四唑诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应

目的:探讨miR-125a-5p通过靶向信号转导与转录激活因子3(STAT3)对戊四唑(PTZ)诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应的影响。方法:采用PTZ点燃法建立大鼠癫痫模型,并将其随机分为6组:Con组、PTZ组、PTZ+agomir NC组、PTZ+miR-125a-5p agomir组、PTZ+miR-125a-5p agomir+pcDNA组和PTZ+miR-125a-5p agomir+pc-STAT3组,评价miR-125a-5p对大鼠癫痫持续时间、潜伏期、惊厥次数和严重程度的影响。qRT-PCR检测miR-125a-5p和STAT3 mRNA表达;改良神经系统严重程度评分(mNSS)、开场实验和Rotarod测试评价癫痫大鼠的神经功能;Morris水迷宫实验评价癫痫大鼠的认知功能;免疫染色观察海马CA1和CA3区域神经元凋亡;ELISA检测海马组织炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18)水平;Western blot检测海马组织中STAT3蛋白表达;双荧光素酶实验验证miR-125a-5p和STAT3的关系。结果:在PTZ诱导的癫痫大鼠中,miR-125a-5p表达上调,STAT3表达下调,且miR-125a-5p靶向抑制STAT3表达。与PTZ组相比,PTZ+miR-125a-5p agomir组癫痫大鼠的潜伏期缩短,癫痫评分降低,癫痫发作时间和次数减少,mNSS降低,掉落潜伏期及外围区域的移动距离、开放区域的总距离延长,逃避潜伏期显著降低,穿越平台次数及停留在目标象限的时间和游泳距离均增加,海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18表达降低,CA3和CA1区的NenN+细胞增多(P<0.05);STAT3过表达可逆转miR-125a-5p agomir对癫痫大鼠神经功能障碍及炎症反应的缓解作用(P<0.05)。结论:miR-125a-5p通过靶向下调STAT3,减轻PTZ诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应。

基于生物信息学分析肝硬化与miR-125a-5p和miR-125b-5p的相关研究

目的:基于生物信息学分析肝硬化与miR-125a-5p和miR-125b-5p的功能富集通路以及关键基因,以期为肝硬化诊断与治疗提供新思路。方法:通过miRDB、miRWalk和TargetScan数据库获得miR-125a-5p和miR-125b-5p的靶基因,从GEO数据库获得肝硬化相关数据集GSE14323和GSE25097,筛选正常组织样本和肝硬化组织样本差异表达基因,将GSE25097和GSE14323所得差异表达基因取交集,获得肝硬化数据集的共表达基因,将miR-125a-5p和miR-125b-5p的靶基因与肝硬化数据集GSE14323和GSE25097的共表达基因取交集得到核心基因,对核心基因进行GO和KEGG富集以及构建PPI网络互作图。结果:GO富集分析中主要在糖氧代谢过程和线粒体外膜的活性中富集,KEGG富集分析中主要在脂肪酸生物合成和类固醇生物代谢等中富集,通过构建PPI网络互作图,得到miR-125a-5p和miR-125b-5p与肝硬化相关的4个关键基因NPL、H6PD、KIAA0319L和RFX5。结论:得到的相关通路以及4个关键基因NPL、H6PD、KIAA0319L和RFX5以期为肝硬化发病机制以及肝硬化发生发展过程中相关分子靶点和早期筛查的手段提供新思路,从而指导疾病诊疗计划和管理。

circFADS2靶向miR-125a-5p调控MPP+诱导的SK-N-SH细胞损伤的机制

目的:探究circFADS2靶向miR-125a-5p调控帕金森病(PD)细胞炎症反应和凋亡的机制。方法:100μmol/L MPP+诱导SK-N-SH细胞建立PD模型,分为Con组、PD组、PD+pcDNA组、PD+pcDNA-circFADS2组、PD+anti-miR-NC组、PD+anti-miR-125a-5p组、PD+pcDNA-circFADS2+miR-NC组、PD+pcDNA-circFADS2+miR-125a-5p组。qRT-PCR检测circFADS2和miR-125a-5p表达;ELISA检测IL-1β、TNF-α含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达;双荧光素酶报告实验检测circFADS2与miR-125a-5p的靶向关系。结果:与Con组相比,PD组circFADS2表达降低,miR-125a-5p表达、凋亡率、IL-1β、TNF-α含量、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达升高(P<0.05)。circFADS2过表达或干扰miR-125a-5p表达可降低MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡率、IL-1β、TNF-α含量、cleaved-caspase3、cleaved-caspase9蛋白表达(P<0.05)。circFADS2靶向负调控miR-125a-5p表达,上调miR-125a-5p表达逆转了circFADS2过表达对PD细胞炎症反应和凋亡的作用。结论:circFADS2过表达通过降低miR-125a-5p表达抑制PD细胞炎症反应和凋亡。

CircLRP6调节miR-125a-5p/MCL1轴对食管鳞癌顺铂耐药性的影响

目的探讨环状RNA脂蛋白受体6(circLRP6)对食管鳞癌(ESCC)顺铂(CDDP)耐药性的影响及潜在分子机制。方法建立KYSE30的CDDP抗性细胞株(KYSE30/CDDP-R),分为对照(Control)组、si-NC组、si-circLRP6组、si-circLRP6+anti-NC组、si-circLRP6+anti-miR-125a-5p组。采用RT-qPCR和Western blot检测组织/细胞中circLRP6、miR-125a-5p和髓样细胞白血病-1(MCL-1)的表达水平;CCK-8法检测KYSE30/CDDP-R细胞的CDDP敏感性;流式细胞术检测细胞凋亡。结果ESCC癌组织/细胞和CDDP耐药癌组织中circLRP6、MCL-1 mRNA水平升高,miR-125a-5p水平降低(P<0.001);circLRP6沉默可上调miR-125a-5p,抑制MCL-1表达,增强体内外CDDP抗性ESCC细胞对CDDP的敏感性,促进CDDP抗性ESCC细胞凋亡;抑制miR-125a-5p可减弱circLRP6沉默对CDDP抗性ESCC细胞中CDDP耐药性和细胞凋亡的影响。circLRP6可靶向负调控miR-125a-5p表达,MCL-1是miR-125a-5p的靶标。结论circLRP6沉默可能通过miR-125a-5p/MCL-1轴增强CDDP抗性ESCC细胞对CDDP的敏感性。

miR-125a-5p通过黏着斑通路对铝染毒GC2-spd细胞凋亡的影响

目的 探讨miR-125a-5p在铝染毒小鼠精母细胞系(GC2-spd)模型中对黏着斑信号通路及GC2-spd细胞凋亡的影响。方法 建立铝染毒GC2-spd细胞模型,分为对照组(CG),铝染毒组(ALG),铝染毒组+miR-125a-5p inhibitor阴性对照组(ALG+inhibitor NC)及铝染毒组+miR-125a-5p inhibitor组(ALG+inhibitor);利用RT-qPCR检测ALG与CG细胞中miR-125a-5p的表达情况;利用Western blot检测CG组、ALG组、ALG+inhibitor NC组及ALG+inhibitor组Itga7、Pak4、Akt1、Bax及Caspase-9的表达情况;利用CCK8实验及流式细胞术实验检测各组GC2-spd细胞的活性和凋亡率。结果 RT-qPCR结果显示,与对照组比较,ALG组细胞中miR-125a-5p的表达显著升高;Western blot结果显示,抑制miR-125a-5p的表达后,可显著升高铝染毒GC2-spd细胞中Itga7、Pak4和Akt1的表达,降低Bax及Caspase-9的表达;CCK8和流式细胞术实验结果显示,抑制miR-125a-5p的表达后,可显著提高GC2-spd细胞的活性,降低细胞的凋亡率。结论 miR-125a-5p inhibitor可通过提高Itga7、Pak4和Akt1的表达,促进黏着斑信号通路激活,抑制细胞凋亡,提高细胞的活性,从而抑制铝染毒GC2-spd细胞的凋亡作用。

circSHKBP1通过靶向miR-125a-5p调控结肠癌细胞增殖和凋亡

背景 结肠癌是临床上常见的一种恶性肿瘤,有研究报道,环状RNA(circular RNA,circR NA)参与结肠癌的发生发展.其中,circSHKBP1作为癌基因促进癌症进展,因此我们假设circSHKBP1也参与结肠癌的发展.目的 探讨circSHKBP1对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能作用机制.方法 选取本院2020-03/2020-07的69例结肠癌组织及癌旁组织标本,qRT-PCR检测circSHKBP1、miR-125a-5p的表达量;体外培养人结肠癌细胞HT29,随机分组:sh-NC组、sh-circSHKBP1组、miR-NC组、miR-125a-5p组、sh-circSHKBP1+anti-miR-NC组、shcircSHKBP1+anti-miR-125a-5p组;采用MTT法、平板克隆形成、和流式细胞术检测细胞增殖、克隆形成及凋亡;采用双荧光素酶报告验证miR-125a-5p过表达对野生型(wild-type,WT)载体wt-circSHKBP1的荧光素酶活性;采用Western blot检测b细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(BCL-2-associated X protein,Bax)蛋白表达.结果 在结肠癌组织中circSHKBP1的表达上调(P<0.05),miR-125a-5p的表达下降(P <0.05);相对sh-NC组,沉默circSHKBP1显著降低结肠癌细胞的增殖率、提高凋亡率和Bax的表达,降低了细胞克隆形成数,减少Bcl-2的表达(P<0.05);miR-125a-5p过表达可降低wt-circSHKBP1的荧光素酶活性(P <0.05);与miR-NC组对照,miR-125a-5p组降低增殖率、提高凋亡率和Bax的表达,减少细胞克隆形成数,降低Bcl-2的表达(P<0.05);相对sh-circSHKBP1+anti-miR-NC组,shcircSHKBP1+anti-miR-125a-5p组提高了肿瘤细胞增殖率、降低了凋亡率和Bax的表达,增加了细胞克隆形成数,提高了Bcl-2的表达(P<0.05).结论 敲低circSHKBP1可通过靶向miR-125a-5p表达抑制结肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡.

miR-125b-5p通过负调控RAB3D基因表达抑制骨肉瘤细胞增殖与迁移

目的 探讨miR-125b-5p调控RAB3D在骨肉瘤增殖与迁移中的作用机制。方法 通过qRT-PCR检测正常骨细胞hFOB1.19、骨肉瘤细胞系(MG63、HOS)中miR-125b-5p的表达水平。骨肉瘤细胞系中通过脂质体转染升高或降低miR-125b-5p的表达,通过EDU和Transwell实验检测骨肉瘤细胞增殖和迁移的变化;通过生物信息学软件预测miR-125b-5p可能调控的靶基因为RAB3D;通过Western blot检测正常骨细胞h FOB1.19、骨肉瘤细胞系(MG63、HOS)中RAB3D的表达水平;骨肉瘤细胞系中通过脂质体转染升高或降低miR-125b-5p的表达,通过Western blot及qRT-PCR实验检测骨肉瘤细胞中RAB3D mRNA及蛋白表达水平;并在骨肉瘤细胞中通过脂质体转染升高或降低RAB3D的表达,通过EDU和Transwell实验检测骨肉瘤增殖和迁移的变化;随后在骨肉瘤细胞中通过脂质体转染同时升高miR-125b-5p和RAB3D的表达量,通过EDU和Transwell实验检测骨肉瘤细胞增殖和迁移的变化。结果 qRT-PCR结果表明在骨肉瘤细胞(MG63、HOS)中miR-125b-5p的表达明显下调(P<0.05)。3种生物信息学软件预测RAB3D是miR-125b-5p可能调控的靶基因。qRT-PCR、Western blot结果显示,miR-125b-5p表达量升高,骨肉瘤细胞(MG63、HOS)中RAB3D的蛋白表达量下降(P<0.05);miR-125b-5p表达量降低,骨肉瘤细胞(MG63、HOS)中RAB3D的蛋白表达量下降(P<0.05),而RAB3D的mRNA水平没有发生变化。细胞增殖及迁移实验结果显示,miR-125b-5p与RAB3D对细胞增殖及迁移的影响相反,而同时在骨肉瘤细胞内升高miR-125b-5p与RAB3D的表达量,RAB3D对骨肉瘤细胞增殖及迁移的影响在重新升高miR-125b-5p表达量时被阻断(P<0.05)。结论 miR-125b-5p在转录后水平通过调控RAB3D的表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖和迁移。

甲状腺癌患者NF-κB mRNA、miR-125a-5p与临床病理特征及预后的关系

目的探究甲状腺癌患者核转录因子-κB(NF-κB)mRNA、miR-125a-5p与临床病理特征及预后的关系。方法选取2017年5月—2020年4月240例甲状腺癌手术患者作为观察组,另选取同期体检健康者60例作为对照组。比较2组NF-κB mRNA、miR-125a-5p水平,分析甲状腺癌患者NF-κB mRNA、miR-125a-5p水平与临床病理特征的关系,比较复发与未复发患者临床资料,分析NF-κB mRNA、miR-125a-5p水平与甲状腺癌术后复发的关系及NF-κB mRNA、miR-125a-5p间的相关性,采用受试者工作特征曲线评价NF-κB mRNA、miR-125a-5p检测对甲状腺癌术后复发的预测价值。结果观察组NF-κB mRNA水平高于对照组,miR-125a-5p水平低于对照组(P<0.05)。甲状腺癌患者NF-κB mRNA、miR-125a-5p水平在肿瘤大小、临床分期、血管间隙浸润及淋巴结转移方面比较差异有统计学意义(P<0.01)。甲状腺癌术后复发患者肿瘤大小>5 cm、临床分期Ⅲ~Ⅳ期、血管间隙浸润及淋巴结转移比例和术后1周NF-κB mRNA水平均高于未复发患者,术后1周miR-125a-5p水平及NF-κB mRNA、miR-125a-5p手术前后差值绝对值均低于未复发患者(P<0.05,P<0.01)。NF-κB mRNA、miR-125a-5p手术前后差值绝对值是甲状腺癌术后复发的影响因素(P<0.01)。NF-κB mRNA、miR-125a-5p手术前后差值绝对值联合预测甲状腺癌术后复发的曲线下面积为0.927,高于各指标单独预测的曲线下面积(0.831、0.775)(P<0.05)。相关性分析可知,甲状腺癌患者NF-κB mRNA与miR-125a-5p呈负相关(r=-0.765,P<0.01)。结论甲状腺癌患者NF-κB mRNA水平上调,miR-125a-5p水平下调,临床检测手术前后差值绝对值,可预测其术后复发情况,便于术后早期制订辅助治疗方案。

重楼皂苷在miR-125a-5p靶向调控GAB2诱导乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用及机制研究

目的探讨重楼皂苷(RPS)在miR-125a-5p靶向调控Grb2相关结合蛋白2(GAB2)诱导乳腺癌细胞增殖和凋亡中的作用及机制。方法取人乳腺癌细胞系MCF-7和人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,采用qRT-PCR、Western blot法分别检测并比较两者miR-125a-5p、GAB2表达水平。再将MCF-7细胞按随机数字表法分成6组:RPS 0μg/mL组、RPS 80μg/mL组、RPS 80μg/mL+阴性抗体组、RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p组、RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+阴性干扰组和RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+si-GAB2组,每组设3个复孔;培养48 h后检测并比较miR-125a-5p、GAB2、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达水平以及细胞增殖率、细胞凋亡率。将GAB2与空白质粒和过表达miR-125a-5p质粒共转染到MCF-7细胞中,采用荧光素酶Promega检测法检测miR-125a-5p与GAB2的靶向作用。结果与MCF-10A细胞比较,MCF-7细胞中miR-125a-5p表达水平较低(P<0.05),GAB2表达水平较高(P<0.05)。与RPS 0μg/mL组比较,RPS 80μg/mL组和RPS 80μg/mL+阴性抗体组miR-125a-5p、Bax表达水平和细胞凋亡率均明显升高(均P<0.05),细胞增殖率和Bcl-2表达水平均明显降低(均P<0.05);RPS 80μg/mL组和RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+阴性干扰组GAB2表达水平均明显降低(均P<0.05)。与RPS 80μg/mL组、RPS 80μg/mL+阴性抗体组比较,RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p组miR-125a-5p表达水平均明显降低(均P<0.05);RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p组和RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+阴性干扰组细胞增殖率和Bcl-2表达水平均明显升高(均P<0.05),细胞凋亡率和Bax表达水平均明显降低(均P<0.05)。与RPS 80μg/mL组、RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+阴性干扰组比较,RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+si-GAB2组GAB2表达水平均明显降低(均P<0.05)。与RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p组、RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+阴性干扰组比较,RPS 80μg/mL+anti-miR-125a-5p+si-GAB2组细胞增殖率和Bcl-2表达水平均明显降低(均P<0.05),细胞凋亡率和Bax表达水平均明显升高(均P<0.05)。GAB2与miR-125a-5p的结合位点为CAGGGA,GAB2的突变位点为AGUCCC;miR-125a-5p与GAB2野生型结合能明显降低荧光活性比(P<0.05),但与GAB2突变型结合不影响荧光活性比(P>0.05)。结论RPS能够介导miR-125a-5p/GAB2轴发挥抗肿瘤活性,具体机制可能与miR-125a-5p发挥抑癌效应来负向调控GAB2蛋白表达,进而影响乳腺癌细胞的增殖和凋亡能力有关。

miR-125a-5p基因敲除C57BL/6J小鼠的构建

目的:构建miR-125a-5p基因敲除小鼠并进行基因鉴定,并探讨基因敲除小鼠体内miR-125a-5p对靶基因Foxp3的调控。方法:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以C57BL/6J小鼠为背景,对miR-125a-5p基因位点进行基因敲除,培育纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠。采用裂解法提取鼠尾组织基因组DNA,进行PCR反应检测亲代纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠基因型,并选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠作为亲代种鼠进行配种繁殖。通过全自动蛋白表达分析系统检测小鼠脾脏组织Foxp3的蛋白表达。结果:成功构建miR-125a-5p基因敲除小鼠,琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物为240 bp或0 bp单条带的为纯合型基因敲除(KO)小鼠,鉴定获得668 bp或428 bp单条带的为野生型(WT)小鼠,与预期的目的基因片段分子量大小一致,成功鉴定了miR-125a-5p基因敲除小鼠的基因型。选用雌、雄均为纯合子的基因敲除鼠进行配种繁育,获得了一批miR-125a-5p敲除纯合子基因型小鼠。与WT小鼠相比,miR-125a-5p基因敲除小鼠的脾脏组织中Foxp3表达降低(P<0.05)。结论:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了纯合miR-125a-5p基因敲除小鼠,miR-125a-5p基因的缺失参与靶基因Foxp3的表达调控,为进一步研究miR-125a-5p在自身免疫性疾病中的发生机制提供前期基础。

不明原因复发性流产患者绒毛组织中hsa-miR-125a-5p及其靶基因表达的研究

目的检测不明原因复发性流产(URSA)患者绒毛组织中差异微小RNA(miRNA)hsa-miR-125a-5p及其可能靶基因基质金属蛋白酶2(MMP-2)的表达,探索hsa-miR-125a-5p与URSA发病的可能关系。方法选取2020年1月至2021年10月于北京市海淀区妇幼保健院诊治的25例URSA患者为研究对象(URSA组),同期28例正常早孕妇女作为对照(对照组)。采用实时荧光定量PCR方法检测两组绒毛组织中hsa-miR-125a-5p的相对表达量和MMP-2 mRNA水平;采用免疫组化方法检测MMP-2的蛋白水平。结果URSA组绒毛组织hsa-miR-125a-5p的相对表达量显著高于对照组[(1.54±0.59)vs.(0.43±0.12),P<0.05],而MMP-2 mRNA[(0.22±0.21)vs.(2.61±1.22)]和蛋白表达水平[(11.15±3.11)vs.(71.67±18.05)]均显著低于对照组(P<0.05)。结论URSA患者绒毛组织中hsa-miR-125a-5p的表达异常,可能影响其靶基因MMP-2的正常表达,从而导致胚胎粘附和植入能力下降、滋养细胞侵袭能力受损,导致复发性流产发生。

CircSLC6A6调节miR-125a-5p/PUM2轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨环状溶质载体家族6成员6(CircSLC6A6)调节微小RNA分子miR-125a-5p/pumilio同源物2(PUM2)轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响。方法:以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测体外培养的人子宫内膜上皮细胞与人子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、KLE、Ishikawa中CircSLC6A6、miR-125a-5p与PUM2的表达。将体外培养的人子宫内膜癌细胞HEC-1-A随机分为5组:对照组、CircSLC6A6敲低组(转染CircSLC6A6 siRNA质粒)、miR-125a-5p抑制组(转染miR-125a-5p抑制剂)、阴性对照组(转染空载质粒和miR-125a-5p抑制阴性对照)、共转染(转染CircSLC6A6 siRNA质粒+miR-125a-5p抑制剂)组。以CCK-8法及细胞克隆实验、Hoechst 33258染色及流式细胞实验、以划痕实验及Transwell实验检测各组HEC-1-A细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况;以qRT-PCR实验检测各组HEC-1-A细胞miRv125a-5p及PUM2 mRNA表达;以免疫印迹实验检测各组HEC-1-A细胞凋亡蛋白(caspase-9、Bax)、上皮间质转化标志蛋白(Vimentin、E-cadherin)表达;以双荧光素酶报告基因实验检测HEC-1-A细胞中CircSLC6A6对miR-125a-5p和miR-125a-5p对PUM2的靶向调控作用。结果:(1)与人子宫内膜上皮细胞相比,人子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、Ishikawa、KLE中CircSLC6A6 mRNA、PUM2 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-125a-5p mRNA表达显著降低(P<0.05)。(2)与对照组相比,CircSLC6A6敲低组细胞呈现典型凋亡形态改变,细胞活力、相对细胞集落数、细胞迁移距离、侵袭细胞数、细胞PUM2 mRNA及Vimentin蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、细胞miR-125a-5p及caspase-9、Bax、E-cadherin蛋白表达均升高(P<0.05);miR-125a-5p抑制组细胞各指标变化趋势与CircSLC6A6敲低组相反;阴性对照组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与CircSLC6A6敲低组相比,共转染组细胞的细胞核凋亡形态改变得到改善,各指标变化趋势与其相反,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)在HEC-1-A细胞中CircSLC6A6可靶向下调miR-125a-5p的表达,而miR-125a-5p可靶向下调PUM2的表达。结论:CircSLC6A6通过靶向下调miR-125a-5p而上调PUM2,可能促使子宫内膜癌进展,敲低CircSLC6A6通过促进miR-125a-5p分泌而降低PUM2表达,可能抑制子宫内膜癌细胞增殖、集落形成和上皮间质转化,并促进其凋亡。

MiR-125a-5p靶向胰岛素样生长因子1受体调节川崎病中内皮细胞的增殖和迁移

目的:探讨miR-125a-5p靶向胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)对川崎病内皮细胞增殖与迁移的影响。方法:培养人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs),将细胞分为对照组(20%正常人血清)、20%川崎病血清组(20%川崎病患儿血清)、20%川崎病血清+抵制剂(inhibitor)正常对照(normal control,NC)组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+siRNA组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+si IGF1R组,除对照组添加20%正常人血清外,其余各组均添加20%川崎病患儿血清培养。定量RT-PCR法测定miR-125a-5p、IGF1R mRNA表达水平,蛋白质印迹法测定IGF1R蛋白表达;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法测定HCAECs细胞增殖能力;Transwell法测定细胞迁移能力;蛋白质印迹法测定Ki-67、血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cad)、p120连环蛋白(p120-catenin,p120ctn)水平;构建野生型IGF1R重组质粒(pGL4-IGF1R-WT)和突变型IGF1R重组质粒(pGL4-IGF1R-MUT),将HCAECs细胞分为mimic-NC+pGL4-IGF1R-WT组、miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-WT组、mimic-NC+pGL4-IGF1R-MUT组、miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-MUT组,双荧光素酶报告实验测定miR-125a-5p与IGF1R mRNA的水平。结果:与对照组相比,20%川崎病血清组HCAECs细胞5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)结合率、miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均升高(均P<0.05),IGF1R mRNA与蛋白水平、HCAECs细胞光密度(optical density,OD)值、Ki-67均降低(均P<0.05);与20%川崎病血清组相比,20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组HCAECs细胞EdU结合率、miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均降低,IGF1R mRNA水平与蛋白水平、HCAECs细胞OD值、Ki-67均升高(均P<0.05);与20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组相比,20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+si IGF1R组HCAECs细胞EdU结合率miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均升高(均P<0.05),IGF1R mRNA与蛋白水平、HCAECs细胞OD值、Ki-67均降低(均P<0.05);与mimic-NC+pGL4-IGF1R-WT组对比,miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05);与mimic-NC+pGL4-IGF1R-MUT组相比,miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-MUT组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:川崎病内皮细胞损伤模型中miR-125-5p呈高表达,IGF1R呈低表达,miR-125-5p下调可靶向上调IGF1R表达,促进细胞增殖、迁移。

LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子轴参与心力衰竭发生发展的机制研究

目的 探讨LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子轴参与心力衰竭发生发展的机制。方法 购置SD大鼠40只,随机取大鼠10只为对照组,剩余大鼠30只采用结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌梗死后形成心肌梗死模型,于第14日取材组织并完成HE染色;观察组随机分为模型组、空载组和MALAT1沉默组,利用慢病毒转染干扰LncRNA-MALAT1序列(LV-shMALAT1)及其空载(LV-Control)观察治疗大鼠的干预效果。采用实时荧光PCR法和Western Blot检测LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表达水平;采用酶联免疫吸附试验测定炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)。结果 观察组EF及左室短轴缩短率低于对照组(P<0.05);MALAT1沉默组EF及左室短轴缩短率高于模型组及空载组(P<0.05);HE染色结果显示,模型组和空载组心肌纤维断裂,细胞核紊乱、肥大、间隙增宽、染色加深;MALAT1沉默组心肌纤维断裂有所改善,细胞排列相对整齐;MALAT1沉默组LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表达低于模型组与空载组(P<0.05);PDCD4mRNA及蛋白表达高于模型组与空载组(P<0.05);模型组与空载组炎性因子TNF-α和IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05);MALAT1沉默组炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型组与空载组(P<0.05)。结论 心力衰竭大鼠中LncRNA-MALAT1表达显著下调,能竞争性结合miR-125b-5p,使其解除对PDCD4的抑制,促进PDCD4表达,从而抑制炎性反应。

黄芩素经由miR-125b-5p/IRF4轴进而促进喉癌细胞死亡并抑制其侵袭的机制研究

目的:探讨黄芩素诱导人喉癌细胞凋亡的机制。方法:选取AMC-HN-8细胞为研究对象,以不同浓度黄芩素(0、10、30、100、300μmol/L)作用于细胞,采用CCK-8法检测其半数抑制浓度(IC50);采用蛋白质印迹法(Western blot)检测Bax、cleaved-caspase-3、Cyto-c、IRF4蛋白表达;RTqPCR检测miR-125b-5p和IRF4的表达;双荧光素酶报告基因验证Targetscan预测结果(miR-125b-5p与IRF4-3'UTR的结合);凋亡和坏死抑制剂探索黄芩素诱导喉癌细胞的死亡方式。再将AMCHN-8分为:空白组、黄芩素(IC50)、miR-125b-5p inhibitor组、黄芩素+inhibitor NC组、黄芩素+miR-125b-5p inhibitor组,细胞侵袭和克隆形成实验分别检测细胞的侵袭和增殖能力;采用流式细胞术检测细胞凋亡。结果:黄芩素以剂量依赖性方式抑制AMC-HN-8细胞的增殖,其IC50值为47.31μmol/L;与空白组相比,47.31μmol/L的黄芩素诱导了细胞凋亡和抑制了细胞侵袭,同时上调了miR-125b-5p的表达,抑制了IRF4的mRNA和蛋白的水平。荧光素酶结果表明,相对于NC模拟物(mimic)组,miR-125b-5p mimic能够抑制IRF4-3'UTR启动子的活性。黄芩素以凋亡的方式诱导喉癌细胞死亡。另外,47.31μmol/L的黄芩素与miR-125b-5p inhibitor联合影响AMC-HN-8细胞行为学的结果表明,与空白组比较,黄芩素组细胞克隆数减少,侵袭能力减弱,凋亡增加;miR-125b-5p inhibitor组细胞克隆数增加,侵袭能力加强,凋亡减少;黄芩素+inhibitor NC组则与黄芩素一致,inhibitor NC对细胞行为学没有显著影响;黄芩素+miR-125b-5p inhibitor组细胞克隆、侵袭、凋亡则介于黄芩素组与miR-125b-5p inhibitor组之间。结论:黄芩素能抑制AMC-HN-8细胞增殖,其机制可能与miR-125b-5p靶向抑制IRF4的表达,诱导促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、Cyto-c,抑制凋亡抑制蛋白Bcl-2从而诱导细胞凋亡有关。

miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α参与小胶质细胞活化

目的 观察miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α在BV-2小胶质细胞炎症模型中对小胶质细胞的活化作用。方法 首先用LPS 150μg/L+IFN-γ 20μg/L建立BV-2小胶质细胞炎症模型;将BV-2小胶质细胞分为对照组(Con组)、小胶质细胞炎症模型组(LPS+IFN-γ组),用实时荧光定量PCR检测miR-125a-5p、HIF1AN mRNA表达水平,用Western blotting检测iNOS和HIF-1α蛋白的表达。再通过调控miR-125a-5p、HIF-1α的表达,用荧光定量PCR法检测miR-125a-5p,HIF-1α、促炎因子(包括IL-1β、TNF-α)、M1极化标志物iNOS mRNA表达水平,用Western blotting法检测HIF1AN、HIF-1α的蛋白表达量。结果 与Con组相比,LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,iNOS、IL-1β和TNF-α mRNA表达升高(P<0.05),HIF1AN mRNA表达下降(P<0.05),HIF-1α、iNOS蛋白表达升高(P<0.05)。上调miR-125a-5p后,与NC agomir+LPS+IFN-γ组相比,miR agomir+LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达升高(P<0.05),HIF1AN蛋白表达下降(P<0.05),HIF-1α蛋白表达升高(P<0.05);下调miR-125a-5p表达后,与NC antagomir+LPS+IFN-γ组相比,miR antagomir+LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达下降(P<0.05),HIF1AN蛋白表达上升(P<0.05),HIF-1α蛋白表达下降(P<0.05);敲低HIF-1α的表达后,结果显示,与NC siRNA+LPS+IFN-γ组相比,HIF-1α siRNA+LPS+IFN-γ组HIF-1α、IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达下降(P<0.05)。结论 miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α参与了BV-2小胶质细胞活化。

微RNA hsa-miR-125a-5p通过激活p53诱导肺癌SPC-A-1细胞凋亡的研究

为了探讨微RNA hsa-miR-125a-5p对肺癌细胞凋亡的影响及其可能的调控机制,通过实时定量RT-PCR (qRT-PCR法)检测hsa-miR-125a-5p在不同细胞系表达的相对含量,流式细胞术检测肺癌细胞的凋亡情况,Western blot和RT-PCR检测p53蛋白和mRNA表达情况,进一步的功能性实验选择SPC-A-1细胞进行。结果显示,与人支气管上皮HBE细胞相比较,hsa-miR-125a-5p在不同的肺癌细胞系中表达下降。在功能获得性实验中,hsa-miR-125a-5p促进凋亡,hsa-miR-125a-5p过表达能够增加野生型p53 mRNA和蛋白表达;阻断野生型p53能够减弱hsa-miR-125a-5p在凋亡中的作用。在功能丧失性实验中,阻断hsa-miR-125a-5p能够降低野生型p53的mRNA和蛋白表达,阻断野生型p53同样能够减弱hsa-miR-125a-5p抑制剂在凋亡中的作用。最后,在p53缺陷细胞系H1299中转染正义或反义miR-125a-5p混合物,结果显示凋亡率均没有明显变化。上述研究表明,微RNA hsa-miR-125a-5p在肺癌细胞SPC-A-1中通过激活p53诱导凋亡。这些结果将为miR-125a家族在肺癌中的作用提供新的视点。

miR-125a-5p与肺结核关系的研究进展

肺结核(pulmonary tuberculosis, PTB)指的是由结核分枝杆菌引发的肺部感染性疾病,是严重威胁人类健康的疾病。结核分枝杆菌感染后绝大多数感染者处于结核分枝杆菌潜伏感染(Latent tuberculo-sis infection, LTBI)状态,5%~10%的LTBI者一生中会发展为活动性结核病。miR-125a-5p是一种微小RNA分子亚型,研究显示miR-125a-5p对肺结核的发生发展及转归具有重要作用。本文介绍了miR-125a-5p调控巨噬细胞极化及炎症反应,总结了miR-125a-5p与肺结核的关联性,认为miR-125a-5p对肺结核患者的诊治有一定指导意义。

幽门螺杆菌感染诱导的miR-125a-5p靶向EVA1A影响胃癌增殖和侵袭的机制研究

目的:探讨幽门螺杆菌感染调控的miRNAs及其在胃癌生中的作用机制。方法:qRT-PCR检测HP感染阳性患者组织中miR-125a-5p和EVA1A的表达;HP感染胃癌细胞,细胞功能实验探究miR-125a-5p/EVA1A轴在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的生物学功能。双荧光素酶实验验证miR-125a-5p与EVA1A的结合关系。结果:miR-125a-5p在HP感染阳性患者组织和Hp感染的胃癌细胞中下调。细胞功能实验表明过表达miR-125a-5p可以抑制胃癌细胞增殖和侵袭。miR-125a-5p靶向下调EVA1A的表达,过表达EVA1A可以逆转过表达miR-125a-5p对胃癌表型的影响。结论:幽门螺杆菌感染诱导的miR-125a-5p靶向EVA1A抑制胃癌增殖和侵袭,miR-125a-5p和EVA1A可能是胃癌治疗的潜在靶点。