哌拉西林通过调控miR-127-5p影响重症肺炎大鼠炎症因子的分子机制

目的探讨哌拉西林对重症肺炎大鼠炎症因子的影响及分子机制。方法用肺炎克雷伯菌构建重症肺炎大鼠模型,将大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组(50 mg/kg哌拉西林)、中剂量组(100 mg/kg哌拉西林)、高剂量组(200 mg/kg哌拉西林)、anti-miR-con+模型组、anti-miR-127-5p+模型组、anti-miR-con+高剂量组、anti-miR-127-5p+高剂量组。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测炎症因子白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β水平;髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒检测MPO活性;Western印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、p-p65蛋白表达;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-127-5p表达水平。结果重症肺炎大鼠模型中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高,MPO活性升高,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平升高,miR-127-5p相对表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同剂量哌拉西林处理后,重症肺炎大鼠中IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低,MPO活性降低,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平降低,miR-127-5p相对表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。转染miR-127-5p抑制载体质粒后,重症肺炎大鼠中IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高,MPO活性升高,MMP2、MMP9、p-p65蛋白的相对表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。抑制miR-127-5p表达逆转了哌拉西林对重症肺炎大鼠模型组炎症因子和MMP2、MMP9、p-p65的蛋白表达的影响。结论哌拉西林可降低重症肺炎大鼠炎症因子水平,其可能与上调miR-127-5p表达及抑制NF-κB信号通路有关。

杜仲调控miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡及炎症因子的影响

目的探讨杜仲对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡、炎症因子的影响及其对miR-127-5p的调控作用。方法采用白细胞介素(IL)-1β诱导骨关节炎软骨细胞(HC)-OA建立细胞损伤模型,常规培养的HC-OA细胞标记为Con组,加入不同浓度(0.01、0.10、1.00 mg/mL)杜仲处理细胞,设为IL-1β+杜仲低剂量组、IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组。anti-miR-NC、miR-127-5p inhibitor转染至HC-OA细胞后加入1 mg/ml杜仲处理细胞,设为杜仲高剂量+anti-miR-NC组、杜仲高剂量+miR-127-5p组,单独IL-1β处理的细胞设为IL-1β组,噻唑蓝(MTT)、流式细胞术分别检测细胞增殖、细胞周期及胞凋亡率;实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)法检测miR-127-5p的表达量;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测IL-6、IL-1β的水平。结果与IL-1β组相比,IL-1β+杜仲中剂量组、IL-1β+杜仲高剂量组细胞增殖抑制率、凋亡率及miR-127-5p表达增高,IL-6、IL-1β水平下降,细胞周期阻滞于G0-G1期,差异均有统计学意义(P<0.05);与杜仲高剂量+anti-miR-NC组比较,杜仲高剂量+miR-127-5p inhibitor组细胞增殖抑制率及凋亡率降低,G0-G1期细胞比例降低(P<0.05),S期细胞比例升高,IL-6、IL-1β的水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论杜仲通过上调miR-127-5p的表达而抑制骨关节炎软骨细胞增殖、炎症反应,并可诱导细胞周期阻滞于G0-G1期及促进细胞凋亡。

重症肺炎肺泡灌洗液miR-127-5p、miR-3686、sTREM-1的表达及与病情、预后的关系

目的:探讨重症肺炎(SP)肺泡灌洗液微小RNA-127-5p(miR-127-5p)、微小RNA-3686(miR-3686)、可溶性髓系细胞触发受体-1(sTREM-1)表达及与病情、预后关系。方法:选取2017年3月—2019年8月68例SP患者为观察组,同期68例肺炎患者为对照组。比较两组、观察组不同预后(28 d重症肺炎全因死亡、28 d生存)患者肺泡灌洗液miR-127-5p、miR-3686、sTREM-1表达,肺泡灌洗液各指标不同表达(高表达、低表达)SP患者急性生理和慢性健康评分Ⅱ(APACHEⅡ)、临床肺部感染(CPIS)评分,应用Pearson相关分析探讨肺泡灌洗液各指标表达与APACHEⅡ、CPIS评分的关系,绘制受试者工作特征(ROC)曲线及ROC下面积(AUC)探究肺泡灌洗液各指标单一、联合检测对SP重症肺炎全因死亡的预测价值,多元Logistic回归分析SP重症肺炎全因死亡的影响因素。结果:观察组肺泡灌洗液miR-127-5p水平(0.58±0.26)低于对照组(1.23±0.42)(t=10.851,P<0.001),miR-3686水平(1.98±0.46)高于对照组(0.96±0.31)(t=15.163,P<0.001),sTREM-1水平(195.37±48.62)ng/mL高于对照组(26.35±8.20)ng/mL(t=28.268,P<0.001)。肺泡灌洗液miR-127-5p高表达SP患者APACHEⅡ、CPIS评分均低于低表达患者,肺泡灌洗液miR-3686或sTREM-1高表达SP患者APACHEⅡ、CPIS评分均高于低表达患者(均P<0.05)。肺泡灌洗液miR-127-5p表达与APACHEⅡ、CPIS评分呈负相关(r=-0.735,P<0.001;r=-0.727,P<0.001),miR-3686表达与APACHEⅡ、CPIS评分呈正相关(r=0.569,P<0.001;r=0.679,P<0.001),sTREM-1表达与APACHEⅡ、CPIS评分呈正相关(r=0.694,P<0.001;r=0.667,P<0.001)。观察组28 d重症肺炎全因死亡患者肺泡灌洗液miR-127-5p表达低于生存患者,miR-3686、sTREM-1表达高于生存患者(均P<0.05)。预测SP重症肺炎全因死亡的AUC:miR-127-5p为0.757,miR-3686为0.782,sTREM-1为0.816,miR-127-5p+miR-3686+sTREM-1为0.862(均P<0.05)。肺泡灌洗液miR-127-5p为SP 28 d重症肺炎全因死亡的重要保护因素,肺泡灌洗液miR-3686、sTREM-1为SP 28 d重症肺炎全因死亡的重要危险因素(均P<0.05)。结论:SP患者肺泡灌洗液miR-127-5p表达降低,miR-3686、sTREM-1表达升高,与病情、预后密切相关,检测三者表达能为临床评估患者病情程度、预后情况提供参考。

miR-127-5p下调PTEN的表达促进非小细胞肺癌细胞自我更新和侵袭

为探讨miR-127-5p对非小细胞肺癌球形成细胞自我更新和侵袭的影响及机制,通过miR-127-5p模拟物或抑制剂分别转染H358和A549细胞,采用球形成实验检测H358和A549细胞的自我更新能力,transwell小室侵袭实验检测H358和A549细胞的侵袭能力,蛋白质印记检测PTEN和PCNA的表达,荧光素酶报告基因实验验证miR-127-5p的靶点。结果发现H358和A549球形成细胞较亲本细胞高表达miR-127-5p;过表达miR-127-5p促进H358和A549细胞的球形成和侵袭能力,并促进其PCNA的表达;生物信息学分析显示miR-127-5p与PTEN有直接结合位点,包含野生型PTEN 3’-非编码区载体组的荧光素酶活性明显降低;过表达miR-127-5p可明显抑制A549细胞中PTEN的表达。综上,miR-127-5p促进非小细胞肺癌H358和A549细胞系球形成和侵袭能力,其机制可能涉及下调PTEN的表达。

MiR-127-5p通过靶向调节adipoR1促进骨关节炎软骨细胞的增殖

脂联素(adiponection)与骨关节炎(osteoarthritis,OA)的发病密切相关,且主要通过其受体adipoR1发挥作用。而骨关节炎中脂联素的表达是否受miRNA表达的影响却未见报道。本文旨在研究miR-127-5p对骨关节炎软骨细胞中脂联素及细胞增殖的影响。分离培养人原代OA软骨细胞及对应正常细胞,甲苯胺蓝染色和II型胶原免疫细胞化学染色进行鉴定。Real-time PCR结果表明,OA软骨细胞中miR-127-5p的表达与正常软骨细胞中的相比较显著下降。MiR-127-5p转染可显著降低荧光素酶报告基因的荧光强度(P<0.05),表明adipoR1为miR-127-5p的靶向基因。MiR-127-5p mimic转染软骨细胞后,MTT法研究结果表明,miR-127-5p mimic可显著促进软骨细胞增殖,Western印迹结果表明,脂联素及其受体(adipoR1)表达显著上升,p65的表达以及p38、ERK1/2以及Ik Bα的磷酸化水平显著下降。ELISA结果表明,MMP-1、MMP-3、MMP-13的含量显著下降。实验结果提示,miR-127-5p通过靶向下调adipoR1及脂联素的表达,促进软骨细胞增殖,并且抑制NF-κB信号通路,进而抑制炎性反应。

miR-127-5p靶向IRAK4对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子表达的影响

目的探究miR-127-5p靶向白细胞介素1受体相关激酶4(IRAK4)对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子表达的影响方法首先分为对照组和感染组,感染组用肺炎链球菌感染A549细胞,感染组细胞分别转染miR-127-5p mimic、si-IRAK4及阴性对照质粒,qRT-PCR检测A549细胞中miR-127-5p的表达水平,western blot检测IRAK4、Bax、Bcl-2蛋白水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,ELISA检测白介素-10(IL-10)、白介素-6(IL-6)水平,双荧光素酶报告基因检测miR-127-5p与IRAK4的靶向关系。结果与对照组比较,肺炎链球菌感染后A549细胞中miR-127-5p、Bcl-2、IL-10水平显著降低,细胞凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6水平显著升高(P<0.05);与感染+miR-NC组比较,过表达miR-127-5p后,A549细胞中miR-127-5p、Bcl-2、IL-10水平显著升高,细胞凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6显著降低;与感染+si-NC组比较,抑制IRAK4表达后,A549细胞中细胞凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6水平显著降低,Bcl-2、IL-10水平显著升高;双荧光素酶报告基因及Western blot结果显示,miR-127-5p可通过与IRAK4特异性结合负向调控IRAK4的表达;与感染+miR-127-5p+pcDNA组比较,感染+miR-127-5p+pcDNA-IRAK4组A549细胞中凋亡率、IRAK4、Bax、IL-6水平显著升高,Bcl-2、IL-10水平显著降低(P<0.05)。结论miR-127-5p靶向IRAK4调控肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子IL-10、IL-6的表达。

miR-127-5p对结直肠癌细胞增殖的影响及其作用机制

目的探讨miR-127-5p对结直肠癌细胞增殖的影响及其特异性的作用机制。方法用PCR法检测miR-127-5p在结直肠癌组织及结直肠癌细胞株中的表达,转染miR-127-5p mimic后采用CCK-8检测结直肠癌细胞株增殖能力,通过生物信息学数据库miRBase预测miR-127-5p的靶基因,转染pcDNA-NEK1后采用CCK-8法检测结直肠癌细胞株增殖能力,蛋白免疫印迹检测鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)蛋白表达,观察过表达miR-127-5p对KRAS蛋白表达的影响。结果miR-127-5p在结直肠癌组织和细胞的表达水平低于癌旁组织和正常结直肠黏膜细胞,过表达miR-127-5p可抑制结直肠癌细胞增殖,NEK1是miR-127-5p的靶基因,过表达NEK1可促进结直肠癌细胞增殖,KRAS蛋白可与NEK1相互作用,过表达NEK1可促进KRAS蛋白的表达,但是过表达miR-127-5p则可抑制KRAS蛋白的表达。结论miR-127-5p通过靶向NEK1调控KRAS抑制结直肠癌细胞增殖,可作为结直肠癌患者潜在治疗靶点。

circ_0000285靶向miR-127-5p调控阿尔茨海默病细胞模型的损伤

目的:探讨环状RNA 0000285(circ_0000285)是否靶向miR-127-5p调控阿尔茨海默病(AD)细胞模型损伤。方法:采用β淀粉样蛋白25-35多肽片段(Aβ25-35)诱导神经细胞瘤细胞SK-N-SH建立AD体外细胞模型。采用实时定量PCR(RT-qPCR)测定circ_0000285和miR-127-5p表达水平。试剂盒测定丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。流式细胞术分析细胞凋亡,Western blot检测B细胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl相关x蛋白(Bax)蛋白表达水平。采用上述方法测定干扰circ_0000285表达或过表达miR-127-5p对AD模型细胞凋亡、损伤的影响。双荧光素酶报告实验和RT-qPCR用于验证circ_0000285对miR-127-5p的靶向调控作用。结果:Aβ25-35处理显著上调circ_0000285表达及Bax蛋白水平,下调miR-127-5p及Bcl-2蛋白表达水平,增加MDA含量,降低SOD和GSH-Px活性,并提高细胞凋亡率。干扰circ_0000285表达或过表达miR-127-5p可显著下调Bax蛋白水平,上调Bcl-2蛋白表达水平,降低MDA含量,增加SOD和GSHPx活性,并降低细胞凋亡率。circ_0000285靶向负调控miR-127-5p表达。抑制miR-127-5p表达显著减弱了干扰circ_0000285表达对模型细胞凋亡、损伤的影响。结论:干扰circ_0000285表达可通过靶向miR-127-5p减弱Aβ25-35诱导的SK-N-SH细胞损伤。因此,circ_0000285/miR-127-5p途径可能是AD的潜在治疗靶点。

白及多糖通过circ_0006168/miR-127-5p对肝癌细胞生物学行为的影响

目的探讨白及多糖对肝癌细胞生物学行为的影响及其可能作用机制。方法不同剂量的白及多糖处理人肝癌细胞HCC9204,实验分组:白及多糖0、50、100、200μg/mL组、si-NC组、si-circ_0006168组、白及多糖+pcDNA组、白及多糖+pcDNA-circ_0006168组;CCK-8法、平板克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术分别检测细胞增殖、克隆形成、迁移及凋亡;qRT-PCR法检测circ_0006168、miR-127-5p的表达量;双荧光素酶报告实验检测circ_0006168与miR-127-5p的靶向关系。结果与白及多糖0μg/mL组比较,50、100、200μg/mL组细胞增殖抑制率和细胞凋亡率升高(P<0.05),miR-127-5p的表达量升高(P<0.05),克隆形成数和迁移细胞数减少(P<0.05),circ_0006168的表达量降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;circ_0006168可靶向调控miR-127-5p的表达;与si-NC组比较,si-circ_0006168组miR-127-5p的表达量升高(P<0.05),细胞增殖抑制率和凋亡率升高(P<0.05),克隆形成数和迁移细胞数减少(P<0.05);与白及多糖+pcDNA组比较,白及多糖+pcDNA-circ_0006168组miR-127-5p的表达量降低(P<0.05),细胞增殖抑制率和凋亡率降低(P<0.05),克隆形成数和迁移细胞数增多(P<0.05)。结论白及多糖可通过调控circ_0006168/miR-127-5p表达而抑制肝癌细胞增殖、克隆形成及迁移,并可诱导细胞凋亡。

miR-127-5p对大鼠视网膜Müller细胞增殖能力影响的实验研究

目的探讨miR-127-5p对大鼠视网膜Müller细胞增殖能力的影响。方法将大鼠视网膜Müller细胞分为实验组和阴性对照组,其中实验组转染miR-127-5p模拟物miR-127-5p mimics(分为10、30、100μM 3种浓度),阴性对照组转染miR-127-5p阴性对照剂miR-127-5p-NC。采用CCK-8法检测两组Müller细胞的增殖能力;Transwell侵袭实验检测两组Müller细胞的侵袭能力;Transwell迁移实验检测两组Müller细胞的迁移能力;流式细胞术检测两组Müller细胞的凋亡率。结果与阴性对照组相比,转染10、30、100μM miR-127-5p mimics实验组中Müller细胞吸光度(OD)值均明显降低(均P<0.05),但3种浓度组间OD值比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组细胞侵袭、迁移数目均较阴性对照组明显减少(均P<0.05);实验组细胞凋亡率明显高于阴性对照组(P<0.05)。结论 miR-127-5p表达水平升高可以抑制大鼠视网膜Müller细胞增殖、侵袭和迁移能力,并促进视网膜Müller细胞的凋亡。

利奈唑胺联合美罗培南治疗重症肺炎疗效观察及对患者肺泡灌洗液中miR-127-5p、miR-3686表达的影响

目的:观察利奈唑胺联合美罗培南治疗重症肺炎的疗效及对患者肺泡灌洗液中miR-127-5p、miR-3686表达的影响。方法:重症肺炎患者102例随机分为联合组和对照组各51例。两组均给予常规治疗,对照组同时给予美罗培南,联合组在对照组基础上再加用利奈唑胺,均治疗2周。观察两组疗效和临床症状、体征改善时间、药品不良反应;比较两组患者治疗前后血气指标[动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧分压(PaO2)、血氧饱和度(SaO2)]、肺功能指标[最大呼气中段流量(MMF)、峰流速(PEF)、最大呼气压(PEmax)、最大吸气压(PImax)]、血清炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、降钙素原(PCT)、C反应蛋白(CRP)]水平以及肺泡灌洗液中miR-127-5p、miR-3686水平的变化。结果:联合组总有效率为94.12%,高于对照组的76.47%(P<0.05),联合组患者退热时间、痰液颜色改变时间、肺部炎症吸收>50%时间等均短于对照组(P<0.01);治疗后,两组PaCO2、血清TNF-α、PCT、CRP水平以及肺泡灌洗液中miR-3686水平较治疗前明显下降,PaO2、SaO2、MMF、PEF、PEmax、PImax水平以及肺泡灌洗液中miR-127-5p水平则较治疗前明显提高(P<0.05),且联合组上述各项指标均优于对照组(P<0.05);两组不良反应发生率差异无统计学意义(P>0.05)。结论:利奈唑胺联合美罗培南治疗重症肺炎可较快缓解临床症状、体征,改善血气情况与肺功能,减轻炎症反应,调节肺泡灌洗液miR-127-5p、miR-3686表达,提高疗效,且安全性较好。

circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴调控铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移

目的探索circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴对铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移的影响机制。方法检测circ0000799在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达。沉默亲代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和子代脑转移细胞MDA-MB-231-BM中circ0000799的表达。比较各组细胞生长、侵袭能力、脑转移结节数目。使用双荧光素酶报告基因实验验证circ0000799、miR-1287-5p、GPX4调控关系。检测circ0000799对铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达和总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比的影响。结果与人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)或癌旁组织比较,circ0000799在三阴乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中上调,且在子代三阴乳腺癌细胞系及脑转移灶中上调最为显著(P<0.05)。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组细胞生长、侵袭能力降低(P<0.05)。sh-circCTR组、sh-circ0000799组、sh-circ0000799+RSL3组脑转移结节数量依次降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,circ0000799可与miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可与GPX4相互作用。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组miR-1287-5表达增加,总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比和GPX4表达降低(P<0.05)。与miR-CTR组比较,miR-1287-5p组GPX4 mRNA表达降低(P<0.05)。结论circ0000799在三阴乳腺癌中高表达且可能通过miR-1287-5p/GPX4轴促进三阴乳腺癌脑转移。

新风胶囊抑制软骨细胞炎症和细胞外基质降解:基于调控miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴

目的探讨新风胶囊(XFC)对白介素(IL)-1β诱导的软骨细胞功能的影响及作用机制。方法构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型;SD大鼠灌胃制备XFC含药血清。细胞增殖实验(CCK-8)和流式细胞术筛选最佳XFC含药血清浓度;双荧光素酶报告分析miR-502-5p和TRAF2的靶向关系。构建miR-502-5p抑制表达质粒(inhibitor)及阴性对照组,转染至软骨细胞中。分为对照组(NC),IL-1β组,XFC组,IL-1β+NC-inhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor+XFC最佳含药血清组,酶联免疫吸附试验(ELASA)检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10的水平。逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹实验(WB)、免疫荧光法检测Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS5)和miR-502-5p/TRAF2/NF-κB基因的表达。结果与NC组相比,IL-1β组中软骨细胞活力下降,细胞凋亡率升高,且miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降,IL-1β、TNF-α和ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高(P<0.05)。筛选得出20%XFC为最佳含药血清浓度。与IL-1β组相比,XFC含药血清干预后,软骨细胞活力升高,细胞凋亡率下降,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κBp65表达下降,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达升高(P<0.05)。与NC-inhibitor相比,转染miR-502-5p inhibitor后,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降;与miR-502-5pinhibitor相比,将miR-502-5pinhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后,XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态对软骨细胞炎症和ECM的影响。结论XFC抑制软骨细胞炎症、细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。

circLRP6调节miR-31-5p/HMGA1轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的分析circLRP6调节miR-31-5p/高迁移率族蛋白A1(HMGA1)轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组,对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内,实时定量PCR测定细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1 mRNA水平,试剂盒测定细胞上清液白细胞介素-6(IL-6)水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙二醛(MDA)含量;流式细胞仪观察细胞凋亡;Western blotting测定细胞HMGA1、Bax、Bcl-2蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验分析miR-31-5p与circLRP6、HMGA1的靶向关系。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞circLRP6水平升高,细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+si-circLRP6组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。miR-31-5p与circLRP6、HMGA1均具有靶向关系。结论沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p,抑制HMGA1表达,对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。

circFAT1调节miR-211-5p/CCND2轴对糖尿病心肌病大鼠心肌损伤的影响

目的探讨circFAT1对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌损伤的影响及对miR-211-5p/细胞周期蛋白D2(CCND2)轴的调节机制。方法利用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素建立DCM大鼠模型,并随机分为DCM组、circ-NC组、circFAT1组、circFAT1+激动剂-NC组和circFAT1+miR-211-5p激动剂组,以喂食普通饲料的大鼠作为对照组,每组20只。实时PCR检测心肌组织中circFAT1、miR-211-5p、CCND2水平;Western blotting检测心肌组织CCND2蛋白表达;生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;心脏超声检测大鼠心功能;HE和Masson染色观察心肌组织病理形态;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证circFAT1、miR-211-5p、CCND2之间的靶向关系。结果与对照组相比,DCM组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)水平降低(P<0.05),FBG、TC、TG、左心室舒张末期直径(LVEDd)、左心室收缩末期直径(LVEDs)、胶原容积分数(CVF)、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05);与DCM组相比,circFAT1组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,LVEF、LVFS水平升高(P<0.05),FBG、TC、TG、LVEDd、LVEDs、CVF、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05);miR-211-5p激动剂逆转了circFAT1对DCM心肌损伤的缓解作用,且CCND2 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论circFAT1通过调控miR-211-5p/CCND2轴减轻DCM大鼠心肌组织损伤。

灰树花多糖通过LncRNA HULC/miR-186-5p轴调控胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:分析灰树花多糖(Grifola frondose polysaccharide,GFP)对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:将对数期GBC-SD细胞随机分组:对照组、GFP组(0.5、1、2µg/mL GFP)、shNC组、shHULC组、miR-NC组、miR-186-5p mimics组、GFP+pcDNA组、GFP+pcDNA-HULC组。CCK-8法检测细胞抑制率;Transwell小室法检测GBC-SD细胞迁移和侵袭;Western Blot印迹检测Cyclin D1、P21、MMP-2、MM-9蛋白水平;qRT-PCR检测LncRNA HULC和miR-186-5p的水平;Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p的结合位点,双荧光素酶报告实验检测LncRNA HULC和miR-186-5p的靶向关系。裸鼠移植瘤实验检测GFP对GBC-SD细胞移植瘤体内生长的影响。结果:0.25~8µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用;与对照组比较,0.5、1、2µg/mL的GFP(极)显著(P<0.05,P<0.01)抑制GBC-SD细胞迁移和侵袭,(极)显著降低Cyclin D1、MMP-2和MM-9水平(P<0.05,P<0.01),(极)显著(P<0.05,P<0.01)增加P21水平,极显著(P<0.01)下调LncRNA HULC,上调miR-186-5p的表达(P<0.05,P<0.01);Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点,与miR-NC组比较,miR-186-5p mimics组HULC-WT的荧光素酶活性极显著降低(P<0.01),而HULC-MUT荧光素酶活性无统计学差异(P>0.05);与shNC组比较,shHULC组HULC相对表达水平极显著(P<0.01)降低,miR-186-5p相对表达水平极显著(P<0.01)增加,细胞存活率、迁移数目、侵袭数目极显著(P<0.01)降低,Cylin D1、MMP-2和MM-9水平极显著下调(P<0.01);与GFP+pcDNA组比较,GFP+pcDN-HULC组抑制率显著降低(P<0.05),迁移数目、侵袭数目极显著增加(P<0.01),Cylin D1、MMP-2和MM-9水平显著上调(P<0.05);与GFP+pcDNA给药组比较,GFP+pcDN-HULC给药组瘤体体积、质量极显著增加(P<0.01),miR-186-5p水平极显著下调(P<0.01)。结论:GFP可抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制与调控LncRNA HULC/miR-186-5p有关。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

乌梅总黄酮对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中miR-145-3p/CREB5轴的影响

目的研究乌梅总黄酮(Fructus mume total flavone,FMF)对MPP^(+)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞基因表达的影响。方法采用CCK-8筛选FMF及MPP^(+)作用于SH-SY5Y细胞的最佳浓度与时间。收集对照组、模型组(MPP^(+)诱导)和FMF组(MPP^(+)诱导+FMF干预)SH-SY5Y细胞,进行全基因转录组高通量测序,并筛选差异表达的miRNAs和mRNAs。通过生信软件分析miR-145-3p潜在靶基因,并与差异表达mRNAs相交取交集。将SH-SY5Y细胞分为6组:对照组、模型组、miR-145-3p mimics组、mimics NC组、miR-145-3p inhibitor组、inhibitor NC组。qRT-PCR检测细胞miR-145-3p表达水平,Western blot检测细胞CREB5蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性。结果对照组与模型组间比较,存在33个差异表达miRNAs,模型组与FMF组间比较,存在16个差异表达miRNAs,取交集后,得到7个差异表达的miRNAs,其中miR-145-3p在模型组下调,在FMF组上调。经分析获到4个miR-145-3p调控的差异靶基因:CREB5、EGLN1、NTNG1和SLC22A15。与对照组比较,模型组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。与NC组比较,miR-145-3p mimics组miR-145-3p表达水平显著升高,CREB5蛋白表达水平显著降低,miR-145-3p inhibitor组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。双荧光素酶报告基因结果显示miR-145-3p与CREB5存在靶向调控关系。结论miR-145-3p和CREB5均在MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞中差异表达,FMF可调控miR-145-3p/CREB5轴在细胞中的表达水平。

miR-222-5p靶向WNK2基因促进肝细胞癌生长

目的 探讨miR-222-5p对肝细胞癌(HCC)生长的影响及其分子机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-222-5p和WNK2 mRNA在HCC组织、癌旁组织及正常肝细胞系L02、不同HCC细胞系Hep3B、HepG2、HuH-7中表达;生物信息学预测和双荧光素酶验证miR-222-5p和WNK2靶向关系;取生长密度达50%~60%的HepG2癌细胞,分为miR-222-5p NC组、miR-222-5p mimics组、miR-222-5p inhibitor组、miR-222-5p NC+pSUPER-si NC组、miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p NC+pcDNA组、miR-222-5p NC+pcDNA-WNK2组、miR-222-5p mimics+pcDNA组、miR-222-5p mimics+pcDNA-WNK2组,另取未转染L02正常肝细胞和HepG2癌细胞。24 h后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖率;平板克隆法检测克隆形成能力;裸鼠成瘤实验检测细胞在动物体内成瘤能力;Western印迹法检测WNK2蛋白表达水平。结果 与癌旁组织及正常肝细胞相比,HCC组织及各细胞系中miR-222-5p表达水平明显升高,WNK2 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)。与miR-222-5p NC组相比,miR-222-5p mimics组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05),miR-222-5p inhibitor组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低,WNK2蛋白表达水平升高(P<0.05)。miR-222-5p和WNK2存在靶向关系。与miR-222-5p NC+pcDNA组相比,miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05);miR-222-5p mimics+pcDNA组增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p mimics+pcDNA组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 过表达miR-222-5p可能通过靶向抑制WNK2表达促进肝癌HepG2细胞的增殖、克隆形成和成瘤能力,促进HCC生长。

miR-218-5p靶向PDE7A调节人非小细胞肺癌A549细胞的糖酵解

目的:探究miR-218-5p靶向磷酸二酯酶7A(PDE7A)调节人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞糖酵解过程的机制。方法:常规培养A549细胞,用Lipo3000将miR-218-5pmimic、mimic-NC、PDE7A过表达质粒(PDE7A-oe)和PDE7A对照质粒(PDE7A-NC)转染A549细胞,记为miR-218-5pmimic组、mimic-NC组、PDE7A-oe组和PDE7A-NC组。qPCR法验证转染效率,WB法检测糖酵解关键酶蛋白的表达,葡萄糖测定法和乳酸生成测定法检测各转染组A549细胞中2脱氧葡萄糖和乳酸含量,双萤光素酶报告基因实验验证miR-218-5p与PDE7A靶向结合关系,用TCGA数据库数据分析PDE7AmRNA在肺癌组织中的表达水平。结果:在A549细胞中成功地过表达了miR-218-5p(P<0.01)。过表达miR-218-5p均能显著抑制A549细胞中PDE7A、HK2、PKM2蛋白的表达(均P<0.01)、葡萄糖摄取量和乳酸生成量(均P<0.01)。过表达PDE7A均可显著促进A549细胞中PDE7A、HK2、PKM2蛋白的表达(均P<0.01),以及葡萄糖摄取量和乳酸生成量(均P<0.01)。A549细胞中miR-218-5p可与PDE7AmRNA的3´-UTR直接结合。数据库数据分析结果显示,PDE7AmRNA在肺鳞状细胞癌组织中呈高表达(P<0.01)。结论:miR-218-5p靶向PDE7A调控A549细胞中HK2和PKM2的表达水平,进而抑制糖酵解过程,miR-218-5p/PDE7A可能是NSCLC临床诊断和治疗的潜在靶点。