如皋黄鸡miR-1458与TBX6靶向关系验证

研究旨在探究miR-1458与TBX6的靶向调控关系。试验基于前期建立视黄酸(Retinoic acid,RA)体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向精原干细胞(SSCs)的分化模型,通过RNA-seq测序结果发现ESCs向SSCs分化过程中差异表达的miR-1458,采用miRNA定量检测miR-1458在ESCs/SSCs中的表达量,miR-1458靶基因富集通路分析筛选出富集通路,分析其与生殖细胞发育的相关性。基于前期联合分析RA诱导ESCs的mRNA-seq数据中|log2(fold change)|>8筛选出的与miR-1458互作的差异性mRNA,依据靶基因预测软件数据库在线预测该基因与miR-1458是否存在结合位点,利用qRT-PCR验证两者的关系,同时利用同源重组法将靶基因的3′UTR及点突变序列插入pMIR-REPORT^(TM)双荧光素酶报告载体中,共转染DF-1细胞,通过双荧光素酶报告载体确定miR-1458与TBX6的靶向调控关系。结果显示:ESCs向SSCs分化过程中差异表达miR-1458,miR-1458在生殖细胞分化过程中发挥重要作用;miR-1458与TBX63′UTR存在结合位点;miR-1458和TBX6分别在ESCs和SSCs中呈现此消彼长的表达趋势;miR-1458能够抑制TBX6的表达;miR-1458可靶向TBX63′UTR区调节TBX6的表达。研究表明miR-1458在鸡的ESCs和SSCs中呈现差异性高表达,并且miR-1458能够直接靶向调控TBX63′UTR区从而调节TBX6的表达,为后续研究miR-1458在SSCs形成过程中的机制探究奠定基础。