黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

CircLRP6调节miR-125a-5p/MCL1轴对食管鳞癌顺铂耐药性的影响

目的探讨环状RNA脂蛋白受体6(circLRP6)对食管鳞癌(ESCC)顺铂(CDDP)耐药性的影响及潜在分子机制。方法建立KYSE30的CDDP抗性细胞株(KYSE30/CDDP-R),分为对照(Control)组、si-NC组、si-circLRP6组、si-circLRP6+anti-NC组、si-circLRP6+anti-miR-125a-5p组。采用RT-qPCR和Western blot检测组织/细胞中circLRP6、miR-125a-5p和髓样细胞白血病-1(MCL-1)的表达水平;CCK-8法检测KYSE30/CDDP-R细胞的CDDP敏感性;流式细胞术检测细胞凋亡。结果ESCC癌组织/细胞和CDDP耐药癌组织中circLRP6、MCL-1 mRNA水平升高,miR-125a-5p水平降低(P<0.001);circLRP6沉默可上调miR-125a-5p,抑制MCL-1表达,增强体内外CDDP抗性ESCC细胞对CDDP的敏感性,促进CDDP抗性ESCC细胞凋亡;抑制miR-125a-5p可减弱circLRP6沉默对CDDP抗性ESCC细胞中CDDP耐药性和细胞凋亡的影响。circLRP6可靶向负调控miR-125a-5p表达,MCL-1是miR-125a-5p的靶标。结论circLRP6沉默可能通过miR-125a-5p/MCL-1轴增强CDDP抗性ESCC细胞对CDDP的敏感性。

circDCUN1D4调节miR-18a-5p/FBP1轴对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的探讨环状RNA(circRNA)DCUN1D4调节微小RNA(miR)-18a-5p/果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)轴对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响。方法选取人肺癌细胞系(H1975、H1650、A549、SPCA-1)和人正常肺表皮细胞(HPL-1),qRT-PCR检测各种细胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表达水平。取对数生长期的A549细胞并分为空白组、circDCUN1D4过表达质粒(circDCUN1D4)组、过表达质粒阴性对照(NC)组、circDCUN1D4+miR-18a-5p模拟物阴性对照(circDCUN1D4+mimics NC)组、circDCUN1D4+miR-18a-5p模拟物(circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics)组。CCK-8法检测各组A549细胞活力,流式细胞术检测各组A549细胞凋亡水平,qRT-PCR检测各组A549细胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表达水平,Western blot检测各组A549细胞中FBP1、caspase-3、Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)及程序性死亡分子配体-1(PD-L1)表达水平,双荧光素酶实验验证miR-18a-5p分别与circDCUN1D4、FBP1的靶向关系。结果与HPL-1细胞相比,人肺癌细胞系中circDCUN1D4、FBP1 mRNA表达显著下降(P<0.05),miR-18a-5p表达显著增加(P<0.05)。miR-18a-5p分别与circDCUN1D4、FBP1存在靶向关系。与空白组、NC组相比,circDCUN1D4组细胞24 h和48 h的OD值、Ki67、PCNA、miR-18a-5p、PD-L1表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、circDCUN1D4、FBP1、caspase-3表达显著增加(P<0.05);过表达miR-18a-5p逆转了circDCUN1D4对肺癌细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05)。结论circDCUN1D4过表达可以促进肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞增殖及免疫逃逸,其作用机制可能与调控miR-18a-5p/FBP1轴有关。

CircSLC6A6调节miR-125a-5p/PUM2轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的:探讨环状溶质载体家族6成员6(CircSLC6A6)调节微小RNA分子miR-125a-5p/pumilio同源物2(PUM2)轴对子宫内膜癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响。方法:以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测体外培养的人子宫内膜上皮细胞与人子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、KLE、Ishikawa中CircSLC6A6、miR-125a-5p与PUM2的表达。将体外培养的人子宫内膜癌细胞HEC-1-A随机分为5组:对照组、CircSLC6A6敲低组(转染CircSLC6A6 siRNA质粒)、miR-125a-5p抑制组(转染miR-125a-5p抑制剂)、阴性对照组(转染空载质粒和miR-125a-5p抑制阴性对照)、共转染(转染CircSLC6A6 siRNA质粒+miR-125a-5p抑制剂)组。以CCK-8法及细胞克隆实验、Hoechst 33258染色及流式细胞实验、以划痕实验及Transwell实验检测各组HEC-1-A细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭情况;以qRT-PCR实验检测各组HEC-1-A细胞miRv125a-5p及PUM2 mRNA表达;以免疫印迹实验检测各组HEC-1-A细胞凋亡蛋白(caspase-9、Bax)、上皮间质转化标志蛋白(Vimentin、E-cadherin)表达;以双荧光素酶报告基因实验检测HEC-1-A细胞中CircSLC6A6对miR-125a-5p和miR-125a-5p对PUM2的靶向调控作用。结果:(1)与人子宫内膜上皮细胞相比,人子宫内膜癌细胞株HEC-1-A、Ishikawa、KLE中CircSLC6A6 mRNA、PUM2 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-125a-5p mRNA表达显著降低(P<0.05)。(2)与对照组相比,CircSLC6A6敲低组细胞呈现典型凋亡形态改变,细胞活力、相对细胞集落数、细胞迁移距离、侵袭细胞数、细胞PUM2 mRNA及Vimentin蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、细胞miR-125a-5p及caspase-9、Bax、E-cadherin蛋白表达均升高(P<0.05);miR-125a-5p抑制组细胞各指标变化趋势与CircSLC6A6敲低组相反;阴性对照组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与CircSLC6A6敲低组相比,共转染组细胞的细胞核凋亡形态改变得到改善,各指标变化趋势与其相反,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)在HEC-1-A细胞中CircSLC6A6可靶向下调miR-125a-5p的表达,而miR-125a-5p可靶向下调PUM2的表达。结论:CircSLC6A6通过靶向下调miR-125a-5p而上调PUM2,可能促使子宫内膜癌进展,敲低CircSLC6A6通过促进miR-125a-5p分泌而降低PUM2表达,可能抑制子宫内膜癌细胞增殖、集落形成和上皮间质转化,并促进其凋亡。

LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子轴参与心力衰竭发生发展的机制研究

目的 探讨LncRNA-MALAT1/miR-125b-5p/PDCD4分子轴参与心力衰竭发生发展的机制。方法 购置SD大鼠40只,随机取大鼠10只为对照组,剩余大鼠30只采用结扎大鼠左冠状动脉前降支造成心肌梗死后形成心肌梗死模型,于第14日取材组织并完成HE染色;观察组随机分为模型组、空载组和MALAT1沉默组,利用慢病毒转染干扰LncRNA-MALAT1序列(LV-shMALAT1)及其空载(LV-Control)观察治疗大鼠的干预效果。采用实时荧光PCR法和Western Blot检测LncRNA MALAT1、miR-125b-5p和PDCD4表达水平;采用酶联免疫吸附试验测定炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)。结果 观察组EF及左室短轴缩短率低于对照组(P<0.05);MALAT1沉默组EF及左室短轴缩短率高于模型组及空载组(P<0.05);HE染色结果显示,模型组和空载组心肌纤维断裂,细胞核紊乱、肥大、间隙增宽、染色加深;MALAT1沉默组心肌纤维断裂有所改善,细胞排列相对整齐;MALAT1沉默组LncRNA MALAT1 mRNA、miR-125b-5p及蛋白表达低于模型组与空载组(P<0.05);PDCD4mRNA及蛋白表达高于模型组与空载组(P<0.05);模型组与空载组炎性因子TNF-α和IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05);MALAT1沉默组炎性因子TNF-α和IL-1β水平低于模型组与空载组(P<0.05)。结论 心力衰竭大鼠中LncRNA-MALAT1表达显著下调,能竞争性结合miR-125b-5p,使其解除对PDCD4的抑制,促进PDCD4表达,从而抑制炎性反应。

circSHKBP1通过靶向miR-125a-5p调控结肠癌细胞增殖和凋亡

背景 结肠癌是临床上常见的一种恶性肿瘤,有研究报道,环状RNA(circular RNA,circR NA)参与结肠癌的发生发展.其中,circSHKBP1作为癌基因促进癌症进展,因此我们假设circSHKBP1也参与结肠癌的发展.目的 探讨circSHKBP1对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及其可能作用机制.方法 选取本院2020-03/2020-07的69例结肠癌组织及癌旁组织标本,qRT-PCR检测circSHKBP1、miR-125a-5p的表达量;体外培养人结肠癌细胞HT29,随机分组:sh-NC组、sh-circSHKBP1组、miR-NC组、miR-125a-5p组、sh-circSHKBP1+anti-miR-NC组、shcircSHKBP1+anti-miR-125a-5p组;采用MTT法、平板克隆形成、和流式细胞术检测细胞增殖、克隆形成及凋亡;采用双荧光素酶报告验证miR-125a-5p过表达对野生型(wild-type,WT)载体wt-circSHKBP1的荧光素酶活性;采用Western blot检测b细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(BCL-2-associated X protein,Bax)蛋白表达.结果 在结肠癌组织中circSHKBP1的表达上调(P<0.05),miR-125a-5p的表达下降(P <0.05);相对sh-NC组,沉默circSHKBP1显著降低结肠癌细胞的增殖率、提高凋亡率和Bax的表达,降低了细胞克隆形成数,减少Bcl-2的表达(P<0.05);miR-125a-5p过表达可降低wt-circSHKBP1的荧光素酶活性(P <0.05);与miR-NC组对照,miR-125a-5p组降低增殖率、提高凋亡率和Bax的表达,减少细胞克隆形成数,降低Bcl-2的表达(P<0.05);相对sh-circSHKBP1+anti-miR-NC组,shcircSHKBP1+anti-miR-125a-5p组提高了肿瘤细胞增殖率、降低了凋亡率和Bax的表达,增加了细胞克隆形成数,提高了Bcl-2的表达(P<0.05).结论 敲低circSHKBP1可通过靶向miR-125a-5p表达抑制结肠癌细胞增殖并促进细胞凋亡.

MiR-125a-5p靶向胰岛素样生长因子1受体调节川崎病中内皮细胞的增殖和迁移

目的:探讨miR-125a-5p靶向胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)对川崎病内皮细胞增殖与迁移的影响。方法:培养人冠状动脉内皮细胞(human coronary artery endothelial cells,HCAECs),将细胞分为对照组(20%正常人血清)、20%川崎病血清组(20%川崎病患儿血清)、20%川崎病血清+抵制剂(inhibitor)正常对照(normal control,NC)组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+siRNA组、20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+si IGF1R组,除对照组添加20%正常人血清外,其余各组均添加20%川崎病患儿血清培养。定量RT-PCR法测定miR-125a-5p、IGF1R mRNA表达水平,蛋白质印迹法测定IGF1R蛋白表达;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法测定HCAECs细胞增殖能力;Transwell法测定细胞迁移能力;蛋白质印迹法测定Ki-67、血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin,VE-cad)、p120连环蛋白(p120-catenin,p120ctn)水平;构建野生型IGF1R重组质粒(pGL4-IGF1R-WT)和突变型IGF1R重组质粒(pGL4-IGF1R-MUT),将HCAECs细胞分为mimic-NC+pGL4-IGF1R-WT组、miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-WT组、mimic-NC+pGL4-IGF1R-MUT组、miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-MUT组,双荧光素酶报告实验测定miR-125a-5p与IGF1R mRNA的水平。结果:与对照组相比,20%川崎病血清组HCAECs细胞5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)结合率、miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均升高(均P<0.05),IGF1R mRNA与蛋白水平、HCAECs细胞光密度(optical density,OD)值、Ki-67均降低(均P<0.05);与20%川崎病血清组相比,20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组HCAECs细胞EdU结合率、miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均降低,IGF1R mRNA水平与蛋白水平、HCAECs细胞OD值、Ki-67均升高(均P<0.05);与20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor组相比,20%川崎病血清+miR-125a-5p inhibitor+si IGF1R组HCAECs细胞EdU结合率miR-125a-5p水平、VE-cad、p120ctn表达均升高(均P<0.05),IGF1R mRNA与蛋白水平、HCAECs细胞OD值、Ki-67均降低(均P<0.05);与mimic-NC+pGL4-IGF1R-WT组对比,miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05);与mimic-NC+pGL4-IGF1R-MUT组相比,miR-125a-5p mimic+pGL4-IGF1R-MUT组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:川崎病内皮细胞损伤模型中miR-125-5p呈高表达,IGF1R呈低表达,miR-125-5p下调可靶向上调IGF1R表达,促进细胞增殖、迁移。

miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α参与小胶质细胞活化

目的 观察miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α在BV-2小胶质细胞炎症模型中对小胶质细胞的活化作用。方法 首先用LPS 150μg/L+IFN-γ 20μg/L建立BV-2小胶质细胞炎症模型;将BV-2小胶质细胞分为对照组(Con组)、小胶质细胞炎症模型组(LPS+IFN-γ组),用实时荧光定量PCR检测miR-125a-5p、HIF1AN mRNA表达水平,用Western blotting检测iNOS和HIF-1α蛋白的表达。再通过调控miR-125a-5p、HIF-1α的表达,用荧光定量PCR法检测miR-125a-5p,HIF-1α、促炎因子(包括IL-1β、TNF-α)、M1极化标志物iNOS mRNA表达水平,用Western blotting法检测HIF1AN、HIF-1α的蛋白表达量。结果 与Con组相比,LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,iNOS、IL-1β和TNF-α mRNA表达升高(P<0.05),HIF1AN mRNA表达下降(P<0.05),HIF-1α、iNOS蛋白表达升高(P<0.05)。上调miR-125a-5p后,与NC agomir+LPS+IFN-γ组相比,miR agomir+LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达升高(P<0.05),HIF1AN蛋白表达下降(P<0.05),HIF-1α蛋白表达升高(P<0.05);下调miR-125a-5p表达后,与NC antagomir+LPS+IFN-γ组相比,miR antagomir+LPS+IFN-γ组miR-125a-5p,IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达下降(P<0.05),HIF1AN蛋白表达上升(P<0.05),HIF-1α蛋白表达下降(P<0.05);敲低HIF-1α的表达后,结果显示,与NC siRNA+LPS+IFN-γ组相比,HIF-1α siRNA+LPS+IFN-γ组HIF-1α、IL-1β、TNF-α和iNOS mRNA表达下降(P<0.05)。结论 miR-125a-5p通过靶向HIF1AN调控HIF-1α参与了BV-2小胶质细胞活化。

幽门螺杆菌感染诱导的miR-125a-5p靶向EVA1A影响胃癌增殖和侵袭的机制研究

目的:探讨幽门螺杆菌感染调控的miRNAs及其在胃癌生中的作用机制。方法:qRT-PCR检测HP感染阳性患者组织中miR-125a-5p和EVA1A的表达;HP感染胃癌细胞,细胞功能实验探究miR-125a-5p/EVA1A轴在胃癌细胞增殖、迁移和侵袭中的生物学功能。双荧光素酶实验验证miR-125a-5p与EVA1A的结合关系。结果:miR-125a-5p在HP感染阳性患者组织和Hp感染的胃癌细胞中下调。细胞功能实验表明过表达miR-125a-5p可以抑制胃癌细胞增殖和侵袭。miR-125a-5p靶向下调EVA1A的表达,过表达EVA1A可以逆转过表达miR-125a-5p对胃癌表型的影响。结论:幽门螺杆菌感染诱导的miR-125a-5p靶向EVA1A抑制胃癌增殖和侵袭,miR-125a-5p和EVA1A可能是胃癌治疗的潜在靶点。

miR-125a-5p通过靶向APAF1增强非小细胞肺癌细胞吉非替尼耐药性

目的:探讨miR-125a-5p在诱导非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞吉非替尼(gefitinib,Gef)耐药中的作用及其机制。方法:选用人NSCLC耐药细胞株A549/GR和NSCLC细胞株A549,将miR-125a-5p mimic、miR-125a-5p inhibitor、pcDNA3.1-APAF1、空载体pcDNA3.1转染至A549/GR细胞。用qPCR检测细胞中miR-125a-5p的表达水平,用MTT法、Transwell小室法和流式细胞术检测Gef对细胞增殖、迁移和凋亡的影响。用双荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p与细胞凋亡蛋白酶活化因子1(apoptotic peptidase activating factor 1,APAF1)的靶向关系,用Western blotting检测A549/GR细胞中APAF1蛋白水平,用比色法测定细胞中caspase-3及caspase-9表达水平。结果:A549/GR细胞中miR-125a-5p表达水平显著高于A549细胞(P<0.01)。敲降miR-125a-5p显著增强Gef对A549/GR细胞增殖、迁移的抑制作用(均P<0.05),并促进细胞凋亡(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实miR-125a-5p靶向APAF1,并负调控其表达。进一步实验显示,miR-125a-5p通过靶向下调APAF1缓解Gef对A549/G细胞增殖、迁移的抑制作用及凋亡的促进作用(均P<0.05),减弱Gef引起的凋亡相关蛋白caspase-3及caspase-9表达的上调(均P<0.05)。结论:miR-125a-5p促进NSCLC细胞Gef耐药,其机制是通过靶向APAF1而促进细胞的增殖、迁移并抑制凋亡。

丙戊酸钠通过激活miR-148a-3p/Mcl-1通路促进SH-SY5Y细胞凋亡

目的探讨抗癫痫药丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对神经细胞的凋亡诱导作用及相关机制。方法将人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)用不同剂量VPA处理,流式分析细胞凋亡水平变化,Western blot检测Mcl-1蛋白水平变化,定量PCR分析Mcl-1 mRNA与miR-148a-3p水平变化,报告基因实验检测Mcl-1启动子活性变化。用miR-148a-3p抑制剂联合VPA处理细胞,观察miR-184a-3p在VPA下调Mcl-1表达中的作用及对VPA促SH-SY5Y细胞凋亡效果的影响。结果VPA可促进SH-SY5Y细胞凋亡,并抑制SH-SY5Y细胞中Mcl-1的蛋白和mRNA水平(P<0.05)。VPA处理不影响SH-SY5Y细胞中Mcl-1的启动子活性(P>0.05)。VPA可显著增强SH-SY5Y细胞中miR-148a-3p的表达(P<0.05),使用miR-148a-3p抑制剂可减轻VPA对Mcl-1表达的抑制作用,并减弱VPA的促细胞凋亡效果。结论VPA可能通过激活miR-148a-3p/Mcl-1信号通路促进SH-SY5Y细胞凋亡。

微RNA hsa-miR-125a-5p通过激活p53诱导肺癌SPC-A-1细胞凋亡的研究

为了探讨微RNA hsa-miR-125a-5p对肺癌细胞凋亡的影响及其可能的调控机制,通过实时定量RT-PCR (qRT-PCR法)检测hsa-miR-125a-5p在不同细胞系表达的相对含量,流式细胞术检测肺癌细胞的凋亡情况,Western blot和RT-PCR检测p53蛋白和mRNA表达情况,进一步的功能性实验选择SPC-A-1细胞进行。结果显示,与人支气管上皮HBE细胞相比较,hsa-miR-125a-5p在不同的肺癌细胞系中表达下降。在功能获得性实验中,hsa-miR-125a-5p促进凋亡,hsa-miR-125a-5p过表达能够增加野生型p53 mRNA和蛋白表达;阻断野生型p53能够减弱hsa-miR-125a-5p在凋亡中的作用。在功能丧失性实验中,阻断hsa-miR-125a-5p能够降低野生型p53的mRNA和蛋白表达,阻断野生型p53同样能够减弱hsa-miR-125a-5p抑制剂在凋亡中的作用。最后,在p53缺陷细胞系H1299中转染正义或反义miR-125a-5p混合物,结果显示凋亡率均没有明显变化。上述研究表明,微RNA hsa-miR-125a-5p在肺癌细胞SPC-A-1中通过激活p53诱导凋亡。这些结果将为miR-125a家族在肺癌中的作用提供新的视点。

红参调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路对人血管平滑肌细胞生物学过程的影响

目的探讨红参是否通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路从而抑制人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭。方法体外培养人血管平滑肌细胞,同型半胱氨酸(Hcy)处理细胞建立模型,使用不同剂量的红参处理细胞;四唑盐(MTT)进行血管平滑肌细胞增殖检测;Transwell小室实验进行迁移及侵袭检测;实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测DARS-AS1、miR-125a-5p的表达量;Hcy诱导的细胞中分别转染si-DARS-AS1、pcDNA-DARS-AS1,检测细胞增殖、迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验检测DARS-AS1、miR-125a-5p的靶向关系。结果Hcy可增高血管平滑肌细胞增殖率、迁移细胞数、侵袭细胞数,促进DARS-AS1表达,抑制miR-125a-5p表达(P<0.05);红参可降低细胞增殖率,减少迁移细胞数、侵袭细胞数,抑制DARS-AS1表达,促进miR-125a-5p表达(P<0.05),且呈剂量依赖性;干扰DARS-AS1表达可抑制Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭;双荧光素酶报告实验证实DARS-AS1可靶向结合miR-125a-5p;DARS-AS1过表达以减弱红参对Hcy诱导的人血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。结论红参可能通过调控DARS-AS1/miR-125a-5p通路从而抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移及侵袭。

MiR-125a-5p抑制3T3-L1前体脂肪细胞分化

MicroRNAs(miRNAs)是一类在脂肪组织发育中发挥重要作用的小非编码RNA.为探明miR-125a-5p在3T3-L1前体脂肪细胞中的作用,采用实时qPCR检测了miR-125a-5p在小鼠各组织及3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中的表达;使用经化学修饰的miR-125a-5p模拟物agomir及抑制剂antagomir转染3T3-L1前体脂肪细胞,采用实时qPCR和Western印迹检测成脂标志基因Pparγ和aP2的表达,油红O染色观察脂肪细胞脂质积累.结果显示,miR-125-5p在小鼠脂肪组织中高丰度表达,在3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中表达下降.过表达miR-125a-5p,与对照组相比,成脂标志基因Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均明显下降;油红O染色及定量结果显示脂质积累减少.抑制剂处理结果显示,Pparγ和aP2在mRNA和蛋白质水平均有不同程度上升,但油红O染色及定量结果差异不显著.以上结果表明,miR-125a-5p在脂肪细胞分化中发挥负调控作用.

缺氧损伤后血红素加氧酶1截短体(HO-1C△23)上调miR-125a-5p降低血脊髓屏障的通透性

目的检测微小RNA 125a-5p (miR-125a-5p)在血红素加氧酶1截短体(HO-1C△23)调节缺氧损伤时血脊髓屏障(BSCB)中的作用。方法用HCMEC/D3细胞与星形胶质细胞在TranswellTM小室构建体外BSCB模型,并用氯化钴制备BSCB缺氧模型。实验分为空白组、空载病毒组、HO-1C△23组(Lv-HO-1C△23)、miRNA阴性对照组(Lv-HO-1C△23联合miR-NC处理)、miRNA模拟物组(Lv-HO-1C△23联合miR-125a-5p mimics处理)和miRNA抑制物组(Lv-HO-1C△23联合miR-125a-5p inhibitor)。用反转录PCR和实时定量PCR检测各组miR-125a-5p和紧密连接蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)和血管内皮钙黏附蛋白(VE-cadherin)的mRNA水平,Western blot法检测各组HO-1、ZO-1和occludin、VE-cadherin的蛋白水平;用辣根过氧化物酶(HRP)的溢出率评价体外BSCB的通透性。结果 HO-1C△23转染HCMEC/D3细胞的成功率约为70%,转染成功后HO-1C△23含量明显升高,且miR-125a-5p表达较空白组也明显上调。与空白组相比较,HO-1C△23组、miRNA阴性对照组和模拟物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平增加,HRP溢出率降低,而miRNA抑制物组中ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平降低,HRP溢出率升高;与HO-1C△23组相比,miRNA模拟物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平明显升高,HRP溢出率降低,而miRNA抑制物组ZO-1、occludin、VE-cadherin的mRNA和蛋白水平降低,HRP溢出率升高。结论在缺氧损伤条件下,HO-1C△23通过上调miR-125a-5p表达,促进连接与黏附相关基因的转录与翻译,降低BSCB的通透性。

miR-125b-5p对人血管瘤内皮细胞HemES增殖和凋亡的影响及其机制

目的:研究miR-125b-5p对人血管瘤内皮细胞HemECs增殖、凋亡的影响。方法:RT-qPCR检测人血管瘤内皮细胞HemECs及其旁系组织细胞中miR-125b-5p与MCL-1 mRNA的表达;选取HemECs细胞分为对照组、miR-NC组、miR-125b-5p mimic组、miR-125b-5p inhibitor组、pc-MCL-1组、miR-125b-5p+pc-MCL-1组,每组设9复孔。将100 nmol•L-1的miR-NC、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p inhibitor、pc-MCL-1质粒分别或联合转染进入HemECs细胞。MTT法检测HemECs细胞增殖;流式细胞术检测HemECs细胞凋亡;双荧光素酶报告检测靶向关系;蛋白印迹法检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-p70s6k/p70s6k、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达水平。结果:通过比较miR-125b-5p在血管瘤组织和细胞中的表达水平,选择下调效果比较明显的HemECs细胞系进行后续实验。与对照组相比,miR-125b-5p mimic组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显减少(P<0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显升高、Bcl-2表达明显降低(P<0.01),p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显下调(P<0.01);miR-125b-5p inhibitor组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P<0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达升高(P<0.05,P<0.01)。miR-125b-5p靶向下调MCL-1。与miR-125b-5p mimic组相比,miR-125b-5p+pc-MCL-1组HemECs细胞增殖及Ki67和PCNA表达明显增加(P<0.01),细胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax表达明显降低、Bcl-2表达明显升高(P<0.01),p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K表达明显上调(P<0.01)。结论:miR-125b-5p抑制人血管瘤内皮细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与靶向下调MCL-1表达,抑制AKT/mTOR通路激活等有关。

circAGFG1对非小细胞肺癌生物学行为的影响机制研究

目的 探讨环状RNA(circRNA)AGFG1通过靶向微小RNA(miR)-374a-5p/血管内皮生长因子C(VEGFC)轴对非小细胞肺癌(NSCLC)生物学行为的影响机制。方法 qRT-PCR检测55例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织以及人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)、人NSCLC细胞系(HCC827、H1975、A549、H1299)中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平。以A549细胞为研究对象,设置对照组、circAGFG1小干扰RNA(si circAGFG1)组及阴性对照(si NC)组、si circAGFG1+miR-374a-5p抑制物(miR-374a-5p inhibitor)组以及si circAGFG1+抑制物对照组(inhibitor NC)组。qRT-PCR检测各组A549细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平;CCK-8及Transwell实验分别检测细胞活力及迁移、侵袭能力;Western blot检测增殖蛋白Ki-67、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)以及VEGFC蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验验证circAGFG1、VEGFC分别与miR-374a-5p的靶向关系。结果 癌组织及人NSCLC细胞系中circAGFG1、VEGFC mRNA表达水平显著增加,miR-374a-5p表达显著降低(P<0.05)。与对照组、si NC组比较,si circAGFG1组培养24 h、48 h的OD450值,迁移数,侵袭数及Ki-67、MMP-9、circAGFG1、VEGFC表达水平显著下降/减少(P<0.05),miR-374a-5p表达显著增加(P<0.05);与si circAGFG1+inhibitor NC组比较,circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组培养24 h、48 h的OD450值,迁移数,侵袭数及Ki-67、MMP-9、VEGFC表达水平显著增加(P<0.05),miR-374a-5p表达显著降低(P<0.05),但circAGFG1无显著变化(P>0.05)。circAGFG1、VEGFC分别与miR-374a-5p存在靶向关系。结论 干扰circAGFG1表达可通过调控miR-374a-5p/VEGFC轴抑制A549细胞的恶性生物学行为发展。

LINC00943靶向调控miR-125a-5p对幽门螺杆菌诱导的人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的影响

目的探讨LINC00943对幽门螺杆菌(Hp)诱导的人胃黏膜上皮细胞GES-1损伤的影响及其分子机制。方法将GES-1细胞分为Control组、Hp组、Hp+si-NC组、Hp+si-LINC00943组、Hp+miR-NC组、Hp+miR-125a-5p组、Hp+si-LINC00943+anti-miR-NC组和Hp+si-LINC00943+anti-miR-125a-5p组,实时荧光定量PCR检测LINC00943和miR-125a-5p表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;免疫蛋白印迹检测凋亡蛋白表达;酶联免疫吸附法检测白细胞介素-8(IL-8)和IL-1β、乳酸脱氢酶(LDH)水平;双荧光素酶报告基因实验检测LINC00943和miR-125a-5p靶向关系。结果与Control组比较,Hp组LINC00943表达、凋亡率、Bax蛋白、IL-8、IL-1β、LDH升高,miR-125a-5p表达、Bcl-2蛋白降低(P<0.05);敲减LINC00943或过表达miR-125a-5p可减轻Hp诱导的GES-1细胞损伤;LINC00943靶向调控miR-125a-5p表达,下调miR-125a-5p逆转了敲减LINC00943对Hp诱导的GES-1细胞损伤的影响(P<0.05)。结论敲减LINC00943通过靶向上调miR-125a-5p可缓解Hp诱导的GES-1细胞损伤。

miR-125a-5p靶向Scarb1基因对缺氧/复氧心肌细胞损伤的影响及其机制研究

目的探讨miR-125a-5p靶向调控清道夫受体B1(Scarb1)基因对缺氧/复氧大鼠心肌细胞损伤的影响及作用机制。方法将体外培养的H9c2大鼠心肌细胞随机分为空白对照组、缺氧/复氧组、转染对照组和miR-125a-5p转染组。检测各组miR-125a-5p的表达量、心肌细胞的活力、凋亡率、ATP含量以及Scarb1、Cyt C、Bax、Bcl-2及NF-κB信号通路相关蛋白的表达情况。利用Targetscan软件预测miR-125a-5p的靶基因,用双荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p和Scarb1的靶向关系。结果与空白对照组相比,缺氧/复氧组心肌细胞miR-125a-5p、Bax、Cyt C的表达和凋亡率明显升高(P<0.05),细胞活力、Scarb1、Bcl-2的表达及ATP含量明显降低(P<0.05)。与转染对照组相比,miR-125a-5p转染组的情况与上述变化相反。双荧光素酶报告基因实验证实Scarb1为miR-125a-5p的靶基因。缺氧/复氧能够促进心肌细胞中NF-κB p65、c-Myc和Cyclin D1蛋白的表达,而下调miR-125a-5p的表达则能够抑制上述蛋白的表达。结论缺氧/复氧能够诱导心肌细胞中miR-125a-5p的表达,抑制miR-125a-5p则能够通过上调Scarb1的表达对缺氧/复氧心肌细胞起保护作用,其机制可能与抑制NF-κB信号通路的活化有关。

LncRNA MALAT-1调控miR-125a-5p及其靶基因Rab25参与非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药机制研究

目的在前期已经验证miR-125a-5p通过调控Rab25参与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal-growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)耐药的基础上,本研究进一步检测出临床具有EGFR突变的NSCLC EGFR-TKIs耐药的患者中lncRNA MALAT-1的相对表达量高于具有EGFR突变的NSCLC未治疗的患者,同时通过生物信息学软件预测出MALAT-1与miR-125a-5p有结合位点,遂预测MALAT-1可能通过调控miR-125a-5p及其靶蛋白Rab25参与NSCLC EGFR-TKIs的耐药。方法采用SAM双载体慢病毒转染技术过表达肺腺癌细胞(PC9细胞)中的MALAT-1基因,Crispr/Cas9慢病毒转染技术敲除肺腺癌厄洛替尼耐药细胞(PC9ER细胞)中的MALAT-1基因;qRT-PCR实验检测未治疗患者血清标本中MALAT-1的表达量和亲本及耐药细胞组中MALAT-1和miR-125a-5p的变化;CCK-8实验验证MALAT-1对两组细胞耐药指数的影响;细胞凋亡和周期实验检测MALAT-1对细胞凋亡率和细胞周期分布的影响:免疫荧光定性检测MALAT-1对靶基因Rab25的影响。结果MALAT-1的相对表达量临床耐药患者组(3.280±0.369)高于未治疗患者组(1.000±0.000),差异有统计学意义,t=6.185,P=0.004;SAM双载体及Crispr/Cas9慢病毒转染技术成功在PC9细胞中过表达MALAT-1及PC9ER细胞中敲除MALAT-1;与PC9细胞(1.000±0.000)相比,PC9ER细胞中MALAT-1的相对表达量升高(6.113±0.546,t=10.010,P<0.001),PC9ER细胞中miR-125a-5p的相对表达量降低(0.233±0.044,t=16.470,P<0.001),PC9+MALAT-1细胞中miR-125a-5p的相对表达量降低(0.303±0.012,t=14.900,P<0.001);在厄洛替尼作用48h后,PC9ER和PC9+MALAT-1细胞的IC50高于PC9细胞(tPC9ER=7.566,PPC9ER<0.001;tPC9+MALAT-1=9.766,PPC9+MALAT-1<0.001),PC9-shMALAT-1细胞IC50低于PC9细胞,差异有统计学意义,t=6.025,P=0.002。PC9+MALAT-1细胞凋亡率(1.333±0.088)低于PC9细胞(7.100±0.379),t=14.270,P<0.001;PC9ER-shMALAT-1细胞(14.970±0.410)凋亡率高于PC9ER细胞(1.267±0.088),t=33.900,P<0.001;PC9+MALAT-1细胞G0/G1期细胞比例低于PC9细胞(t=11.370,P<0.001),S期细胞比例高于PC9细胞,t=9.365,P<0.001,PC9ER-shMALAT-1细胞G0/G1期比例高于PC9ER细胞(t=14.060,P<0.001),S期细胞比例低于PC9ER细胞(t=8.365,P<0.001);PC9+MALAT-1细胞(184.900±6.712)中Rab25的表达量高于PC9细胞(25.990±1.820),t=29.880,P<0.001;而PC9ER-shMALAT-1细胞(27.060±1.400)中Rab25的表达量低于PC9ER细胞(193.200±2.500),t=31.250,P<0.001。结论MALAT-1的过表达导致PC9细胞的增殖能力及其对厄洛替尼的耐药能力增加,细胞凋亡率降低,而MALAT-1的敲除,能使PC9ER细胞的增殖能力及细胞对厄洛替尼的耐药能力降低,细胞凋亡率增加;初步验证了lncRNA MALAT-1通过调控miR-125a-5p及其靶基因Rab25参与NSCLC EGFR-TKIs的耐药。