miR-1298通过调控SetD7表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长

目的探索miR-1298调控青光眼视网膜神经节细胞生长及其机制。方法20只C57BL/6小鼠被用于阻断巩膜上静脉建立慢性小鼠青光眼模型。脂多糖诱导Müller细胞作为体外模型,同时转染miR-NC(空白对照组)、miR-1298 mimic、miR-1298 inhibitor、miR-1298 mimic+重组人Set7/9组蛋白甲基转移酶(SetD7)。采用MTT实验、乳酸脱氢酶(LDH)活性和Caspase-3、Caspase-9试剂盒、RT-qPCR和Western blot方法探索miR-1298的功能和机制。结果在青光眼小鼠模型视网膜组织中miR-1298表达量显著提高。上调miR-1298能够抑制Müller细胞增殖和激活LDH活性,下调miR-1298能够促进Müller细胞增殖和减少LDH活性。SetD7是miR-1298调控靶点,激活SetD7可以减弱miR-1298对青光眼视网膜神经节细胞生长的抑制作用。结论miR-1298在青光眼小鼠模型视网膜组织中表达量显著提高,miR-1298能够通过调控SetD7表达抑制青光眼视网膜神经节细胞生长,miR-1298的表达可为青光眼预防和治疗提供参考。

绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5P靶基因预测及表达载体构建

探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5P的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5P与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过miRNA的分离、表达、靶基因预测筛选表达及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,用生物信息学方法预测miR-1298-5P的靶基因,并对其靶基因Fg F2的靶位点进行克隆测序、缺失突变。miR-1298-5P及其靶基因在皮肤毛囊不同发育时期均呈现差异性表达,二者之间呈现一种负调控趋势,其可能对皮肤毛囊周期性发育起到一定的调控作用。靶基因预测发现Fg F2的3'UTR存在mi R-1298-5P种子区结合位点,并成功构建了Fg F2 3'UTR表达载体,该载体的成功构建为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。

不同品种羊miR-1298-5p及其潜在靶基因TGF-βR1表达的比较研究

旨在探讨miR-1298-5p与TGF-βR1在不同品种羊皮肤毛囊不同发育时期的潜在关系,为研究miR-1298-5p与TGF-βR1对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。以绒山羊和细毛羊皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用qRT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Western blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点。miR-1298-5p在绒山羊和细毛羊皮肤毛囊发育的生长期到退行期相对表达量上调而退行期到休止期相对表达量下调,miR-1298-5p在不同品种羊皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。绒山羊皮肤毛囊发育生长期TGF-βR1基因m RNA的相对表达量高于细毛羊,而退行期和休止期低于细毛羊;从表达趋势上看,TGF-βR1与miR-1298-5p表达趋势相反,呈现负调控趋势,说明TGF-βR1可能为miR-1298-5p的靶基因。TGF-βR1蛋白在绒山羊皮肤毛囊发育生长期的相对表达量高于细毛羊,而退行期和休止期则低于细毛羊,与核酸水平相对表达量趋势相同,但都与miR-1298-5p表达趋势相反,更进一步说明TGF-βR1可能为miR-1298-5p的靶基因。

细毛羊皮肤毛囊miR-1298-5p的靶基因预测及验证

为探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,本实验以乾华肉用美利奴羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR和Western Blot对miR-1298-5p及其靶基因进行定量检测;扩增靶基因3'UTR区,构建野生型和突变型靶基因表达载体后与miR-1298-5p mimics共同转染到HEK293T/17细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1298-5p与靶基因的靶向关系。结果表明:FGF_2基因3'UTR区含有miR-1298-5p结合位点,FGF_2为miR-1298-5p潜在靶基因,通过核酸水平和蛋白水平定量表达规律发现miR-1298-5p与靶基因FGF_2呈负相关,初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。双荧光素酶报告基因实验显示,miR-1298-5p mimics能够抑制野生型FGF_2的靶位点报告载体的荧光素酶活性;但当靶基因结合位点突变后,FGF_2被抑制的荧光素酶活性能够得到恢复。综上,miR-1298-5p与FGF_2有靶向关系,miR-1298-5p能通过负调控FGF_2的表达调控羊毛囊发育。

辽宁绒山羊皮肤毛囊mir-1298-5p靶基因预测及表达载体构建

探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期mir-1298-5p的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为mir-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论依据。以辽宁绒山羊皮肤毛囊组织为材料,通过mi RNA的分离、表达、靶基因预测筛选及靶位点3'UTR表达载体构建,采用RT-PCR进行表达检测,在线靶基因预测软件预测mir-1298-5p的靶基因,并对其靶基因TGF-βR1的靶位点进行克隆测序、缺失突变。结果表明:靶基因预测发现TGF-βR1的3'UTR存在mir-1298-5p种子区结合位点,且mir-1298-5p及其靶基因TGF-βR1均在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达。mir-1298-5p对皮肤毛囊周期性发育可能起到一定的调控作用,并成功构建了TGF-βR1 3'UTR表达载体,为后期过表达转染体系的建立和功能基因的验证奠定了基础。

Hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA轴促进人肺腺癌细胞增殖和迁移的作用机制

目的 目前对于Hsa_circ_0016600是否通过miR-1298/TGFA轴通路参与肺腺癌的发生过程尚不清楚。文中旨在探讨Hsa_circ_0016600对肺腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其对miR-1298/TGFA通路的调控作用。方法 通过高通量测序技术对5对肺癌组织及癌旁组织进行检测,筛选出具差异性的环状RNA Hsa_circ_0016600,利用mirTarbase和TargetScan数据库预测、荧光素报告酶实验验证Hsa_circ_0016600与miR-1298、miR-1298与TGFA的相互作用;利用qRT-PCR技术检测Hsa_circ_0016600在肺腺癌组织及细胞系中的表达情况。根据转染肺腺癌细胞不同分为:Si-NC组(Si-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ组(Si-hsa_circ_0016600转染肺腺癌细胞)、Si-TGFA组(Si-TGFA转染肺腺癌细胞)、miR-NC组(miR-1298-NC转染肺腺癌细胞)、miR-mimics组(miR-1298-mimics转染肺腺癌细胞)、miR-inh组(miR-1298-inhibitors转染肺腺癌细胞)、Si-circ+miR-NC组(Si-circ、miR-NC转染肺腺癌细胞)、Si-circ+miR-inh组(Si-circ、miR-inh转染肺腺癌细胞)、si-NC+miR-NC组(si-NC、miR-NC转染肺腺癌细胞)、miR-NC+pcDNA3.1组(miR-1298-NC、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)、miR-mimics+TGFA组(miR-mimics、TGFA转染肺腺癌细胞)和miR-mimics+pcDNA3.1组(miR-mimics、pcDNA3.1转染肺腺癌细胞)。应用克隆形成实验、划痕实验及Transwell侵袭实验检测上述干预对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响;通过蛋白免疫印迹法检测经上述分组干预后对目的蛋白TGFA表达的影响。结果 高通量测序筛选出在肺腺癌组织中高表达的环状RNA hsa_circ_0016600。克隆形成实验显示,A549和PC9中Si-circ组的克隆形成率[(2.07±0.40)、(2.90±0.40)]明显低于Si-NC组[(5.33±0.35)、(7.30±0.36)],差异有统计学意义(P<0.05);细胞划痕实验表明,A549和PC9细胞中Si-circ组的迁移率较Si-NC组明显降低(P<0.05);Transwell侵袭实验显示,A549和PC9细胞中Si-circ组的侵袭细胞数明显低于Si-NC组(P<0.05)。A549和PC9中Si-TGFA组的克隆形成率、侵袭细胞数、迁移率明显低于Si-NC组(P<0.05)。与Si-circ+miR-NC组比较,Si-circ+miR-inh组细胞克隆形成率在A549细胞及PC9细胞中明显升高(P<0.01);划痕实验显示,Si-circ+miR-inh组A549及PC9的迁移率较Si-circ+miR-NC组增高(P<0.01);侵袭实验表明,Si-circ+miR-inh组A549及PC9侵袭细胞数较Si-circ+miR-NC组明显增多(P<0.01)。miR-mimics+TGFA组TGFA的表达、侵袭细胞数、细胞迁移率较miR-mimics+pcDNA3.1组增加(P<0.01)。结论 Hsa_circ_0016600/miR-1298/TGFA轴促进人肺腺癌细胞增殖、迁移和侵袭,为肺腺癌的治疗提供新的理论依据。

细毛羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p靶基因预测及验证

为了探讨miR-1298-5p及其靶基因与细毛羊毛囊生长发育的关系,以细毛羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,通过生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RT-PCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因FGF_2进行核酸水平相对定量检测,利用Western Blot对潜在靶基因FGF_2进行蛋白相对定量检测。生物信息学预测结果表明,FGF_2的3'UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控FGF_2从而调控皮肤毛囊生长发育。表明结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及FGF_2在核酸水平表达规律和蛋白表达水平表达规律初步确定FGF_2为miR-1298-5p的靶基因。

circ_0030018靶向miR-1298抑制急性淋巴细胞白血病细胞KOCL44增殖和诱导其凋亡的实验研究

目的:探讨环状RNA 0030018(circ0030018)靶向miR-1298对急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞KOCL44增殖、凋亡的影响。方法:实时定量PCR(RT-qPCR)检测circ0030018和miR-1298在ALL患者和健康志愿者骨髓组织中的表达。将KOCL44细胞分为si-circ0030018组(转染si-circ0030018)、si-NC组(转染si-NC)、miR-1298组(转染miR-1298模拟物)、miR-NC组(转染miR-NC)、si-circ0030018+anti-miR-NC组(转染si-circ0030018和anti-miR-NC)、si-circ0030018+anti-miR-1298组(转染si-circ0030018和anti-miR-1298)。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)、集落形成、流式细胞术检测circ0030018和miR-1298表达对KOCL44细胞活力、克隆形成能力和凋亡的影响。蛋白质印迹法(western blotting)检测裂解的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved-caspase-3)和cleaved-caspase9表达。运用双荧光素酶报告实验和RT-qPCR分析circ0030018和miR-1298靶向关系。结果:与健康志愿者比较,ALL患者骨髓单个核细胞中circ0030018表达量显著升高(P<0.05),miR-1298表达量显著降低(P<0.05)。干扰circ0030018显著降低KOCL44细胞活力、克隆形成数(P<0.05),增加凋亡率以及cleaved-caspase-3、cleaved-caspase9蛋白表达量(P<0.05)。过表达miR-1298显著降低KOCL44细胞活力、克隆形成数(P<0.05),增加凋亡率以及cleaved-caspase-3、cleaved-caspase9蛋白表达量(P<0.05)。miR-1298与circ0030018存在互补位点,干扰circ0030018显著增加miR-1298的表达量(P<0.05)。抑制miR-1298表达能够减弱干扰circ0030018对KOCL44细胞增殖和凋亡的影响(P<0.05)。结论:干扰circ0030018通过靶向上调miR-1298表达能够抑制ALL细胞KOCL44增殖,诱导细胞凋亡。

circPDSS1通过靶向miR-1298调控肝癌细胞侵袭、迁移和凋亡的分子机制

目的探讨环状RNA PDSS1(circPDSS1)对肝癌细胞凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝癌组织、癌旁组织中circPDSS1和miR-1298的表达。双荧光素酶报告基因实验、RT-qPCR确定circPDSS1对miR-1298的靶向调控作用。将circPDSS1小干扰RNA(si-circPDSS1)、miR-1298 mimics、si-circPDSS1+miR-1298抑制物(anti-miR-1298)分别转染肝癌细胞MHCC97H,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭。结果与癌旁组织比较,肝癌组织中circPDSS1表达(3.41±0.33比1.00±0.06)显著升高,miR-1298表达(0.42±0.04比1.00±0.07)显著降低(P<0.05)。circPDSS1对miR-1298具有靶向负性调控作用。抑制circPDSS1表达后MHCC97H细胞凋亡率(22.71±2.19比6.02±0.05)显著升高,迁移(55.72±4.78比101.86±9.65)和侵袭(41.24±3.80比85.71±7.57)细胞数显著减少(P<0.05)。过表达miR-1298后MHCC97H细胞凋亡率(18.67±1.06 vs 7.08±0.69)显著升高,迁移(61.11±5.54比107.15±10.96)和侵袭(50.05±4.22比88.57±7.96)细胞数显著减少(P<0.05)。与抑制circPDSS1比较,同时抑制miR-1298和circPDSS1后MHCC97H细胞凋亡率(11.68±1.24比23.31±2.84)显著减低,迁移(86.59±7.44比54.59±4.78)和侵袭(76.01±6.33比39.91±3.73)细胞数显著增加(P<0.05)。结论抑制circPDSS1表达能够降低肝癌细胞的迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,其机制与靶向调控miR-1298有关。

辽宁绒山羊皮肤毛囊miR-1298-5p靶基因预测及验证

以辽宁绒山羊不同发育时期皮肤毛囊组织为材料,用生物信息学方法预测miR-1298-5p的靶基因,采用RTPCR对miR-1298-5p与其潜在靶基因TGF-βR1进行核酸水平表达检测,利用Weston blot对潜在靶基因TGF-βR1进行蛋白水平表达检测。生物信息学预测结果表明TGF-βR1的3′UTR存在miR-1298-5p种子区结合位点;miR-1298-5p在皮肤毛囊不同发育时期呈现差异性表达;TGF-βR1在皮肤毛囊不同发育时期无论在核酸水平还是蛋白水平均呈现差异性表达;miR-1298-5p与其潜在靶基因之间呈现一种负调控趋势,说明miR-1298-5p可能通过负调控TGF-βR1,从而对毛囊周期性发育起到调节作用。结合靶基因预测结果、miR-1298-5p在核酸水平表达规律及TGFβR1在核酸水平表达规律和蛋白水平表达规律初步确定TGF-βR1为miR-1298-5p的靶基因。本实验旨在探讨辽宁绒山羊皮肤毛囊不同发育时期miR-1298-5p与其靶基因的调控作用及其与靶基因的潜在关系,为miR-1298-5p与其靶基因对皮肤毛囊发育作用提供理论研究数据。

脑梗死患者血清中异常表达的microRNA-1298及其临床诊断价值分析

目的:急性脑梗死(acute cerebral infarction, ACI)是一种高发病率、高致残率的脑部疾病。本研究的目的是探讨miR-1298在ACI患者中的临床价值。方法:使用qRT-PCR测定对照组和ACI组的miR-1298的相对表达水平。MiR-1298的临床预测价值通过绘制受试者工作特征(receiver operating charac-teristic, ROC)曲线进行评估。临床指标和ACI患者临床预后的相关性通过Logistic回归分析进行评价。MiR-1298的靶基因通过双荧光素酶报告实验进行验证。结果:MiR-1298在ACI患者中表达降低,随着病情的严重和梗死面积的增大,其表达水平进一步降低。MiR-1298可能成为ACI的诊断因子之一。MiR-1298在ACI预后不良组的表达量降低,并且可以独立预测ACI的不良预后。SETD7是miR-1298的靶基因,在ACI患者中表达量增加。结论:低表达的miR-1298可以作为ACI的诊断因子,并且可以预测ACI不良结局。

miR-1298表达对PC-12细胞糖氧剥夺/复氧损伤的影响及其机制研究

目的:通过体外细胞培养探讨mi R-1298对缺血缺氧性神经损伤的调节作用。方法:首先通过细胞活性检测和乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性法确定大鼠PC-12细胞糖氧剥夺/复氧(OGD/R)的造模效果,同时采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞mi R-1298的表达差异。体外转染mi R-1298mimic、mimic NC、mi R-1298 inhibitor和inhibitor NC至大鼠PC-12细胞系,检测mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC的转染效率。经过OGD/R处理后将细胞分为Control组、OGD/R组、mimic组、mimicNC组、inhibitor组和inhibitorNC组。流式细胞术检测各组PC-12细胞凋亡的情况,免疫印迹试验(Western blot)检测各组PC-12细胞凋亡相关蛋白B淋巴细胞瘤-2基因(BCL-2)和Bcl-2相关的x基因(Bax)表达的情况。结果:PC12细胞经过OGD/R处理后,其细胞存活率与Control组比明显下降且LDH漏出率明显上升(均P<0.05);模型细胞中mi R-1298相对表达量明显低于Control组(P<0.05)。转染24小时后mimic组细胞中mi R-1298的相对表达量明显高于mimicNC组(P<0.05);mimic组细胞凋亡率低于mimicNC组,而inhibitor组细胞凋亡率高于inhibitor NC组(均P<0.05);mimic组的BCL-2表达量较mimicNC组升高,而BAX表达量下降,inhibitor组与inhibitorNC组相比,BCL-2表达量下降,而BAX表达量上升,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论:mi R-1298通过抑制细胞凋亡减轻PC-12细胞OGD/R的损伤。

内蒙古绒山羊miRNA-1298-5p与TGF-βR1基因在绒毛生长周期中的表达规律研究

为探究miRNA-1298-5p与TGF-βR1基因在内蒙古绒山羊绒毛生长周期中的差异表达对绒毛生长的影响,选取内蒙古优质品种阿尔巴斯白绒山羊绒毛生长的休止期、生长初期、生长旺盛期及退行期的体侧皮肤,提取总RNA,经DL2000紫外光度计和琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度后,选取S-18S基因为内参,利用Primer 5设计相应的引物序列,通过实时荧光定量的方法对非编码miR-1298-5p与其潜在靶向基因TGF-βR1在绒毛不同生长时期皮肤的表达进行检测并通过△△Ct值法计算。结果表明:miR-1298-5p及TGF-βR1基因在阿尔巴斯白绒山羊皮肤4个不同发育时期均有表达;miR-1298-5p、TGF-βR1基因由绒毛生长初期到旺盛期表达量均增高,miR-1298-5p由旺盛期到退行期表达量增高,退行期到休止期降低;TGF-βR1基因由旺盛期到退行期表达量降低,退行期到休止期增高,二者表达量呈相反趋势,推测miR-1298-5p可能通过负向调控TGF-βR1基因在皮肤不同发育时期的表达,从而调控内蒙古绒山羊绒毛的生长。