DNA甲基化介导miR-128-2沉默对子宫内膜癌细胞中DJ-1表达的影响

目的在子宫内膜癌细胞系水平,进一步明确上调子宫内膜癌细胞内DJ-1表达的重要调控机制。方法1.利用正常人子宫内膜上皮细胞(ESC)和4种子宫内膜癌细胞株,检测细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化的水平、miR-128-2、DJ-1 mRNA及DJ-1蛋白表达水平,比较分析它们在不同的子宫内膜癌细胞系中的差异变化及相关性。2.将miR-128-2 mimic和miR-128-2 inhibitor依次分别转染Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞株,测定细胞中miR-128-2、DJ-1 mRNA及DJ-1蛋白表达水平的变化,以求阐明miR-128-2是否能调控内源性DJ-1表达。3.分别构建含野生型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-wt和含有突变型DJ-1-3’UTR的重组荧光素酶报告载体pGL3-DJ-1-3’UTR-mut,验证DJ-1是否为miR-128-2直接靶基因。4.Ishikawa和SPEC-2子宫内膜癌细胞经5μM甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)药物预处理48 h或5-Aza-dC预处理后再转染miR-128-2 inhibitor 48 h,随后检测miR-128-2基因启动子DNA甲基化水平的变化、miR-128-2和DJ-1 mRNA表达丰度的变化、DJ-1蛋白的表达水平变化,以求阐明子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子DNA甲基化是否沉默miR-128-2表达进而上调DJ-1表达。结果1.与正常ESC相比较,Ishikawa、RL95-2、KLE及SPEC-2四种子宫内膜癌细胞中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平均显著增加(P<0.01),同时miR-128-2表达明显下调(P<0.01),而DJ-1 mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01);通过相关性分析发现miR-128-2甲基化水平与miR-128-2表达具有显著负相关性(r=-0.9124,P<0.01),而与DJ-1 mRNA表达具有显著正相关性(r=0.8304,P<0.01);此外,miR-128-2表达与DJ-1 mRNA的表达表现为负相关性(r=-0.8963,P<0.01)。2.Ishikawa和SPEC-2细胞中转染miR-128-2 inhibitor后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均有明显升高(P<0.01),而miR-128-2 mimic转染细胞后,DJ-1 mRNA及蛋白表达水平较对照组均出现明显下降(P<0.01)。3.miR-128-2 mimic转染细胞后,重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-wt的荧光素酶活性大幅降低(P<0.01),但miR-128-2 mimic对重组报告质粒pGL3-DJ-1-3’UTR-mut的荧光素酶活性却无法产生作用(P>0.05),提示miR-128-2可直接与DJ-13’UTR靶向结合。4.经5μM甲基化抑制剂5-Aza-dC预处理48 h后,Ishikawa及SPEC-2细胞中miR-128-2甲基化水平均显著下降(P<0.01),miR-128-2表达均显著上升,而DJ-1 mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.01)。此外,5-Aza-dC预处理上调miR-128-2表达并下调DJ-1 mRNA和蛋白表达的作用可被miR-128-2 inhibitor所逆转(P<0.01),然而,5-Aza-dC预处理降低miR-128-2甲基化水平的作用却未能被miR-128-2 inhibitor影响。结论子宫内膜癌细胞中DJ-1的表达可由miR-128-2直接靶向负调控;miR-128-2基因启动子区DNA甲基化致miR-128-2表达沉默可能是子宫内膜癌细胞中上调DJ-1表达的关键机制。

子宫内膜癌组织中miR-128-2基因启动子DNA甲基化水平与miR-128-2、DJ-1表达及临床病理因素相关性的研究

目的检测新鲜子宫内膜癌组织及癌旁正常组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平以及miR-128-2和DJ-1(RS/PARK7/CAP1)表达水平,并分析其相关性,拟从组织学水平寻找miR-128-2基因启动子DNA甲基化可能参与子宫内膜癌DJ-1表达调控的相关证据。方法收集江西省妇幼保健院经手术切除的63例子宫内膜癌组织标本及其相配对的癌旁正常子宫内膜组织,采用荧光实时定量甲基化特异性PCR(q MSP)方法检测组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化水平、荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达丰度、Western blot检测DJ-1蛋白表达水平,同时比较分析miR-128-2基因启动子DNA甲基化与miR-128-2、DJ-1表达与临床病理因素间的相关性。结果与癌旁正常子宫内膜组织相比较,子宫内膜癌组织中miR-128-2启动子区DNA甲基化水平显著增加(P <0.01),同时miR-128-2表达下调而DJ-1 mRNA及蛋白表达上调(P <0.01);通过相关性分析发现子宫内膜癌组织中miR-128-2基因启动子区DNA甲基化程度与miR-128-2表达负相关(Pearson相关系数r=-0.9693,P <0.01)而与DJ-1 mRNA表达正相关(Pearson相关系数r=0.8762,P <0.01)。此外,通过临床病理资料发现miR-128-2甲基化水平、miR-128-2以及DJ-1 mRNA表达水平均与子宫内膜癌患者的病理类型、分化程度无关,而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和临床分期相关(P <0.05)。结论在组织水平佐证了子宫内膜癌中DJ-1表达上调可能与miR-128-2基因启动子区高DNA甲基化及其表达沉默有关。

miR-128-3p靶向TGF-β_(2)/JNK信号通路调控冠心病内皮细胞膜微粒及炎症因子的机制研究

目的探讨miR-128-3p靶向转化生长因子β_(2)/c-Jun氨基末端激酶(TGF-β_(2)/JNK)信号通路调控冠心病(CHD)内皮细胞膜微粒(EMPs)及炎症因子的机制。方法将60只大鼠随机分为正常组、模型组、miR-128-3p agomir组、NC agomir组、miR-128-3p inhibitor组、NC inhibitor组,每组10只,除正常组外,其余各组均建立CHD大鼠模型,miR-128-3p agomir组、NC agomir组、miR-128-3p inhibitor组、NC inhibitor组大鼠分别尾静脉注射miR-128-3p激动剂、NC agomir、miR-128-3p抑制剂、NC inhibitor,模型组和正常组大鼠尾静脉注射相同剂量的生理盐水。采用ELISA检测各组大鼠血清EMPs、一氧化氮(NO)、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)水平;采用HE染色观察各组大鼠心肌组织病理形态变化;采用蛋白质免疫印迹法检测各组大鼠心肌组织TGF-β_(2)、JNK、p-JNK蛋白水平。结果正常组大鼠各项检测指标均明显优于其他组,差异均有统计学意义(P<0.05);模型组、NC inhibitor组、NC agomir组心肌组织血清EMPs、NO、IL-6、TNF-α、TGF-β_(2)、JNK、p-JNK蛋白水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);与模型组比较,miR-128-3p agomir组大鼠血清EMPs、IL-6、TNF-α水平下降最明显,而NO、IL-1Ra水平升高最显明显,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,miR-128-3p agomir组大鼠心肌组织病理形态改善明显,心肌组织TGF-β_(2)、JNK、p-JNK蛋白水平降低最明显,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论上调miR-323-3p能通过抑制TGF-β_(2)/JNK信号通路相关蛋白(TGF-β_(2)、JNK、p-JNK)水平,降低CHD大鼠EMPs及炎症因子水平,在CHD的发生和发展过程中可能具有保护作用。

miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖和分化调节作用的研究

旨在研究miR-128-1-5p对绵羊前体脂肪细胞增殖与分化的调节作用。本研究经理论预测和试验研究验证miR-128-1-5p的靶基因;过表达miR-128-1-5p后,用qPCR检测增殖标志基因的表达,CCK-8和EdU检测细胞增殖情况;用qPCR和Western blotting检测miR-128-1-5p和其靶基因在前体脂肪细胞分化中的表达趋势;通过过表达或抑制miR-128-1-5p研究其对绵羊前体脂肪细胞分化的调节机制;用油红O染色检测成脂能力。结果表明,KLF2是miR-128-1-5p的靶基因。前体脂肪细胞增殖过程中,过表达miR-128-1-5p后,增殖标志基因的表达量显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),细胞活力显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),新生细胞数显著减少(P<0.05)。前体脂肪细胞分化过程中,miR-128-1-5p与KLF2的表达呈负相关;过表达miR-128-1-5p极显著下调了KLF2 mRNA的表达量(P<0.01),显著下调了KLF2蛋白的表达量(P<0.05),显著或极显著上调了分化标志基因mRNA的表达(P<0.05或P<0.01),产生更多脂滴;抑制miR-128-1-5p则结果相反。综上所述,miR-128-1-5p与KLF2存在结合位点。miR-128-1-5p抑制绵羊前体脂肪细胞的增殖,在分化过程中通过靶向抑制KLF2的表达,促进前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。

抑制miR-128-3p表达对油酸致大鼠肺损伤的保护作用研究

目的探讨抑制miR-128-3p表达对油酸致大鼠肺损伤的保护作用及可能机制。方法随机将100只SD大鼠分成5组:假手术组(sham组)、模型组(Model组)、antagomir NC组(NC组)、miR-128-3p antagomir组(antagomir组)和miR-128-3p antagomir+Nrf2抑制剂ML385组(antagomir+ML385组),每组20只。采用尾静脉注射油酸(0.15 ml/kg)的方法建立肺损伤大鼠模型,术前1 h给予miR-128-3p antagomir或ML385进行干预。造模成功24 h后,测定动脉血氧分压(PaO2)、氧合指数(OI)及肺组织湿/干重比(W/D);苏木精-伊红染色法(HE)观察肺组织病理学改变并评分;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量;比色法测定肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平;反转录酶-聚合酶链锁反应(RT-PCR)检测肺组织中miR-128-3p表达水平以及E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶-1(HO-1)的mRNA水平;蛋白质印迹免疫(Western blot)检测肺组织中Nrf2和HO-1的蛋白表达水平;荧光素酶报告基因实验验证miR-128-3p与Nrf2的靶向作用关系。结果与sham组比较,Model组大鼠肺组织损伤严重,肺组织病理评分、W/D值、BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,肺组织中ROS和MDA水平以及miR-128-3p表达水平增加(P<0.01),而PaO2、OI值和SOD活性以及Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均降低(P<0.01);与Model组比较,antagomir组大鼠肺组织损伤程度得到明显改善,肺组织病理评分、W/D值、BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6含量,肺组织中ROS和MDA水平以及miR-128-3p表达水平下降(P<0.01),而PaO 2、OI值和SOD活性以及Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表达水平均上升(P<0.01),而NC组大鼠以上各指标差异无统计学意义(P>0.05);与antagomir组比较,antagomir+ML385组大鼠以上各指标变化趋势又发生逆转(均P<0.01)。荧光素酶报告基因实验证实,miR-128-3p能靶向调控Nrf2的表达。结论抑制miR-128-3p表达可显著减轻模型大鼠的肺损伤,其作用机制可能与通过靶向调控Nrf2表达,抑制肺组织炎症反应有关。

CircASH2L调节miR-128-3p/MKNK2轴对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响

目的:研究环状RNA缺失-小同源异形-2样蛋白(CircASH2L)调节miR-128-3p/MAP激酶相互作用丝氨酸/苏氨酸激酶2(MKNK2)轴对卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响。方法:实时荧光定量PCR检测人卵巢癌细胞株SKOV3和人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3-TR30中miR-128-3p与CircASH2L、MKNK2表达。体外培养SKOV3-TR30细胞,随机分为对照组、紫杉醇组、紫杉醇+阴性对照组、紫杉醇+CircASH2L敲低组、紫杉醇+CircASH2L敲低+miR-128-3p inhibitor组,分组处理后,检测各组细胞增殖率、凋亡率,miR-128-3p及CircASH2L、MKNK2、多重耐药1(MDR1)、多药耐药相关蛋白5(MRP5)mRNA表达,MKNK2及P-gp、MRP5蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验检测SKOV3-TR30中CircASH2L对miR-128-3p的靶向调节及miR-128-3p对MKNK2的靶向调节。结果:与SKOV3细胞相比,SKOV3-TR30细胞中CircASH2L与MKNK2 mRNA表达升高,miR-128-3p表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组、紫杉醇组分别相比,紫杉醇+CircASH2L敲低组的细胞增殖率降低,CircASH2L及MKNK2、MDR1、MRP5 mRNA表达降低,MKNK2及P-gp、MRP5蛋白表达降低,细胞凋亡率、miR-128-3p表达均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);紫杉醇组、紫杉醇+阴性对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。下调miR-128-3p可逆转敲低CircASH2L对紫杉醇处理下SKOV3-TR30细胞各指标变化。CircASH2L可靶向下调SKOV3-TR30中miR-128-3p且miR-128-3p可靶向下调MKNK2。结论:敲低CircASH2L可通过促进miR-128-3p表达而下调MKNK2表达,进而抑制卵巢癌细胞的紫杉醇耐药性。

针刺调控miR-128-3p对卒中大鼠神经功能及Nrf2表达影响

目的观察针刺对卒中大鼠的神经功能改善作用,并初步探讨其机制。方法建立脑缺血再灌注大鼠模型,72只SD大鼠随机分为模型组、激动剂组、激动剂阴性对照组、针刺组、针刺+激动剂组,每组12只,另取12只SD大鼠设为假手术组,针刺组、针刺+激动剂组大鼠于双侧阳陵泉穴及曲池穴行针,激动剂组、激动剂阴性对照组、针刺+激动剂组大鼠分别以5 mL/kg剂量尾静脉注射miR-128-3p agomir、miR-128-3p agomir阴性对照,假手术组、模型组和针刺组尾静脉注射等剂量生理盐水,持续7 d。对各组大鼠进行神经功能缺损评分,以苏木素-伊红(HE)染色检测各组大鼠皮质组织病理变化,以酶联免疫吸附法检测血清中枢神经特异性蛋白(S100β)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,以实时荧光定量PCR检测各组大鼠脑皮质组织miR-128-3p、红系衍生的核转录相关因子(Nrf2)mRNA水平,以Western blot法检测脑皮质组织中Nrf2蛋白表达情况。结果与假手术组相比,模型组大鼠脑皮质神经元呈现细胞核收缩变小、细胞坏死、数量减少等病理损伤;神经功能缺损评分,血清中β、NSE、IL-6及TNF-α水平,脑皮质组织miR-128-3p水平均明显升高(P<0.05);脑皮质组织Nrf2 mRNA及蛋白水平明显降低(P<0.05)。与模型组相比,针刺组大鼠脑皮质神经元病理损伤减轻;神经功能缺损评分,血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平,脑皮质组织miR-128-3p水平降低(P<0.05);脑皮质组织Nrf2 mRNA及蛋白水平升高(P<0.05)。激动剂组大鼠脑皮质神经元病理损伤加重;神经功能缺损评分,血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平,脑皮质组织miR-128-3p水平升高(P<0.05);脑皮质组织Nrf2 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05)。激动剂阴性对照组大鼠无明显变化(P>0.05)。与针刺组比较,针刺+激动剂组大鼠脑皮质神经元病理损伤加重;神经功能缺损评分,血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平,脑皮质组织miR-128-3p水平升高(P<0.05);脑皮质组织Nrf2 mRNA及蛋白水平降低(P<0.05)。与激动剂组比较,针刺+激动剂组大鼠脑皮质神经元病理损伤减轻;神经功能缺损评分,血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平,脑皮质组织miR-128-3p水平降低(P<0.05);脑皮质组织Nrf2 mRNA及蛋白水平升高(P<0.05)。结论针刺可能通过下调miR-128-3p表达,促进Nrf2表达,减轻卒中大鼠炎症损伤,改善其神经功能。