变应性鼻炎患者血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与Treg/Th17平衡的关系

目的探讨变应性鼻炎(AR)患者血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞(Th)17平衡的关系。方法选择98例AR患者(AR组)和30例健康体检志愿者(对照组),根据疾病严重程度将AR患者分为轻度组(51例)、中重度组(47例)。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达,采用流式法检测外周血中Treg、Th17及其细胞因子。Pearson相关性分析血清miR-149-5p、Notch1 mRNA表达与外周血中Treg、Th17及其细胞因子以及miR-149-5p与Notch1 mRNA表达的相关性。结果AR组血清miR-149-5p表达,白细胞介素(IL)-10、转化生长因子-β(1 TGF-β1)水平以及外周血Treg细胞、Treg/Th17值低于对照组(P均<0.05),血清Notch1 mRNA表达,IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞高于对照组(P均<0.05)。中重度组血清miR-149-5p表达,IL-10、TGF-β1水平以及外周血Treg细胞、Treg/Th17值低于轻度组(P均<0.05),血清Notch1 mRNA表达,IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞高于轻度组(P均<0.05)。AR组血清miR-149-5p表达与外周血Treg细胞、Treg/Th17值、血清IL-10、TGF-β1水平呈正相关(r分别为0.367、0.539、0.265、0.301,P均<0.05),与血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞呈负相关(r分别为-0.289、-0.213、-0.336、-0.243、-0.221,P均<0.05)。Notch1 mRNA表达与外周血Treg细胞、Treg/Th17值、血清IL-10、TGF-β1水平呈负相关(r分别为-0.346、-0.508、-0.281、-0.293,P均<0.05),与血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23水平以及外周血Th17细胞呈正相关(r分别为0.326、0.241、0.302、0.285、0.237,P均<0.05)。血清miR-149-5p与Notch1 mRNA表达呈负相关(r=-0.550,P<0.05)。结论AR患者血清miR-149-5p表达下调,Notch1 mRNA表达上调,且与AR患者Treg/Th17失衡有关。

miR-149-5p对变应性鼻炎小鼠Notch1表达和Treg/Th17免疫平衡的影响

目的:探讨miR-149-5p对变应性鼻炎(AR)小鼠神经源性位点缺口同系物蛋白1(Notch1)表达和调节性T细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)失衡的影响。方法:12只BALB/c小鼠,3只为正常组,余9只小鼠采用卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝[Al(OH)3]建立AR模型,再随机均分为模型组(仅造模)、miR-149-5p激动剂对照组(鼻内滴注miR-149-5p agomir阴性对照)及miR-149-5p激动剂组(鼻内滴注miR-149-5p agomir);采用行为学评分考察各组各组小鼠过敏症状、苏木精/伊红染色(HE)分析各组小鼠鼻黏膜病理学变化、实时荧光定量PCR(q PCR)检测各组小鼠鼻黏膜组织miR-149-5p,采用酶联免疫吸附法(ELISA)分析各组小鼠血清免疫球蛋白E(Ig E)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平,采用蛋白印迹法检测各组小鼠鼻黏膜组织Notch1、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)及叉头状螺旋转录因子3(Foxp3)蛋白表达;利用miRDB网站预测miR-149-5p与Notch1 3’-UTR结合位点,构建Notch1 3’-UTR区野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶报告载体,转染293T细胞,设置NC+Notch1(MUT)组、miR-149-5p agomir+Notch1(MUT)组、NC+Notch1(WT)组及miR-149-5p agomir+Notch1(WT)组,采用双荧光素酶实验分析并计算荧光素酶相对活性。结果:与模型组比较,miR-149-5p激动剂组小鼠行为学评分明显下降,鼻黏膜炎症反应减轻,上皮结构趋于完整,miR-149-5p的表达显著增加,血清中Ig E、IL-6水平下降,IL-10水平升高,Foxp3蛋白的表达增加,Notch1和RORγt蛋白的表达减少(P <0. 05或P <0. 01);miRDB网站预测miR-149-5p与Notch1 3’-UTR存在互补位点,双荧光素酶实验结果显示,miR-149-5p agomir+Notch1(WT)组的荧光素酶相对活性较NC+Notch1(WT)组降低(P <0. 05)。结论:miR-149-5p可能通过靶向Notch1调节Foxp3和RORγt蛋白表达,影响Treg/Th17细胞平衡,从而改善AR小鼠鼻部过敏症状。

丙氨酰―谷氨酰胺配合高压氧治疗对中青年缺血性脑卒中患者恢复期外周血T淋巴亚群及miR-124、miR-181c的影响

目的探索丙氨酰―谷氨酰胺配合高压氧治疗对中青年缺血性脑卒中患者恢复期外周血T淋巴亚群及微小RNA-124(miR-124)、miR-181c的影响。方法选取2017年7月至2021年7月该院128例中青年缺血性脑卒中恢复期患者作为研究对象,依据随机数字表法分为4组:阴性对照组、对照A组、对照B组、观察组,每组32例。阴性对照组予以脑卒中恢复期常规治疗;在此基础上,对照A组予以丙氨酰―谷氨酰胺治疗;对照B组予以高压氧治疗;观察组予以丙氨酰―谷氨酰胺配合高压氧治疗,均连续治疗4周。比较4组治疗前、治疗2周后、4周后神经功能[美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分]、日常生活能力[Barthel指数(BI)]、肢体运动功能[Fugl-Meyer运动功能评分量表(FMA)评分]、炎症因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素12(IL-12)]、外周血T淋巴亚群(CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、脑血流动力学[颈动脉最小血流速度(Vmin)、最小血流量(Qmin)]、miR-124、miR-181c表达。结果观察组治疗2周后、4周后NIHSS评分低于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05);BI指数高于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05);上、下肢肢体运动功能评分高于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05)。观察组治疗2周后、4周后血清TNF-α、MCP-1、IL-12水平低于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05);CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平高于对照A组、对照B组和阴性对照组;CD8^(+)低于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05)。治疗2周后、4周后对照A组CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)高于对照B组和阴性对照组(P<0.05);CD8^(+)低于对照B组和阴性对照组(P<0.05)。观察组治疗2周后、4周后Vmin、Qmin高于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05),且对照B组Vmin、Qmin高于对照A组和阴性对照组(P<0.05)。观察组治疗2周后、4周后miR-124、miR-181c表达低于对照A组、对照B组和阴性对照组(P<0.05)。结论丙氨酰―谷氨酰胺配合高压氧治疗能进一步改善恢复期中青年缺血性脑卒中患者细胞免疫功能,下调miR-124、miR-181c表达水平,改善患者神经功能及日常生活能力。

CRP cTnT TSLP miR-30c-5p水平与稳定型心绞痛患者冠状动脉病变严重程度关系

目的:探讨C反应蛋白(CRP)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)、miR-30c-5p水平与稳定型心绞痛(SAP)患者冠状动脉病变严重程度的关系。方法:回顾性分析2016年5月至2019年5月间医院收治的经冠状动脉造影(CAG)证实的90例SAP患者的临床资料,根据SYNTAX评分分为轻度组(0~22分,41例)、中度组(23~32分,32例)、重度组(≥33分,17例)。收集三组患者的临床资料,采血检测三组患者的CRP、cTnT、TSLP、miR-30c-5p水平,三组患者的冠状动脉病变严重程度用SYNTAX评分评估,用Pearson相关性分析CRP、cTnT、TSLP、miR-30c-5p水平与SYNTAX评分的关系。结果:三组患者的CRP、cTnT、TSLP、miR-30c-5p水平及SYNTAX评分比较,差异均具有统计学意义(P均<0.05),两两对比LSD-t检验,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。Pearson相关性分析显示,CRP、cTnT、TSLP与SYNTAX评分均呈显著正相关(P<0.01),而miR-30c-5p与SYNTAX评分呈显著负相关(P<0.01)。结论:CRP、cTnT、TSLP、miR-30c-5p水平与稳定型心绞痛患者冠状动脉病变严重程度存在相关性,早期检测以上生物学标志物有助于判断稳定性心绞痛患者的冠状动脉病变严重程度。

广西百色人群miR-210基因rs7935908C/T位点遗传多态性

目的分析miR-210基因rs7935908C/T位点单核苷酸多态性(SNP)在广西百色地区健康人群中的分布特点,并对比其基因型和等位基因频率在不同种族人群间的分布差异。方法收集298例广西百色地区体检健康者的外周血标本,采用SNa Pshot SNP分型技术和DNA测序法检测miR-210基因rs7935908C/T位点多态性。统计该位点的基因型和等位基因的分布频率,并结合国际人类基因组单体型图(HapMap)计划公布的SNP分型数据进行不同种族间的比较分析。结果广西百色地区健康人群中miR-210基因rs7935908C/T位点存在CC、CT和TT 3种基因型,频率分别为10.1%、44.6%、45.3%; C、T等位基因频率分别为32.4%、67.6%。该位点的基因型和等位基因频率在广西百色地区健康人群的不同性别间比较差异均无统计学意义(分别为P=0.185和P=0.590)。其基因型频率与HapMap计划公布的北京汉族人群、日本人群、非洲人群、墨西哥人群及意大利人群分型数据比较,差异均有统计学意义(分别为P<0.001、P=0.025、P<0.001、P<0.001及P=0.009);与欧洲人群和丹佛市华人比较,差异均无统计学意义(分别为P=0.065和P=0.735)。其等位基因频率与欧洲人群、非洲人群、墨西哥人群及意大利人群比较,差异均有统计学意义(分别为P=0.040、P<0.001、P<0.001及P=0.003);与北京汉族人群、丹佛市华人、日本人群比较,差异均无统计学意义分别为(分别为P=0.411、P=0.451及P=0.755)。结论广西百色地区人群miR-210基因rs7935908C/T位点存在遗传多态性,其基因多态性的分布与其他种族、地区人群比较存在不同程度的差异。

miR-202-5p通过下调NFATc3的表达抑制口腔鳞状细胞癌细胞的生长、迁移和侵袭

目的:探讨miR-202-5p对口腔鳞状细胞癌(oral squamous carcinoma,OSCC)细胞生长、集落形成、迁移和侵袭的影响及其可能的机制。方法:通过qPCR法检测OSCC细胞系(Tca8113和SCC-4)和口腔角质细胞HOK中miR-202-5p和T细胞核因子c3(nuclear factor of activated T-cells isoform c3,NFATc3)mRNA的表达水平;将miR-202-5p mimic或/和NFATc3过表达质粒转染入Tca8113和SCC-4细胞,用MTT和集落形成实验检测转染对细胞增殖的影响,划痕伤口愈合实验和Transwell实验检测转染对细胞迁移和侵袭的影响,用Western blotting实验检测转染对NFATc3蛋白表达的影响;通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-202-5p对候选靶基因NFATc3的直接调控作用。结果:与正常口腔角质细胞HOK相比,miR-202-5p在OSCC细胞Tca8113和SCC-4中呈低表达(均P<0.01),NFATc3 m RNA和蛋白质表达显著升高(P<0.01)。在Tca8113细胞和SCC-4细胞中,过表达miR-202-5p可显著抑制细胞生长、集落形成、迁移、侵袭以及细胞中NFATc3表达(均P<0.01)。NFATc3被证实是miR-202-5p的靶基因,过表达NFATc3能逆转miR-202-5p对OSCC细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用。结论:miR-202-5p通过下调NFATc3表达发挥其肿瘤抑制功能,导致OSCC细胞的生长、迁移和侵袭受到抑制。

系统性红斑狼疮女性患者外周血miR-155和C/EBPβ表达及与Tfh和Tfr细胞频率相关性研究

目的探讨系统性红斑狼疮(SLE)女性患者外周血中miR-155及其靶基因C/EBPβ的表达水平与滤泡辅助性T细胞(follicular helper T cell,Tfh)和滤泡调节性T细胞(follicular T regulatory cell,Tfr)频率的相关性。方法选择陆军军医大学第一附属医院收治的29例SLE女性患者,以同期来院体检的20名女性健康人作为对照,利用流式细胞仪检测外周血Tfh和Tfr细胞的频率,并统计Tfh/Tfr比值,利用实时定量聚合酶链反应(qPCR)和免疫印迹法分别检测miR-155和C/EBPβ的表达,同时分析以上检测指标与SLE疾病活性指数(SLEDAI)的关联性,以及miR-155和C/EBPβ的表达水平与Tfh和Tfr细胞频率和Tfh/Tfr比值的相关性。结果SLE女性患者外周血CD4^(+)T细胞中Tfh和Tfr细胞频率均与SLEDAI呈正相关,且与Tfh/Tfr比值呈负相关趋势,但无显著性差异;miR-155和C/EBPβ在活动期患者中的表达显著高于缓解期和对照组,且与SLEDAI正相关;患者中miR-155和C/EBPβ的表达水平均与Tfh细胞频率显著正相关。结论SLE女性患者外周血miR-155和C/EBPβ的表达水平同SLEDAI及Tfh细胞频率正相关,提示miR-155和C/EBPβ可能通过调控Tfh细胞的分化与功能而参与SLE疾病的发生与发展。

微小RNA-30b通过下调活化T细胞核因子c1抑制大鼠血管平滑肌细胞钙化

目的观察微小RNA(microRNA,miRNA)-30b通过调控活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cell c1,NFATc1)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)钙化的作用及机制。方法大鼠体外原代培养VSMCs,并分为正常组和高磷组。采用ELISA法测定各组VSMCs碱性磷酸酶(ALP)的活性;采用茜素红染色及钙含量检测各组VSMCs的钙化;采用实时荧光定量PCR测定各组VSMCs miR-30b及NFATc1和Runx2表达,Western blot检测NFATc1、Runx2的蛋白表达。为进一步验证miR-30b对VSMCs的作用,给予miR-30b的类似物mimic-30b和抑制物inhibitor-30b,检测VSMCs的钙化及NFATc1、Runx2的表达和ALP的活性变化。结果与正常组比较,高磷诱导的VSMCs钙化增加(t=-13.324,P<0.001);NFATc1的RNA和蛋白表达量升高(t值分别为-4.621、-4.684,P值分别为0.010、0.009);Runx2的RNA和蛋白表达量升高(t值分别为-4.340、-3.860,P值分别为0.005、0.018);ALP活性升高(t=-12.636,P<0.001);miR-30b的表达降低(t=3.822,P=0.019)。转染inhibitor-30b后,inhibitor-30b组较未转染组、inhibitor-NC组的钙含量升高(F=606.554,P<0.001);NFATc1的RNA和蛋白表达量升高(F值分别为36.427、22.512,P值分别为<0.001、0.002);Runx2的RNA和蛋白表达量升高(F值分别为44.225、42.832,P值分别为<0.001、<0.001);ALP活性升高(F=347.356,P<0.001)。转染mimic-30b后,钙化降低(F=93.341,P<0.001);NFATc1的RNA和蛋白表达量降低(F值分别为69.841、6.090,P值分别为<0.001、0.036);Runx2的RNA和蛋白表达量降低(F值分别为44.780、841.081,P值分别为0.005、<0.001);ALP活性降低(F=197.829,P<0.001)。结论miRNA-30b可抑制VSMCs钙化,可能是通过下调NFATc1,进而下调Runx2表达,从而使VSMCs表型转化减少实现的。

MicroRNA-20a通过调节CKIP-1促进小鼠C3H/10T1/2成骨分化

目的:研究microRNA-20a(miR-20a)对小鼠C3H/10T1/2细胞成骨分化作用的影响及其调控机制。方法:对贴壁培养的小鼠C3H/10T1/2细胞成骨诱导不同时间,ALP染色及应用qRT-PCR验证其诱导结果,同时观察MiR-20a在诱导过程中表达变化;细胞转染MiR-20a mimics,CKIP-1 siRNA,在荧光显微镜下观察转染效果,应用qRT-PCR测定过表达及干扰效率;qRT-PCR检测过表达MiR-20a及干扰CKIP-1对细胞成骨分化的影响及过表达MiR-20a对CKIP-1基因表达的影响。结果:成骨标记基因ALP、OSX、OCN、BSP随小鼠C3H/10T1/2细胞诱导过程逐渐升高,且成骨诱导分化过程中MiR-20a表达上调。过表达MiR-20a促进C3H/10T1/2细胞成骨分化,成骨标记基因碱性磷酸酶(ALP)、RUNX2、OSX、0CN、BSP显著高于对照组,并且抑制CKIP-1的表达;干扰CKIP-1能促进细胞成骨标记基因表达。结论:MiR-20a可能通过下调骨形成负调节因子CKIP-1的表达促进C3H/10T1/2细胞成骨分化。

miR-146aC>G,miR-149T>C基因多态性与缺血性脑卒中易感性的研究

目的:探讨中国汉族人群中miR-146aC>G,miR-149T>C基因多态性与缺血性脑卒中易感性的关系。方法:利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测196例缺血性脑卒中患者和205例健康对照中miR-146aC>G,miR-149T>C的基因型,统计学方法比较两组间基因型及等位基因分布差异。结果:miR-146aC>G位点各基因型在病例组和对照组分布无明显差异,但等位基因G会增加缺血性脑卒中的患病风险;miR-149T>C位点各基因型在病例组和对照组分布无明显差异。在分层分析中,miR-146aC>G会增加女性和非高血压患者缺血性脑卒中的患病风险,miR-149T>C会增加非高血压患者缺血性脑卒中的患病风险。结论:miR-146aG等位基因,miR-149C等位基因与汉族人群缺血性脑卒中易感性有一定的相关性。

过表达miR-155抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:研究过表达miR-155对BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响。方法:(1)用重组腺病毒Ad-BMP9(BMP9)诱导C3H10T1/2细胞成骨分化,定量PCR(qPCR)检测miR-155的表达,RT-PCR检测Runx2和ALP的表达。(2)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测miR-155的表达,ALP活性和染色检测早期成骨能力。(3)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,诱导分化14d茜素红S染色检测晚期成骨能力。(4)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,qPCR检测成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN的表达。(5)miR-155和BMP9共同处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达。(6)qPCR和Western blot分别检测HIF1α和VEGF的mRNA表达水平和蛋白质表达水平。(7)应用荧光素酶报告基因对miR-155的靶基因进行筛选和验证。结果:在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,过表达miR-155降低ALP活性及染色;减少钙盐沉积;成骨分化相关基因Runx2、OSX、COL1A1、ALP、OCN和OPN表达降低;抑制p-Smad1/5/8、OCN和OPN蛋白水平的表达;HIF1α和VEGF的mRNA和蛋白表达水平减少。在对靶基因的检测中,过表达miR-155可以抑制HIF1α蛋白水平的表达,但对其mRNA水平无明显影响。结论:miR-155过表达减弱BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化,可能是通过抑制Smad/BMP信号通路发挥作用,也有可能是通过抑制靶基因HIF1α的表达来发挥作用。

miR-93-5p靶向调控Smad5表达抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化的研究

目的探讨mi R-93-5p是否通过靶向调控其预测靶基因Smad5的表达,从而抑制小鼠MSCs C3H10T1/2细胞的成骨分化。方法构建Smad5 3’-UTR-荧光素酶报告载体(pmi R-RB-REPORTTM),通过双荧光素酶报告基因检测,观察mi R-93-5p对Smad5 3’-UTR荧光素酶活性的影响,鉴定Smad5是否为mi R-93-5p的靶基因。将mi R-93-5p mimics(M组)与mi R-93-5p inhibitor(In组)及其对应的阴性对照组mi R-93-5p mimics阴性对照(MC组)与mi R-93-5p inhibitor阴性对照(In C组)分别转染至C3H10T1/2细胞中,并进行成骨诱导培养,48 h后分别采用实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q RT-PCR)及Western blot检测各组细胞Smad5在m RNA及蛋白水平的相对表达量;14 d后通过茜素红染色检测各组细胞外钙盐的沉积情况,了解mi R-93-5p对C3H10T1/2细胞成骨分化的调控效应。结果双荧光素酶报告基因检测结果显示,mi R-93-5p能与Smad5 m RNA3’-UTR特异性结合,抑制其荧光素酶活性(P<0.05)。q RT-PCR检测示,M组及In组Smad5的m RNA相对表达量与对应阴性对照组MC组及In C组比较差异均无统计学意义(P>0.05);Western blot检测示,M组及In组Smad5蛋白相对表达量与对应阴性对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中M组较MC组表达量下调,而In组则较In C组表达量上调。茜素红染色示,M组钙盐沉积较MC组明显减少,而In组则较In C组钙盐沉积明显增多。结论Smad5是mi R-93-5p的靶基因,mi R-93-5p可通过靶向调控Smad5的表达,抑制小鼠C3H10T1/2细胞成骨分化。

miR-155通过下调BMP9/Smad信号通路抑制间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

该文研究了在诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化过程中miR-155的作用及其是否是通过调控BMP9/Smad(bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against de-capentaplegic)信号通路发挥作用。在诱导C3H10T1/2细胞成骨分化过程中,采用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)检测miR-155水平的变化。转染miR-155模拟剂(miR-155)至C3H10T1/2细胞后,miR-155水平显著增高(P<0.001),而转染其抑制剂(anti-miR-155)至C3H10T1/2细胞后,miR-155水平显著降低(P<0.001)。转染后成骨诱导培养基诱导成骨7 d,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性及染色结果显示,miR-155能显著降低C3H10T1/2细胞成骨分化过程中的ALP活性(P<0.01)、减弱ALP染色,而anti-miR-155则能逆转其作用。成骨诱导14 d茜素红S染色结果显示,miR-155组钙盐结节较对照组少,下调miR-155的水平后,钙盐沉积结节增多。q RT-RCR检测结果显示,miR-155显著降低BMP9 m RNA水平(P<0.001),且miR-155组成骨基因Runx2和ALP表达均显著低于对照NC组(P<0.05、P<0.01)。Western blot检测BMP9、Runx2和p-Smad1/5/8蛋白质水平,结果显示,miR-155组蛋白质水平均显著降低(P<0.01、P<0.05、P<0.001)。该研究结果提示,miR-155对C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制BMP9/Smad信号通路发挥作用的。

MiR-21协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化

目的:探讨miR-21与BMP9之间的关系,明确miR-21在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:(1)Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21表达。RTPCR检测ALP的表达。(2)MiR-21转染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21和BMP9表达。(3)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,ALP活性和染色实验检测C3H10 T1/2细胞早期成骨能力。茜素红S染色实验检测钙盐沉积情况。(4)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测成骨分化相关因子ALP,OCN的表达。(5)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5蛋白水平的表达。结果:(1)BMP9暂时降低miR-21的表达。MiR-21也可以暂时降低BMP9的表达。(2)MiR-21可以协同BMP9增强ALP和钙盐沉积。(3)MiR-21协同BMP9增加了p-Smad1/5蛋白水平的表达。结论:MiR-21与BMP9存在相互关系,两者可以互相调节表达。MiR-21可以协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,这一过程与增强BMP9/Smad信号的激活程度有关。

小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定。方法应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定。将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定。以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量。结果构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65×108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达。结论成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础。

广西人群miRNA-107基因多态性分布特征及其与血脂的关系

目的探讨miR-107基因单核苷酸多态性(SNP)位点rs2296616 C/T在广西地区健康人群中的分布特点,对比其在不同种族间基因型及等位基因频率分布的差异,并进一步探讨rs2296616 C/T位点单核苷酸多态性(SNP)与血脂水平的相关性。方法采用多重单碱基延伸SNP分型技术(multiplex SNa Pshot)和DNA测序法,检测372例广西健康人rs2296616 C/T位点的多态性,用7600生化仪检测其血脂相关指标,并用统计学方法分别比较rs2296616C/T位点多态性在各种族人群间的分布差异及不同基因型间的血脂水平差异。结果广西人群miR-107基因rs2296616 C/T位点存在TT(91.1%)和CT(8.9%)两种基因型及T(95.6%)和C(4.4%)两种等位基因。该位点的基因型和等位基因型频率在广西人群不同性别间的比较,差异无统计学意义(P>0.05)。其基因型和等位基因频率与人类基因组单体型图(Hap Map)所公布的欧洲人、日本人、非洲人、印第安人和墨西哥人分型数据相比较,差异均有统计学意义(P<0.05),但与北京汉族人群比较,差异无统计学意义(P>0.05)。rs2296616 C/T位点两种基因型人群血脂之间比较,携带TT基因型人群的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与CT组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论广西人群miR-107基因rs2296616 C/T位点多态性与其他种族人群之间比较存在不同程度的差异;rs2296616 C/T位点多态性与HDL-C水平高低有关。

乳腺癌细胞来源外泌体miR-181a-5p对恶病质肌肉萎缩的影响

目的探讨乳腺癌细胞来源外泌体miR-181a-5p对恶病质肌肉萎缩的影响及可能机制。方法小鼠乳腺癌细胞4T1、小鼠正常乳腺细胞HC11分别采用条件培养基培养并从中分离纯化外泌体,采用Western blot法检测4T1细胞、HC11细胞外泌体肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101)、CD63、CD9、高尔基体基质蛋白(Golgi matrix protein,GM130)相对表达量,采用实时荧光定量PCR法检测miR-181a-5p相对表达量。小鼠成肌细胞C2C12分化为肌管细胞后分为对照组(正常培养)、条件培养基组(与4T1细胞培养基共培养)和细胞松弛素D(cytochalasin D,cytoD)组(胞吞抑制剂cytoD处理细胞后与4T1细胞培养基共培养),采用Western blot法检测肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)、肌萎缩蛋白-1(Atrogin-1)蛋白相对表达量。取人胚胎肾细胞HEK293T,采用荧光素酶报告基因实验验证miR-181a-5p与N-myc下游调节基因2(N-myc downstream regulated gene 2,NDRG2)的靶向关系。C2C12肌管细胞分为空白对照组(不进行转染)、miR-181a-5p过表达组(转染miR-181a-5p mimic)、阴性对照组(转染miR-NC)、NDRG2敲低组(转染NDRG2siRNA),采用Western blot法检测4组细胞MHC、Atrogin-1、NDRG2蛋白相对表达量。结果4T1细胞外泌体miR-181a-5p相对表达量(0.91±0.07)及TSG101、CD63、CD9蛋白相对表达量(1.51±0.03、1.46±0.08、1.43±0.06)均高于HC11细胞(0.40±0.04、0.83±0.08、0.79±0.43、0.70±0.03)(P<0.05),GM130蛋白相对表达量(0.46±0.03)低于HC11细胞(1.14±0.05)(t=17.160,P<0.001)。条件培养基组细胞MHC蛋白相对表达量(0.86±0.17)低于对照组(1.59±0.08)、cytoD组(1.34±0.07)(P<0.05),Atrogin-1蛋白相对表达量(1.12±0.05)高于对照组(0.77±0.05)、cytoD组(0.87±0.03)(P<0.05);cytoD组细胞MHC、Atrogin-1蛋白相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-181a-5p靶向NDRG2。miR-181a-5p过表达组、NDRG2敲低组细胞MHC(1.17±0.09、0.73±0.08)、NDRG2(0.73±0.06、0.59±0.05)蛋白相对表达量均低于阴性对照组(1.52±0.11、1.64±0.09)、空白对照组(1.86±0.07、1.37±0.06)(P<0.05),Atrogin-1蛋白相对表达量(0.99±0.06、0.89±0.08)均高于阴性对照组(0.49±0.03)、空白对照组(0.53±0.10)(P<0.05);阴性对照组细胞MHC、Atrogin-1、NDRG2蛋白相对表达量与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论乳腺癌4T1细胞来源的外泌体miR-181a-5p靶向结合并下调NDRG2蛋白表达,加重C2C12肌管萎缩,促进恶病质进展。