基于miR-135a/FOXO1/PINK1通路探讨柔肝化纤颗粒调控线粒体自噬抑制肝星状细胞活化的机制

目的基于miR-135a/FOXO1/PINK1通路探讨柔肝化纤颗粒通过调控线粒体自噬来抑制肝星状细胞活化与增殖的影响及其机制。方法HSC-T6分为空白组、H_(2)O_(2)组、miR-135a-NC组、miR-135a-mimic组、miR-135a-in-hibitor-NC+H 2 O2组、miR-135a-inhibitor+H_(2)O_(2)组、柔肝化纤颗粒含药血清对照组、H_(2)O_(2)+含药血清对照组、H_(2)O_(2)+含药血清组、H_(2)O_(2)+含药血清+miR-135a-NC组及H_(2)O_(2)+含药血清+miR-135a-mimic组。分别采用Real-time PCR、Western Blot、ELISA及流式细胞术检测miR-135a、FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、Smad2、p-Smad2、转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)、NF-κB p65、p-NF-κB p65、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TNF-α表达及线粒体膜电位、活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成。结果给予H_(2)O_(2)及过表达miR-135a可显著上调HSC-T6 miR-135a、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、p-Smad2、TGF-β1、p-NF-κB p65、TNF-α表达及ROS生成(P<0.01);下调FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ表达与线粒体膜电位(P<0.01)。给予柔肝化纤颗粒及抑制miR-135a表达可显著下调HSC-T6 miR-135a、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、p-Smad2、TGF-β1、p-NF-κB p65、TNF-α表达及ROS生成(P<0.01);上调FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ表达与线粒体膜电位(P<0.01)。给予柔肝化纤颗粒同时过表达miR-135a可抑制柔肝化纤颗粒对HSC-T6的影响(P<0.01)。结论线粒体自噬可抑制HSC-T6活化,其机制与线粒体自噬抑制ROS生成,进而抑制TGF-β1/Smad2通路及炎症反应有关;柔肝化纤颗粒亦可抑制HSC-T6活化,其机制与柔肝化纤颗粒抑制miR-135a表达,活化FOXO1/PINK1通路,从而促进线粒体自噬有关。

miR-150-5p、miR-135b在糖尿病肾病患者中的表达及意义

目的探讨外周血miR-150-5p、miR-135b水平与糖尿病肾病(DN)患者尿白蛋白排泄率(UAER)、预后的关系。方法采用前瞻性研究方法,选取2019年1月至2021年10月延安大学附属医院收治的85例DN患者作为DN组[男46例,女39例,年龄(46.28±4.41)岁,2型糖尿病(T2DM)病程(7.24±2.31)年],另纳入76例单纯T2DM患者作为T2DM组[男40例,女36例,年龄(44.95±6.13)岁,T2DM病程(6.98±3.28)年],80例健康体检者作为对照组[男43例,女37例,年龄(45.74±5.68)岁]。收集3组患者临床资料及外周血miR-150-5p、miR-135b水平,Spearman分析各指标与UAER相关性,绘制受试者操作特征曲线(ROC)及曲线下面积(AUC),分析各指标预后的预测效能,采用相对危险度(RR)及95%置信区间(CI)分析各指标对预后的影响。结果DN组外周血miR-150-5p、miR-135b水平>T2DM组>对照组[(3.36±0.68)比(1.03±0.62)比(0.78±0.21)、(3.96±0.51)比(1.24±0.48)比(0.66±0.12)],差异均有统计学意义(F=560.11、1519.26,均P<0.05);DN组UAER>300 mg/24 h患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平>UAER 30~300 mg/24 h患者>UAER<30 mg/24 h患者[(4.10±0.92)比(3.42±0.64)比(2.73±0.51)、(5.40±0.87)比(3.87±0.61)比(3.02±0.49)],差异均有统计学意义(F=23.53、78.25,均P<0.05);DN患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平与UREA呈正相关(r=0.783、0.835,均P<0.05);随访12个月,15例发生终末期肾病(ESRD),发生ESRD患者外周血miR-150-5p、miR-135b水平均高于未发生ESRD患者[(4.41±0.55)比(3.14±0.38)、(4.67±0.61)比(3.81±0.42)],差异均有统计学意义(t=10.67、6.53,均P<0.05);外周血miR-150-5p、miR-135b、联合预测DN并发ESRD的AUC分别为0.733、0.829、0.944。外周血miR-150-5p、miR-135b高水平患者并发ESRD的RR分别为低水平的3.619倍、10.889倍,其95%CI分别为1.105~11.856、1.503~78.872。结论外周血miR-150-5p、miR-135b水平与DN患者UAER呈正相关,联合检测可作为预测DN并发ESRD的重要辅助手段,为临床诊治提供可靠数据支持。

miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达及其与临床病理特征、预后的关系。方法选取2018年1月至2021年12月于中国人民解放军联勤保障部队第九一〇医院行改良根治术的68例乳腺癌患者作为研究对象,收集乳腺癌组织及癌旁正常组织石蜡标本。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测miR-135b-5p的表达水平,以乳腺癌组织miR-135b-5p表达量的平均值作为参考,将患者分为低表达组与高表达组,分析miR-135b-5p表达水平与患者临床病理特征的关系;使用Kaplan-MeierPlotter分析miR-135b-5p表达对不同分子亚型乳腺癌患者预后的影响。结果乳腺癌组织miR-135b-5p的表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。高表达组肿瘤直径>2cm、淋巴结转移阳性、分型为三阴性、ER表达阴性、PR表达阴性的患者占比高于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);两组年龄、发病部位、组织学分级、HER2表达情况比较差异无统计学意义。Kaplan-MeierPlotter在线生存分析结果显示,在ER阳性的管腔型乳腺癌患者中,miR-135b-5p低表达组总生存率低于高表达组,在三阴性乳腺癌患者中,miR-135b-5p高表达组总生存率低于低表达组,差异有统计学意义(P<0.05);在HER2过表达型乳腺癌患者中,低表达组和高表达组总生存率比较差异无统计学意义。结论miR-135b-5p在乳腺癌组织中的表达水平在三阴性和管腔型乳腺癌中存在显著差异,可通过发挥不同的作用参与肿瘤的进展过程,在乳腺癌的预后判断和靶向治疗方面可能具有潜在的应用价值。

柔肝化纤颗粒依赖miR-135a/FOXO1通路调控线粒体自噬抑制大鼠肝纤维化进程

目的探讨柔肝化纤颗粒对肝纤维化的影响及机制。方法SD大鼠分为正常组、模型组、生理盐水对照组、柔肝化纤颗粒低、中、高剂量组、柔肝化纤颗粒中剂量+3-MA组。腹腔注射CCl4制备肝纤维化模型,分别灌胃柔肝化纤颗粒低、中、高剂量(2.5 g·kg^(-1)、5 g·kg^(-1)、10 g·kg^(-1))和3-MA(15 mg·kg^(-1))。采用Real-time PCR、Western Blot、及ELISA检测大鼠肝组织miR-135a、FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ、Smad2、pSmad2、TGF-β1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、TNF-α表达及ROS含量。结果模型组miR-135a、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、p-Smad2、TGF-β1、p-NF-κB p65、TNF-α表达及ROS含量显著上调(P<0.05);FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ表达显著下调(P<0.05)。柔肝化纤颗粒低剂量组可明显抑制miR-135a、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、p-Smad2、TGF-β1、p-NF-κB p65、TNF-α表达及ROS生成;上调FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ表达(P<0.05)。柔肝化纤颗粒中、高剂量组可显著抑制miR-135a、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、p-Smad2、TGF-β1、p-NF-κB p65、TNF-α表达及ROS生成;上调FOXO1、PINK1、Parkin、LC3Ⅱ表达(P<0.05)。柔肝化纤颗粒中剂量组药效明显强于低剂量组(P<0.05),中、高剂量组药效无明显差异。线粒体自噬抑制剂(3-MA)可明显抑制柔肝化纤颗粒药效(P<0.05)。结论柔肝化纤颗粒可抑制肝纤维化,其机制与柔肝化纤颗粒抑制miR-135a表达,激活FOXO1/PINK1通路,进而促进线粒体自噬,抑制氧化应激反应,抑制TGF-β1/Smad2活化有关。

miR-135a-5p通过调控CXCL12表达降低吗啡耐受

目的研究miR-135a-5p调控CXCL12对C57BL/6J小鼠吗啡耐受的影响。方法将64只小鼠随机分为:对照(NS)组、吗啡耐受(MT)组、CXCL12沉默(CXCL12-siRNA)组、沉默阴性对照(NC-siRNA)组、miR-135a-5p激动剂(miR-agomir)组、激动剂阴性对照(miR-NC)组、miR-135a-5p激动剂+CXCL12过表达(miR-agomir+LV-CXCL12)组、miR-135a-5p激动剂+过表达阴性对照(miR-agomir+LV-control)组。通过皮下注射给药建立吗啡镇痛耐受模型,采用温水甩尾法测定各组小鼠给药前和给药后的热甩尾时间(TL);造模结束后麻醉处死小鼠并取L4~L5脊髓组织,RT-qPCR检测miR-135a-5p及CXCL12 mRNA的表达,Western blot检测CXCL12蛋白的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-135a-5p、CXCL12的靶向关系。结果1)成功建立吗啡耐受小鼠模型,与NS组相比,MT组CXCL12 mRNA及蛋白表达显著升高(P<0.05),miR-135a-5p显著下调(P<0.05)。2)沉默Cxcl12及过表达miR-135a-5p均提高吗啡耐受小鼠热痛阈值,显著减缓吗啡耐受的发生发展(P<0.05)。3)与miR-NC相比,miR-agomir组CXCL12 mRNA及蛋白表达均下降(P<0.05)。4)双荧光素酶报告基因实验显示miR-135a-5p靶向作用于Cxcl12。5)过表达CXCL12可逆转miR-135a-5p对吗啡耐受小鼠的热痛保护作用。结论miR-135a-5p通过靶向抑制CXCL12表达进而缓解吗啡耐受的形成。

姜黄素通过降低miR-135b-5p和FEN1表达增强卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性

目的:探究姜黄素对卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性的影响及其潜在机制。方法:(1)体外常规培养卵巢癌亲本细胞OVCAR-3并构建顺铂耐药OVCAR-3/DDP细胞,将OVCAR-3细胞分为Control(常规培养)、DDP-1(1μmol/L顺铂)、DDP-5(5μmol/L顺铂)、DDP-10(10μmol/L顺铂)、DDP-15(15μmol/L顺铂)、DDP-20(20μmol/L顺铂)、DDP-30(30μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-1(20μmol/L姜黄素+1μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-5(20μmol/L姜黄素+5μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-10(20μmol/L姜黄素+10μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-15(20μmol/L姜黄素+15μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-20(20μmol/L姜黄素+20μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-30组(20μmol/L姜黄素+30μmol/L顺铂);将OVCAR-3/DDP细胞分为Control(常规处理)、DDP-10(10μmol/L顺铂)、DDP-20(20μmol/L顺铂)、DDP-30(30μmol/L顺铂)、DDP-40(40μmol/L顺铂)、DDP-50(50μmol/L顺铂)、DDP-60(60μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-10(20μmol/L姜黄素+10μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-20(20μmol/L姜黄素+20μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-30(20μmol/L姜黄素+30μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-40(20μmol/L姜黄素+40μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-50(20μmol/L姜黄素+50μmol/L顺铂)、姜黄素+DDP-60组(20μmol/L姜黄素+60μmol/L顺铂),CCK-8法检测细胞活性,计算顺铂半数抑制浓度(IC 50),筛选顺铂和姜黄素的合适作用浓度。(2)将OVCAR-3细胞分为对照组(常规处理)、DDP组(20.5μg/mL顺铂)、姜黄素组(20μmol/L姜黄素)、姜黄素+DDP组(20μmol/L姜黄素+20.5μg/mL顺铂);将OVCAR-3/DDP细胞分为对照组(常规处理)、DDP组(42.1μg/mL顺铂)、姜黄素组(20μmol/L姜黄素)、姜黄素+DDP组(20μmol/L姜黄素+42.1μg/mL顺铂),采用流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量(qRT)-PCR检测miR-135b-5p表达,qRT-PCR和免疫印迹法分别检测瓣状核酸内切酶-1(flap endonuclease 1,FEN1)mRNA和蛋白表达。结果:相同顺铂浓度时,与DDP组比较,姜黄素+DDP联合组OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞活性明显降低(P均<0.001)。DDP作用于OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞的IC 50分别为20.5μg/mL和42.1μg/mL。与OVCAR组或OVCAR/DDP组相较,姜黄素或顺铂致OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞凋亡率明显增加(P均<0.001),两者联合作用时效果更显著。此外,姜黄素或顺铂处理可明显降低OVCAR-3和OVCAR-3/DDP细胞中miR-135b-5p表达及FEN1表达(P<0.01或<0.001),两者联合时效果更显著。结论:姜黄素可增强卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂敏感性,其可能与降低miR-135b-5p和FEN1表达相关。

急性心肌梗死病人PCI术后血清miR-135b-3p、miR-375-3p相对表达水平及其与主要不良心血管事件发生的关系

目的:分析急性心肌梗死(AMI)病人行经皮冠状动脉介入(PCI)术后血清miR-135b-3p、miR-375-3p相对表达水平及其与主要不良心血管事件(MACE)发生的关系。方法:选取2018年1月—2021年1月我院收治的150例因患AMI进行PCI术的病人,同时选取同期100名健康体检者为对照组。采用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测血清miR-135b-3p、miR-375-3p表达水平;采用Pearson法分析血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平及其与临床资料的相关性;受试者工作特征(ROC)曲线评价血清miR-135b-3p、miR-375-3p对AMI病人PCI后发生MACE的预测价值。结果:相较于对照组,试验组血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平显著升高(P<0.05)。与非MACE组相比,MACE组C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、miR-135b-3p、miR-375-3p水平显著上升(P<0.05)。AMI病人血清miR-135b-3p与miR-375-3p、CRP、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(P<0.05);血清miR-375-3p与CRP、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平呈正相关(P<0.05)。ROC结果显示,血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平及二者联合预测AMI病人PCI术后发生MACE的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.78,0.756,0.869,其中联合预测AUC显著高于二者单独预测(P<0.05)。结论:AMI病人血清miR-135b-3p、miR-375-3p水平升高,且PCI术后发生MACE病人miR-135b-3p、miR-375-3p水平高于非MACE病人,可能成为AMI病人PCI术后发生MACE的预测因子。

血清miR-135b、LZST1表达水平与晚期非小细胞肺癌患者预后的相关性

目的探究晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清微小RNA-135b(miR-135b)、亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(LZST1)表达水平及与其预后的相关性。方法收集62例晚期NSCLC患者作为观察组。另外收集同时期94例良性肺部病变患者作为对照组。比较观察组与对照组血清miR-135b、LZST1表达水平差异,比较不同预后患者血清miR-135b、LZST1表达水平差异,分析晚期NSCLC患者血清miR-135b、LZST1表达水平与其预后的关系,miR-135b、LZST1对晚期NSCLC患者预后不良的预测价值。结果两组性别、年龄、体质量指数比较差异不显著,P>0.05。观察组血清miR-135b表达水平高于对照组,LZST1低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。死亡患者血清miR-135b表达水平高于存活患者,LZST1水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-135b与晚期NSCLC患者死亡呈显著正相关关系,LZST1与晚期NSCLC患者死亡呈负相关关系,miR-135b与LZST1表达呈负相关关系,P<0.05。计算约登指数,获取最大约登指数相对应的临界值。4.065为miR-135b预测晚期NSCLC患者死亡的阈值,灵敏度84.00%,特异度81.10%,0.670为LZST1预测晚期NSCLC患者死亡的阈值,灵敏度68.00%,特异度78.40%。miR-135b、LZST1以及两者联合的AUC面积分别为0.792、0.742以及0.850,两者联合的AUC面积最大,灵敏度为88.00%,特异度为70.30%,预测效能较好。结论晚期NSCLC患者血清miR-135b表达水平异常升高,LZST1显著降低,miR-135b高表达、LZST1低表达与患者预后不良相关,miR-135b与LZST1呈负相关关系。miR-135b联合LZST1对晚期NSCLC患者死亡的预测效能较高。

白山毛桃根提取物联合miR-135a-5p抑制宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭及迁移的机制

目的 探讨白山毛桃根提取物对宫颈癌细胞HeLa增殖、侵袭及迁移的影响及分子机制。方法 不同浓度的白山毛桃根提取物处理HeLa细胞,将miR-NC、miR-135a-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-135a-5p分别转染至HeLa细胞,将anti-miR-NC、anti-miR-135a-5p分别转染至HeLa细胞后用40 mg/ml白山毛桃根提取物处理细胞;噻唑蓝(MTT)法、克隆形成实验、Transwell实验分别检测细胞增殖、侵袭及迁移;qRT-聚合酶链反应(PCR)法检测miR-135a-5p的表达量;Western印迹法检测基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、p-磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和p-蛋白激酶B(Akt)蛋白表达量。结果 白山毛桃根提取物可显著降低细胞活力、克隆数、侵袭和迁移细胞数、miR-135a-5p表达和MMP2、MMP9、p-PI3K、p-Akt蛋白水平(P<0.05);转染anti-miR-135a-5p可降低细胞活力、克隆数、侵袭和迁移细胞数、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-Akt蛋白水平(P<0.05),而转染miR-135a-5p mimics的作用与之相反;转染anti-miR-135a-5p可增强白山毛桃根提取物对HeLa细胞增殖、迁移、侵袭及PI3K/Akt信号通路的抑制作用。结论 白山毛桃根提取物可通过降低miR-135a-5p表达使PI3K/Akt通路失活,进而抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭及迁移。

参麦地黄汤联合缬沙坦对糖尿病肾病患者氧化应激、血管内皮功能及血清miR-133b、miR-135b的影响

目的探究参麦地黄汤联合缬沙坦对糖尿病肾病患者氧化应激、血管内皮功能及血清miR-133b、miR-135b的影响。方法选取2017年1月至2020年10月于江阴市中医院门诊就诊的90例糖尿病肾病患者为研究对象,依据随机数字表法将其分为对照组、观察组各45例。对照组采用缬沙坦分散片口服治疗,观察组在对照组治疗基础上加服参麦地黄汤。2组疗程均为3个月,治疗前后评估2组患者中医证候积分变化,检测2组患者空腹血糖(FPG)和血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、氧化应激指标[超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)]、血管内皮功能指标[可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)及内皮素-1(ET-1)]及miR-133b、miR-135b变化。结果治疗后,2组患者中医症候积分、FPG、SCr、BUN、UACR及MDA、sICAM-1、ET-1、miR-133b、miR-135b表达水平均显著下降,SOD活性明显升高(P<0.01),观察组优于对照组(P<0.01)。观察组治疗总有效率高于对照组(P<0.01)。结论参麦地黄汤联合缬沙坦可有效改善糖尿病肾病临床症状,可能与其调控机体氧化应激、血管内皮功能、血清miR-133b、miR-135b水平有关。

男性不育患者精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p水平检测的价值

目的探讨精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p表达特征及其在男性不育患者精浆中变化和价值。方法选取2019年1月至2021年12月于江苏省中医院检验科留存的血清、晨尿、胸水、脑脊液和精浆标本各30例;进一步选取2010年至2019年江苏省中医院和南京大学医学院附属金陵医院冻存的非梗阻性无精子症患者精浆标本、弱精子症患者精浆标本及正常对照精浆标本各54例。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测不同体液、不育患者精浆和正常对照精浆中miR-135a-5p和miR-135b-5p表达。ROC曲线分析精浆miR-135a-5p、miR-135b-5p水平区分男性不育患者及对照的ROC曲线下面积(AUC^(ROC));相关性分析精浆miR-135a-5p、miR-135b-5p水平与精液参数的相关性。结果5种不同体液间miR-135a-5p和miR-135b-5p水平差异具有统计学意义(H=64.88,P<0.01和H=64.7,P<0.01),二者在血清和精浆中水平均最高,在尿液中水平均最低。无精子症组、弱精子症组及正常对照组精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p水平差异具有统计学意义(H=32.14,P<0.01;H=21.37,P<0.01)。与正常对照组相比,无精子症组2种miRNA水平均显著降低(U=687,P<0.01;U=843,P<0.01);弱精子症组与正常对照组差异无统计学意义(P均>0.05);无精子症组与弱精子症组精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p水平具有显著差异(U=635,P<0.01;U=779,P<0.01)。精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p区分无精子症与正常对照及弱精子症患者AUCROC分别为0.764(95%CI:0.675~0.854),0.711(95%CI:0.612~0.810)和0.782(95%CI:0.695~0.869),0.733(95%CI:0.637~0.829)。相关性分析结果显示,精浆miR-135a-5p和miR-135b-5p水平与精子浓度、精子活动率、前向运动精子百分率和非前向运动精子百分率均呈正相关(P均<0.01)。结论miR-135a-5p和miR-135b-5p为精浆高表达miRNA,在无精子症患者中显著降低,二者与男性不育发生关系密切。

miR-135a-5p对氟他胺致隐睾小鼠胰岛素样因子3及睾酮表达的影响

目的探讨miR-135a-5p对氟他胺导致的隐睾症小鼠睾丸组织中胰岛素样因子3(INSL3)和睾酮表达水平的影响。方法构建氟他胺致隐睾小鼠模型,将实验分为正常对照组、氟他胺组、氟他胺+miR-135a-5p敲降组及氟他胺+miR-135a-5p过表达组。用RT-qPCR法检测小鼠睾丸组织中miR-135a-5p和INSL3 mRNA的表达水平;用Western blot检测INSL3蛋白的表达水平;用ELISA法检测睾酮的表达水平。结果氟他胺致隐睾小鼠睾丸组织中miR-135a-5p、INSL3 mRNA和蛋白以及睾酮的表达水平均显著下调(P<0.05)。敲降miR-135a-5p可下调隐睾睾丸组织中INSL3 mRNA和蛋白以及睾酮的表达水平(P<0.01),而过表达miR-135a-5p则具有相反的结果。结论miR-135a-5p在氟他胺致隐睾小鼠睾丸组织中低表达,过表达miR-135a-5p可恢复INSL3和睾酮的表达水平。

miR-135a和miR-135b表达水平在子宫内膜癌预后评估中的价值

目的分析血清miR-135a和miR-135b表达水平预测子宫内膜癌预后的价值。方法选择2018年1月至2019年12月在该院接受子宫内膜癌手术的115例子宫内膜癌患者为子宫内膜癌组。选择同期该院45例体检健康女性为对照组。比较子宫内膜癌组与对照组、子宫内膜癌患者治疗前后、不同特征和不同预后情况子宫内膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表达水平,分析血清miR-135a和miR-135b表达水平预测两年内子宫内膜癌患者出现预后不良的价值。结果入院时,子宫内膜癌组血清miR-135a表达水平明显低于对照组,血清miR-135b表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜癌组术后7 d血清miR-135a表达水平较入院时明显升高,miR-135b表达水平较入院时明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。低分化、Ⅲ~Ⅳ期和有淋巴结转移的子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于中高分化、Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05);而低分化、Ⅲ~Ⅳ期和有淋巴结转移的子宫内膜癌患者血清miR-135b表达水平明显高于中高分化、Ⅰ~Ⅱ期和无淋巴结转移的子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。预后不良子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平明显低于预后良好子宫内膜癌患者,而预后不良子宫内膜癌患者血清miR-135b表达水平明显高于预后良好子宫内膜癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。血清miR-135a和miR-135b联合检测预测子宫内膜癌预后不良的灵敏度为92.3%,特异度为83.1%,曲线下面积(AUC)为0.932,AUC明显大于miR-135a和miR-135b单独检测(P<0.05)。子宫内膜癌患者血清miR-135a表达水平与miR-135b表达水平呈负相关(r=-0.721,P<0.01)。结论miR-135a和miR-135b是子宫内膜癌预后的潜在预测指标。

circ_LARP4调控miR-135a-5p/PCDH9抑制膀胱癌细胞T24生物学行为

目的探讨circ_核糖核蛋白(LARP)4对膀胱癌细胞T24增殖、迁移和凋亡的影响及分子机制。方法选取膀胱癌患者的癌组织及癌旁组织,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测circ_LARP4和miR-135a-5p的表达水平;Western印迹法检测原钙黏蛋白(PCDH)9蛋白表达;将T24细胞随机分为pcDNA-circ_LARP4组、pcDNA组、anti-miR-135a-5p组、anti-miR-NC组、pcDNA-circ_LARP4+miR-135a-5p组;用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率;克隆形成实验检测集落形成数;细胞移动范围采用划痕实验进行检测;采用流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测circ_LARP4、miR-135a-5p、PCDH9之间的靶向关系。结果与癌旁组织相比,膀胱癌组织中circ_LARP4和PCDH9蛋白的表达水平显著降低,miR-135a-5p表达水平显著升高(P<0.05)。过表达circ_LARP4或抑制miR-135a-5p表达,PCDH9蛋白表达水平升高,miR-135a-5p表达水平降低,T24增殖抑制率升高,集落形成数减少,迁移距离缩短,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达miR-135a-5p可逆转circ_LARP4对T24细胞增殖、迁移的抑制和凋亡的诱导作用。circ_LARP4靶向miR-135a-5p,miR-135a-5p靶向PCDH9。结论circ_LARP4通过调控miR-135a-5p/PCDH9轴抑制膀胱癌细胞T24的增殖、迁移,诱导细胞凋亡。

虫草素通过调控miR-135b-5p表达抑制宫颈癌Hela细胞侵袭、转移的实验研究

目的研究虫草素通过调控miR-135b-5p表达对宫颈癌Hela细胞侵袭、转移的影响及其调控机制。方法用浓度为50μmol/L(虫草素Ⅰ组)和100μmol/L(虫草素Ⅱ组)的虫草素处理宫颈癌Hela细胞,另设空白对照组,用MTT法测定Hela细胞的生长情况。采用Transwell法测定Hela细胞侵袭情况,采用划痕实验检测宫颈癌Hela细胞的转移能力,采用Real-time PCR法测定人永生化表皮细胞Hacat和宫颈癌Hela细胞中miR-135-5p的表达水平及不同浓度虫草素处理后对miR-135-5p的表达水平的影响。转染miR-135b-5p mimic至宫颈癌Hela细胞,并采用Transwell技术和划痕实验检测宫颈癌Hela细胞的侵袭能力和转移能力。结果加入虫草素后宫颈癌Hela细胞生长受到显著的抑制,且高浓度的虫草素抑制作用更明显(P<0.05)。宫颈癌Hela细胞中miR-135b-5p的表达水平为(1.97±0.07),显著高于人永生化表皮细胞Hacat细胞中miR-135b-5p的表达水平(1.01±0.03),组间比较差异具有统计学意义(t=28.187,P=0.000)。加入虫草素后,宫颈癌Hela细胞侵袭率和转移率及miR-135b-5p表达明显降低;且高浓度虫草素处理后,宫颈癌Hela细胞侵袭率和转移率更低,组间比较差异均具有统计学意义(t=138.614~317.100,P<0.05)。过表达miR-135b-5p显著增加宫颈癌Hela细胞的侵袭率和转移率(t=7.145,t=7.465,P<0.05),且Vimentin表达增加、E-cad表达降低(t=8.223,t=7.473,P<0.05)。结论虫草素可通过抑制miR-135b-5p表达进而抑制Hela细胞的侵袭和转移。

miR-135b靶向SIRT1表达对H_(2)O_(2)诱导神经细胞损伤增殖、凋亡的影响及作用机制

目的探讨miR-135b靶向沉默信息调节因子1(SIRT1)表达对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导神经细胞损伤增殖和凋亡的影响及作用机制。方法将HT22细胞分为对照组(正常培养的HT22细胞)、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)抑制剂阴性对照组、H_(2)O_(2)+miR-135b抑制剂组(转染miR-135b抑制剂)、H_(2)O_(2)+SIRT1过表达组(转染SIRT1过表达载体)、H_(2)O_(2)+空载体对照组(转染空载体)、H_(2)O_(2)+miR-135b抑制剂阴性对照组(转染miR-135b抑制剂阴性对照组)、H_(2)O_(2)+miR-135b抑制剂+SIRT1抑制剂组(转染miR-135b抑制剂和SIRT1抑制剂),各组均在转染后经200μmol/L的H_(2)O_(2)作用24 h。采用Western Blot检测miR-135b、SIRT1信使RNA(mRNA)、SIRT1蛋白表达水平,MTT、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-135b与SIRT1之间的调控关系。结果与H_(2)O_(2)抑制剂阴性对照组相比,H_(2)O_(2)+miR-135b抑制组miR-135b水平显著降低(0.41±0.05比2.33±0.16)(P<0.05),存活率显著升高[(74.1±5.6)%比(48.3±4.1)%](P<0.05),凋亡率显著降低[(15.4±1.3)%比(33.4±2.6)%](P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,SIRT1野生型质粒(SIRT1-WT)+mimic-阴性对照组、SIRT1-WT+mimic组、SIRT1突变型质粒(SIRT1-MUT)+mimic-阴性对照组、SIRT1-MUT+mimic组双荧光素酶活性分别为1.15±0.09、0.56±0.03、1.08±0.08、1.12±0.10,各组荧光素酶活性比较差异有统计学意义(P<0.01),其中SIRT1-WT+mimic组荧光素酶活性显著低于SIRT1-WT+mimic-阴性对照组(P<0.05)。miR-135b inhibitor组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白水平高于inhibitor-control组(P<0.05),miR-135b mimic组SIRT1 mRNA、SIRT1蛋白水平低于mimic-control组(P<0.05)。与H_(2)O_(2)+空载体对照组相比,H_(2)O_(2)+SIRT1过表达组SIRT1 mRNA和蛋白水平显著升高(1.15±0.06比0.54±0.03、1.13±0.11比0.57±0.04)(P<0.05),存活率显著升高[(75.3±5.5)%比(45.4±3.4)%](P<0.05),凋亡率显著降低[(15.5±1.2)%比(39.4±2.8)%](P<0.05)。与H_(2)O_(2)+miR-135b抑制剂阴性对照组相比,H_(2)O_(2)+miR-135b抑制剂+SIRT1抑制剂组SIRT1蛋白水平显著降低(0.61±0.04比1.12±0.07)(P<0.05),存活率显著降低[(48.3±4.4)%比(69.2±5.4)%](P<0.05),凋亡率显著升高[(36.2±3.6)%比(13.4±1.0)%](P<0.05)。结论抑制miR-135b表达可促进H_(2)O_(2)诱导的HT22细胞增殖,抑制其凋亡,其机制可能是通过负调控SIRT1表达发挥作用。

miR-135a/b逆转肺癌A549/CDDP细胞对顺铂耐药性及相关机制研究

目的:研究miR-135a/b对肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP顺铂耐药的影响。方法:运用实时荧光定量PCR检测miR-135a/b在A549和A549/CDDP细胞株中的差异表达;MTT法检测转染后A549及A549/CDDP细胞对CDDP的敏感性;构建MCL1-3′-UTR荧光素酶报告质粒验证miR-135a/b的靶基因;Western blot检测转染前后细胞MCL1蛋白的表达差异;流式细胞术检测转染后耐药细胞对顺铂诱导凋亡的影响。结果:miR-135a/b在A549/CDDP细胞中表达量降低;在耐药株中上调miR-135a/b后显著增加细胞对顺铂的敏感性;荧光素酶实验证实MCL1是miR-135a/b的靶基因;抗凋亡蛋白MCL1在A549/CDDP细胞中呈高表达,上调miR-135a/b明显抑制耐药细胞中MCL1蛋白的表达;miR-135a/b显著增加A549/CDDP细胞对顺铂诱导的凋亡。结论:miR-135a/b通过靶向调控MCL1蛋白表达增加NSCLC细胞对顺铂的敏感性和凋亡。

miR-135b促进肝癌细胞侵袭和转移

目的探讨miR-135b对肝癌细胞浸润转移的影响及其分子机制。方法分别在肝癌细胞系中过表达和下调miR-135b,通过Transwell^(TM)实验检测肿瘤细胞迁移和侵袭能力,利用肝癌移植瘤模型检测肝癌细胞的体内增殖能力和成瘤能力;采用Western blot法结合双荧光素酶基因报告系统预测miR-135b的下游靶基因。结果 miR-135b在高侵袭性的MHCC97肝癌细胞系中高表达;过表达miR-135b能够增强HepG2和Bel-7402肝癌细胞的体外侵袭和转移能力,促进肝癌细胞的体内转移能力;通过靶向miR-135b的干扰载体pcDNA-miR-135b-Sponge下调miR-135b的表达,MHCC97肝癌细胞的体外侵袭转移能力及移植瘤的转移能力明显受到抑制;双荧光素酶基因报告系统和Western blot实验结果显示miR-135b能够靶向Hippo信号通路中的关键分子,包括大型肿瘤抑制因子同源蛋白2(LATS2)、含β转导素重复序列蛋白(β-TrCP)、N-myc下游调节基因2(NDR2)和亮氨酸拉链肿瘤抑制基因1(LZTS1)等。结论 miR-135b可能通过靶向Hippo信号通路相关基因促进肝癌细胞的侵袭和转移。

miR-135a通过下调SOX2抑制喉癌Hep-2细胞的恶性生物学行为和增强对奥沙利铂的敏感性

目的:探讨敲降miR-135a对人喉癌上皮Hep-2细胞的恶性生物学行为和奥沙利铂敏感性的影响。方法:收集2018年1月至2018年6月郑州大学附属南阳医院南阳市中心医院行喉癌切除术10例患者的喉癌组织和癌旁组织标本。采用qPCR检测喉癌组织和Hep-2细胞中miR-135a的表达水平。miR-135 inhibitor转染喉癌Hep-2细胞后,采用CCK-8检测Hep-2细胞活性,集落形成实验检测Hep-2细胞集落形成能力,Transwell实验检测Hep-2细胞的侵袭及迁移能力,WB实验检测Hep-2细胞中SOX2蛋白的表达水平。0.5、1.0、1.5、2.0μmol/L的奥沙利铂处理已转染miR-135 inhibitor的Hep-2细胞,CCK-8实验检测Hep-2细胞的增殖活性,Annexin-V-FITC/PI染色流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡率。采用miR-135a inhibitor质粒、对照pcDNA空载体(SOX2-Con)质粒、pcDNA-SOX2(SOX2-OE)质粒共转染Hep-2细胞,构建miR-135a inhibitor+SOX2-Con组和miR-135a inhibitor+SOX2-OE组,检测此2组细胞的增殖活性、集落形成能力、侵袭及迁移能力。结果:与癌旁组织比较,喉癌组织中miR-135a表达水平显著升高(P<0.01);与正常NHP细胞比较,miR-135a在Hep-2细胞中表达水平明显上调(P<0.01);转染miR-135a inhibitor导致Hep-2细胞中miR-135a表达水平明显降低(P<0.01)。敲降miR-135a明显降低Hep-2细胞的增殖活性、细胞集落数、迁移、侵袭和SOX2表达(均P<0.01);明显增强细胞对奥沙利铂敏感性(P<0.01);与miR-135a inhibitor+SOX2-Con组比较,miR-135a inhibitor+SOX2-OE组的Hep-2细胞的增殖活性、细胞集落数、迁移与侵袭能力均明显增加(均P<0.01);同时,用不同浓度的奥沙利铂处理此2组细胞,相对于miR-135a inhibitor+SOX2-Con组,miR-135a inhibitor+SOX2-OE组的Hep-2细胞存活率显著升高(P<0.01)。结论:敲降miR-135a可能通过下调转录因子SOX2的表达抑制Hep-2细胞的恶性生物学行为,并增强其对奥沙利铂的敏感性。

miR-224、miR-135a在非小细胞肺癌中的表达及与临床病理的关系

目的:检测miR-224与miR-135a两种microRNA(miRNA)在非小细胞肺癌中的表达,探讨其与肺癌临床病理的关系。方法:采用Real time RT-PCR法对31例非小细胞肺癌组织及癌旁正常肺组织的miR-224与miR-135a进行定量分析,结果由2(-△△CT)处理,并分析与临床病理资料的关系。结果:相对内参U6,miR-224在非小细胞肺癌组织中表达量为4.2761±0.8731,在正常肺组织中的表达量为0.8967±0.2154,两者相比P<0.05,miR-135a在非小细胞肺癌组织中表达量为0.3551±0.0985,在正常肺组织中的表达量为1.7443±0.3125,两者相比P<0.05。miR-224与miR-135a的表达与非小细胞肺癌的临床分期、病理分级密切相关。结论:miR-224高表达及miR-135a低表达与非小细胞肺癌的临床分期、病理分级密切相关,miR-224有可能作为非小细胞肺癌的重要肿瘤标志物。