LncRNA MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA/B介导结直肠癌细胞免疫逃逸

目的:探究长链非编码RNA母系表达基因8(LncRNA MEG8)通过靶向miR-15a-5p调控MHCⅠ类相关蛋白A/B(MICA/B)介导的结直肠癌(CRC)细胞免疫逃逸机制。方法:RT-qPCR、Western blot检测CRC组织和细胞系MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平;双荧光素酶实验验证MEG8对miR-15a-5p的调控关系;采用脂质体转染法将NC、MEG8、miR-NC、miR-15a-5p分别或共转染至SW480、SW620细胞,记为NC组、MEG8组、MEG8+miR-NC组、MEG8+miR-15a-5p组;将NK细胞分别与SW480、SW620细胞共培养;ELISA检测共培养液中TNF-α、IFN-γ水平;CCK-8、EdU染色、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR、Western blot检测细胞MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平。结果:与癌旁组织或正常结肠上皮细胞相比,CRC组织和细胞系中MEG8、MICA、MICB、NKG2D mRNA和蛋白水平降低,miR-15a-5p水平升高(P<0.05)。MEG8靶向调控miR-15a-5p。共培养体系中,与NC组相比,MEG8组细胞MICA、MICB、NKG2D蛋白水平、共培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平明显升高,培养1 d、2 d、3 d后,OD值、EdU阳性率、迁移和侵袭细胞数明显降低(P<0.05);过表达miR-15a-5p能部分逆转过表达MEG8对细胞MICA、MICB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ水平和增殖、侵袭转移能力的影响(P<0.05)。结论:MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA、MICB表达,促进NK细胞活性,抑制CRC细胞免疫逃逸。

miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

目的探讨miR-15b-5p靶向叉头框蛋白O1(FOXO1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的调控作用及其机制。方法取对数生长期HK-2细胞,设置:(1)对照组(正常培养)与H/R组(H/R诱导培养)。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达,Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。(2)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照质粒后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染mi R-15b-5p mimic和OE-NC质粒后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和FOXO1过表达质粒后H/R诱导培养)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达,Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。(3)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达,LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。双荧光素酶报告实验检测miR-15b-5p与FOXO1之间的靶向关系。结果倒置显微镜下观察显示,对照组细胞数量较多,细胞大多呈典型鹅卵石形态,铺路石状生长;H/R组大部分细胞收缩变圆,贴壁细胞数量明显减少。与对照组比较,H/R组miR-15b-5p表达水平明显降低,FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p直接靶向作用于FOXO1的3'-UTR。miR-15b-5p过表达抑制H/R诱导的HK-2细胞活力,降低细胞凋亡,抑制细胞自噬(P<0.05)。与H/R+miR-15b-5p mimic组相比,H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞存活率降低,细胞凋亡和自噬水平增高(P<0.05)。结论miR-15b-5p通过靶向抑制FOXO1降低细胞自噬减缓H/R诱导的HK-2细胞损伤。

miR-15a-5p在乳腺癌耐药与敏感患者中的差异分析及耐药价值预测

目的探讨miR-15a-5p在多西他赛治疗敏感组和耐药组中的表达差异及对临床预后的意义。方法运用TCGA数据库分析miR-15a-5p在恶性肿瘤中的表达情况。收集2019年1月至2020年1月在本院治疗的30例对多西他赛耐药的乳腺癌患者为耐药组,收集同期治疗的30例对药物敏感的乳腺癌患者为敏感组,通过q-PCR荧光定量法检测患者癌组织中miR-15a-5p的表达水平,探讨miR-15a-5p与乳腺癌耐药、分型的关联情况。绘制ROC曲线分析miR-15a-5p对患者预后的预测价值以及miR-15a-5p对乳腺癌患者耐药诊断价值。结果通过泛癌分析发现,miR-15a-5p在乳腺癌等多种癌症中显著高表达。q-PCR结果显示,多西他赛化疗敏感组的miR-15a-5p的表达水平高于耐药组的表达水平(P<0.05)。临床统计分析发现miR-15a-5p与ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)的表达呈负相关,而与人表皮生长因子受体-2的表达无明显关联性。结论miR-15a-5p在多西他赛耐药患者的肿瘤组织中的表达水平明显低于敏感组,且miR-15a-5p在乳腺癌的高表达与乳腺癌的分子分型、预后相关。miR-15a-5p可能参与了乳腺癌的免疫调节最终导致了乳腺癌患者多西他赛耐药。

LINC_00355通过miR-15a-5p调节PHF19在肺癌侵袭转移中的作用机制研究

目的 探讨LINC_00355通过miR-15a-5p调节PHF19在肺癌侵袭转移中的作用机制。方法 采用A549肺癌细胞作为实验细胞。将细胞分为A549肺癌细胞组、lncRNA-NC组、LINC_00355 mimics组、LINC_00355 inhibitor组,进行不同处理。A549肺癌细胞组:不进行任何处理;lncRNA-NC组:加入空白载体;LINC_00355 mimics组:加入LINC_00355过表达载体;LINC_00355 inhibitor组:加入LINC_00355低表达载体。培养结束后,MTT法测定细胞活力,检测单克隆形成数、迁移和侵袭水平。采用萤光素酶报告基因实验分析LINC_00355对miR-15a-5p的靶向作用;实时荧光定量PCR(qPCR)法检测细胞LINC_00355、miR-15a-5p、PHF19,Western blot检测PHF19蛋白表达水平。结果 与A549肺癌细胞组、lncRNA-NC组比较,LINC_00355 mimics组吸光度(A)值、细胞活力、单克隆形成数、穿膜数、迁移距离升高(P<0.05),凋亡率降低(P<0.05);LINC_00355 inhibitor组A值、细胞活力、单克隆形成数、穿膜数、迁移距离降低,凋亡率升高(P<0.05);与LINC_00355 mimics组比较,LINC_00355 inhibitor组A值、细胞活力、单克隆形成数、穿膜数、迁移距离降低,凋亡率升高(P<0.05)。LINC_00355过表达可明显降低miR-15a-5p-wt的萤光素酶活性(P<0.05);与A549肺癌细胞组、lncRNA-NC组比较,LINC_00355 mimics组细胞LINC_00355、PHF19 mRNA表达上调,miR-15a-5p表达降低(P<0.05),LINC_00355 inhibitor组细胞LINC_00355及PHF19 mRNA和蛋白表达降低,miR-15a-5p表达升高(P<0.05);与LINC_00355 mimics组比较,LINC_00355 inhibitor组细胞LINC_00355 mRNA、PHF19 mRNA和蛋白表达降低,miR-15a-5p表达升高(P<0.05)。结论 LINC_00355过表达促进肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡,敲低LINC_00355则产生相反的效果;其机制可能与LINC_00355负调控miR-15a-5p进而上调肺癌细胞中PHF19的表达有关。

miR-15a-5p/CCND1通路在胰腺癌细胞转移侵袭过程中的作用机制

目的探究miR-15a-5p/CCND1通路在胰腺癌中的调控作用。方法将稳定表达miR-15a-5p的CAPAN-1植入裸鼠皮下进行体内异位成瘤,注射未转染组CAPAN-1细胞的小鼠记为A组,注射pcDNA3.1(+)空载体组CAPAN-1细胞的小鼠记为B组,注射pcDNA3.1(+)-miR-15a-5p重组质粒组CAPAN-1细胞的小鼠记为C组。观察记录肿瘤体积,30天后取出肿瘤组织,称重记录。Western blot实验检测移植瘤组织中miR-15a-5p和CCND1的表达,运用组织HE染色、荧光染色等评估移植瘤情况。结果与A、B组裸鼠移植瘤相比,C组裸鼠移植瘤体积和重量显著降低(P<0.05)。与A、B组裸鼠移植瘤相比,C组裸鼠移植瘤中miR-15a-5p表达水平明显升高(P<0.05),CCND1表达水平明显降低(P<0.05)。A、B组移植瘤组织中,细胞核仁肥大、核分裂较常见,形态不规则、大小不等,数目增加、排列紧密、色深,染色质呈粗颗粒状分布不均,C组较A、B组移植瘤组织细胞排列稀疏,密度降低,组织内坏死面积增多。与A、B组移植瘤相比,C组移植瘤组织中CCND1相对荧光强度明显降低(P<0.05)。结论miR-15a-5p可通过调控CCND1进而调控胰腺癌发生和转移。

miR-15a-5p靶向PD-L1对食管癌进展、预后与肿瘤免疫反应的影响

背景微核糖核酸(microRNA,miR)-15a-5p与细胞程序性死亡蛋白配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)在多种肿瘤进展、治疗与预后中发挥重要作用,但其在食管癌中的作用尚不完全清楚.目的研究miR-15a-5p与PD-L1表达对食管癌进展与预后的影响,并分析二者的靶向关系以及二者调控食管癌细胞生物学行为的机制.方法用癌症基因组图谱数据库、基因表达综合数据库和RNA相互作用组百科全书泛癌分析数据库分析食管癌中miR-15a-5p和PD-L1基因的表达,通过Kaplan-Meier生存分析研究miR-15a-5p和PD-L1的表达与食管癌无病生存期以及总生存期的关系.信息学和荧光活性实验检测miR-15a-5p与PD-L1的靶向关系.体外培养食管癌细胞,转染miR-15a-5p mimics或miR-NC后,分别用Western blot、流式细胞术、免疫荧光实验检测PD-L1表达.将转染miR-15a-5p mimics或miR-NC的食管癌细胞与CD8+T细胞共培养,流式细胞术检测干扰素-γ(interferon-γ,INF-γ)阳性CD8+T细胞比例,ELISA检测共培养体系中上清液中INF-γ和白细胞介素(interleukin,IL)-2含量.结果miR-15a-5p在食管癌组织中表达水平较癌旁非癌变组织降低(P<0.05).以miR-15a-5p表达水平的中位数为分界线,随T分期和肿瘤大小增加和淋巴结转移,miR-15a-5p低表达率增加(P<0.05);相比于miR-15a-5p低表达的食管癌患者,miR-15a-5p高表达显示出较长的无病生存期和总生存期(P<0.05),miR-15a-5p高表达同时PD-L1低表达的无病生存期和总生存期更长(P<0.05).在miR-15a-5p高表达的食管癌患者中PD-L1 mRNA多呈低表达.PD-L1为miR-15a-5p的靶基因.过表达miR-15a-5p抑制食管癌细胞中总PD-L1及膜PD-L1表达(P<0.05).在食管癌细胞中过表达miR-15a-5p可促进共培养体系中CD8+T细胞的激活(即:共培养体系中INF-γ阳性CD8+T细胞比例以及共培养体系中上清液中INF-γ和IL-2含量增加).结论miR-15a-5p可通过靶向PD-L1增强食管癌细胞的肿瘤免疫反应,且miR-15a-5p/PD-L1可作为食管癌诊断及预后生物标记物.

miR-15b-5p靶向HDGF抑制胃癌细胞增殖并促进凋亡

目的:研究miR-15b-5p和HDGF对胃癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:采用qRT-PCR法检测胃癌细胞中miR-15b-5p的表达;通过软件预测miR-15b-5p的下游靶基因;将对数生长期AGS细胞随机分为miR-15b-5p组(转染miR-15b-5p模拟物)、miR-NC组(转染阴性对照)、Scramled组(转染阴性对照)、shHDGF组(转染质粒pcDNA3.1-shHDGF)、Vector+miR-15b-5p组(miR-15b-5p模拟物和pcDNA3.1载体共转染)、HDGF+miR-15b-5p组(miR-15b-5p模拟物和HDGF共转染),均以脂质体法转染;MTT法和流式细胞术检测各组细胞的增殖和凋亡变化;Western blot法和双荧光素酶报告基因实验分析miR-15b-5p对HDGF的靶向调控作用。结果:与正常胃黏膜上皮细胞GES-1相比,胃癌细胞SGC-7901和AGS中miR-15b-5p低表达,且过表达miR-15b-5p可抑制AGS细胞的增殖并促进凋亡。HDGF是miR-15b-5p的潜在靶标,miR-15b-5p能够抑制HDGF表达。而回补HDGF可逆转miR-15b-5p抑制胃癌细胞增殖与促进凋亡的作用。结论:miR-15b-5p可抑制胃癌细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与靶向抑制HDGF有关,提示miR-15b-5p可能成为胃癌诊断与治疗的潜在靶点。

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖与迁移

目的:观察高表达的miR-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的miR-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒构建miR-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p的表达;CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测SMMC-7721细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:设计的miR-15a-5p序列与寡核苷酸测序结果匹配达100%;真核表达质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-15a-5p的表达量与对照组相比显著增加(P<0.05);miR-15a-5p高表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(P<0.05);miR-15a-5p高表达组细胞迁移速度低于对照组。结论:高表达的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力。

乌司他丁通过诱导miR-155抑制体外循环心脏手术患者炎症反应的作用机制研究

目的:研究乌司他丁在体外循环(CPB)心脏手术中对患者炎症因子抑制作用的机制。方法:选取2012年7月-2016年7月于我院择期行CPB心脏手术的40例患者为研究对象,按照随机数字表法分为对照组和观察组,各20例。观察组患者于麻醉诱导后即给予30万U乌司他丁静脉泵注,以2.5 m L/min的速率在20 min内完成,再将70万U乌司他丁以0.2 m L/min的速率使用微量泵持续静脉泵注至术毕;对照组患者给予等容量生理盐水。分别于麻醉诱导前(术前)和CPB停止(术后)6、12、24 h采集患者血液标本,以实时定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测外周血单核细胞中微小核糖核酸155(mi R-155)及其靶基因髓样分化因子88(My D88)的表达情况;以酶联免疫吸附测定法检测血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和IL-8的表达情况;采用Pearson相关系数分析观察组患者术后24 h的mi R-155与TNF-α、IL-6、IL-8表达的相关性。结果:与对照组比较,观察组患者的mi R-155表达水平显著升高,其靶基因My D88的表达水平显著降低,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。观察组患者术后24 h的mi R-155与TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平呈显著负相关(P<0.01)。结论:乌司他丁可通过诱导mi R-155的表达来抑制炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的释放,这可能是该药在CPB心脏手术中发挥抗炎作用的新机制。

lncRNA FGD5-AS1靶向miR-15a-5p调控LPS诱导的脓毒症细胞损伤

目的:探讨长链非编码RNA FGD5-AS1(lncRNA FGD5-AS1)对LPS诱导的脓毒症细胞损伤的影响及分子机制。方法:500 ng/ml脂多糖(LPS)诱导THP-1细胞损伤。THP-1细胞分为对照组、LPS组、pcDNA组、pcDNA-FGD5-AS1组、anti-miR-NC组、anti-miR-15a-5p组、pcDNA-FGD5-AS1+miR-NC组、pcDNA-FGD5-AS1+miR-15a-5p组。RT-qPCR检测lncRNA FGD5-AS1和miR-15a-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测蛋白表达;ELISA检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平。双荧光素酶报告实验检测lncRNA FGD5-AS1和miR-15a-5p的靶向关系。结果:与对照组相比,经LPS诱导的THP-1细胞中,lncRNA FGD5-AS1表达降低,miR-15a-5p表达升高(P<0.05)。过表达lncRNA FGD5-AS1和下调miR-15a-5p均能够显著降低细胞凋亡以及炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达(P<0.05)。lncRNA FGD5-AS1靶向调控miR-15a-5p表达,上调miR-15a-5p能逆转过表达lncRNA FGD5-AS1对LPS诱导的THP-1细胞凋亡以及炎症细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的影响(P<0.05)。结论:过表达lncRNA FGD5-AS1通过靶向下调miR-15a-5p表达减轻LPS诱导的THP-1细胞损伤。

基于miR-15a-5p/P53信号通路探讨EMT与肺癌细胞阿霉素耐药的关系

目的探讨miR-15a-5p在肺癌细胞对阿霉素(DOX)耐药中的作用,并阐明其与DOX耐药之间的功能和机制联系。方法分别采用si-miR-15a-5p、miR-15a-5p模拟物转染A549、A549/DOX抗性细胞(A549/D)。采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blots检测上皮间充质转化(EMT)相关蛋白及P53蛋白表达,qRT-PCR检测miR-15a-5p表达。通过生物信息学预测与双荧光素酶报告子分析miR-15a-5p潜在靶基因。采用A549/D细胞构建裸鼠移植瘤模型,分析miR-15a-5p过表达促进DOX的体内抗肿瘤作用。结果MTT分析结果显示,miR-15a-5p的敲低提高了A549细胞的细胞活力(IC 50值:8.86±0.32μmol/L),miR-15a-5p的过表达降低了A549/D细胞的细胞活力(IC 50值:1.92±0.11μmol/L)。并且在A549细胞中阻断miR-15a-5p减少凋亡(P<0.001),在A549/D细胞中增加miR-15a-5p表达促进凋亡(P<0.001)。Western blot分析显示转染si-miR-15a-5p逆转了DOX调节EMT的作用。生物信息学预测证明P53和miR-15a-5p之间存在特异性结合位点。在A549细胞中阻断miR-15a-5p减少P53蛋白表达(P<0.001),在A549/D细胞中增加miR-15a-5p表达增加P53蛋白表达(P<0.01)。体内实验显示,miR-15a-5p agomir联合DOX可降低肿瘤体积和N-cadherin的表达水平,同时增强了P53、E-cadherin蛋白的表达水平。结论miR-15a-5p过表达可能通过靶向P53抑制EMT过程,增强肺癌细胞对DOX治疗的敏感性。

CCND1基因3'-UTR区miR-15a-5p和miR-16-5p结合位点的荧光素酶报告载体构建及分析

目的:构建miR-15a-5p和miR-16-5p的荧光素酶报告载体,利用此载体分析并验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因3'-UTR区域的确切结合位点,探讨miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的相互作用关系。方法:通过Pubmed和miRBase数据库分别寻找到CCND1基因3'-UTR区域碱基序列和miR-15a-5p、miR-16-5p的碱基序列。找出理论结合位点后,构建荧光素酶报告载体,并用荧光素酶报告基因方法验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因之间的作用关系。结果:通过基因测序表明,本实验成功构建了CCND1a/Ma和CCND1b/Mb荧光素酶报告基因表达载体。将上述载体应用于荧光素酶报告基因实验,结果发现CCND1 b组的荧光素酶表达强度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的3'-UTR区域存在结合位点,其具体结合位置在CCND1b区。这在理论上意味着miR-15a-5p和miR-16-5p可以抑制CCND1基因的表达。

miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响

目的观察miR-15a-5p对胃癌细胞增殖的影响。方法将miR-15a-5p mimics、mimics control、miR-15a-5p inhibitor、inhibitor control分别转染至胃癌SGC-7901和BGC-823细胞,应用实时定量PCR分别检测miR-15a-5p的表达水平以验证miR-15a-5p mimics对miR-15a-5p表达的影响及miR-15a-5p inhibitor对miR-15a-5p表达的影响。CCK-8实验检测miR-15a-5p mimics及miR-15a-5p inhibitor对胃癌SGC-7901和BGC-823细胞增殖的影响。结果实时定量PCR表明与转染mimics control相比,转染miR-15a-5p mimics后SGC-7901细胞和BGC-823细胞中miR-15a-5p的表达水平显著升高(P <0. 05)。与转染inhibitor control相比,转染miR-15a-5p inhibitor后SGC-7901和BGC-823细胞中miR-15a-5p的表达有下降趋势,但差异无统计学意义(P> 0. 05)。CCK-8实验表明过表达miR-15a-5p可抑制胃癌细胞SGC-7901和BGC-823的增殖(P <0. 05),miR-15a-5p inhibitor促进SGC-7901和BGC-823细胞增殖(P <0. 05)。结论 miR-15a-5p可能抑制胃癌细胞的增殖。

miR-15b-5p调控PI3K/AKT/mTOR信号通路对肾癌细胞凋亡及氧化应激反应的影响

目的:探讨miR-15b-5p是否调控磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/mTOR信号通路影响肾癌细胞(A-498)凋亡和氧化应激反应。方法:运用实时定量PCR分析肾癌组织中miR-15b-5p表达水平。流式细胞术分析抑制或过表达miR-15b-5p对A-498细胞凋亡的影响。试剂盒分析丙二醛(MDA)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平。免疫印迹法分析磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)相关蛋白表达水平。结果:肾癌组织中miR-15b-5p表达水平显著升高(P<0.05)。抑制miR-15b-5p表达显著促进A-498细胞凋亡,增加MDA含量,降低SOD和CAT水平,并下调p-p85、p-Akt和p-p70S6K1蛋白表达水平(P<0.05),而过表达miR-15b-5p具有相反作用(P<0.05)。PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂GNE-477显著促进A-498细胞凋亡,增加MDA含量,降低SOD和CAT水平(P<0.05)。GNE-477还可减弱miR-15b-5p过表达对A-498细胞凋亡和氧化应激反应的影响(P<0.05)。结论:肾癌中miR-15b-5p表达显著增加。抑制miR-15b-5p表达通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路可促进肾癌细胞凋亡和氧化应激损伤。

lncRNA XIST靶向miR-15b-5p调控细胞凋亡及自噬参与帕金森病发病机制研究

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)X染色体失活特异转录本(XIST)对帕金森病(PD)的潜在分子机制。方法用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导建立PD模型。用爬杆和转棒法检测小鼠行为变化。四甲基偶氮唑盐法和流式细胞术检测人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)活力和凋亡。双荧光素酶报告基因法、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western blot、免疫组化探讨lncRNA XIST在PD中的分子机制。结果PD体内外模型XIST表达上调,miR-15b-5p表达下调。沉默XIST(si-XIST)可缩短小鼠准备向下爬行的时间,延长停留时间。此外,si-XIST也可增加酪氨酸羟化酶阳性(TH+)神经元数。miR-15b-5p是XIST的靶基因。结论si-XIST可通过调控miR-15b-5p抑制PD的自噬和凋亡。

循环miR-338-5p、miR-15b-5p和miR-21-5p作为肝细胞癌的潜在肿瘤标记物

目的筛查血浆中能作为肝细胞癌肿瘤标记物的miRNA。方法分为4个阶段：1miRNA芯片筛查肝细胞癌组织中异常表达的miRNA,并根据文献和miRNA芯片结果确定候选miRNA。213对术前和术后7~10 d肝细胞癌患者血浆用定量逆转录-聚合酶链反应（quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction,qRT-PCR）检测候选miRNA的表达水平,术后表达水平下降的miRNA定为目的miRNA。339例肝细胞癌患者、32例肝硬化患者、25例健康人员血浆进行qRT-PCR,验证目的miRNA在3组人群中的表达差异。4分析目的 miRNA作为肝细胞癌肿瘤标记物的诊断价值,绘制受试者工作曲线并分析其与临床参数的相关性。结果癌组织中40种miRNA表达量增加（〉2倍）,52种miRNA表达量明显下降（〈0.5倍）。结合文献,选取miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-338-5p作为候选miRNA。术后3种miRNA表达水平下降,定为目的 miRNA。3组人群测量结果显示miR-15b-5p、miR-21-5p、miR-338-5p在肝细胞癌患者血浆中表达水平明显高于肝硬化患者和健康对照人群。其中miR-338-5p在肝细胞癌与肝硬化、健康人群鉴别时,曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.762 4（灵敏度：64.10%,特异度：87.50%）和0.906 4（灵敏度：89.74%,特异度：84.00%）。miR-21-5p和miR-338-5p进行联合诊断,特异度可达92.98%。即使在甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）判定为阴性的肝细胞癌患者,3种miRNA判定为肝细胞癌的灵敏度都比较高。相关性分析结果显示,血浆miR-338-5p水平与AFP水平呈负相关（r=-0.344,P=0.032）。结论循环miR-338-5p、miR-15b-5p、miR-21-5p具有作为肝细胞癌的肿瘤标记物的潜力。

miR-15b-5p靶向CDK4抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖

目的探讨miR-15b-5p通过靶向抑制细胞周期素依赖性激酶4 (CDK4)的表达进而发挥负向调节脉络膜黑色素瘤细胞增殖的作用。方法使用荧光素酶报告分析检测miR-15b-5p与CDK4结合情况。体外培养人眼侵袭性脉络膜黑色素瘤细胞系MUM-2B,分别转染negative control RNA、miR-15b-5p mimics、inhibitor nc RNA和miR-15b-5p inhibitor;采用实时定量PCR检测转染后miR-15b-5p的表达水平;采用Western blotting检测4组细胞中CDK4蛋白的表达量;采用CCK8检测4组细胞的增殖能力;采用流式细胞术检测4组细胞周期情况。结果荧光素酶报告基因分析验证miR-15b-5p能够与CDK4 m RNA 3’UTR结合。与阴性对照组相比,mimics组miR-15b-5p表达显著增加(t=25.01,P <0.000 1),CDK4的蛋白表达水平降低,细胞增殖能力降低,细胞G1期比例增高。而与inhibitor nc组相比,inhibitor组miR-15b-5p表达减少,CDK4表达水平升高,细胞增殖能力增强,细胞G1期比例降低。结论miR-15b-5p能够靶向抑制CDK4的表达,造成肿瘤细胞发生G1期阻滞,从而有效抑制脉络膜黑色素瘤细胞增殖。

LncRNA SLC16A1-AS1通过靶向miR-15a-5p负向调控子宫颈癌细胞的增殖和侵袭

目的探讨LncRNA SLC16A1-AS1通过靶向miR-15a-5p调控子宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用机制。方法采用qRT-PCR法检测SLC16A1-AS1在子宫颈癌组织、癌旁组织、人正常子宫颈上皮细胞(H8)及子宫颈癌细胞株(HeLa、HCC94、SiHa、C33A)中的表达水平。选择SLC16A1-AS1表达最少的子宫颈癌细胞株,分别转染阴性质粒和SLC16A1-AS1过表达质粒,标记为NC组和SLC16A1-AS1组。应用MTT法和Transwell实验分别检测过表达SLC16A1-AS1对子宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的影响。生物信息学网站预测及双荧光素酶报告基因实验,验证SLC16A1-AS1与靶基因的靶向关系。qRT-PCR和Western blot法检测靶基因及相关蛋白的表达。结果子宫颈癌组织中SLC16A1-AS1的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.01)。与H8细胞相比,HeLa、HCC94、SiHa、C33A细胞中SLC16A1-AS1的表达水平降低(P<0.05)。与NC组相比,过表达SLC16A1-AS1的C33A细胞增殖能力降低(P<0.05),过表达SLC16A1-AS1的C33A细胞侵袭数下降(P<0.01)。生物信息学网站预测显示,SLC16A1-AS1可与miR-15a-5p有特异性结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果证实SLC16A1-AS1可与miR-15a-5p直接结合(P<0.01)。SLC16A1-AS1可负向调控miR-15a-5p的表达(P<0.01)。与NC组相比,SLC16A1-AS1组细胞增殖表型蛋白(如PCNA、Ki-67)和细胞侵袭表型蛋白(如N-cadherin、Slug)表达均降低。结论SLC16A1-AS1在子宫颈癌中低表达,SLC16A1-AS1通过靶向下调miR-15a-5p的表达,抑制子宫颈癌细胞C33A的增殖和侵袭。

LncRNA HOXC-AS3通过miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞的增殖和迁移

背景与目的:胃癌是一种发病率和死亡率均较高的恶性肿瘤。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类具有调控功能的大分子非编码RNA,在胃癌的转移中发挥着重要的作用。探讨lncRNA HOXC-AS3(lnc-HOXC-AS3)在胃癌中的表达模式,以及通过miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞增殖和转移的分子机制。方法:根据生物信息学分析的方法寻找收集2017年4月—2018年12月安徽医科大学第一附属医院收治并经病理学检查诊断为胃癌的90例患者的胃癌组织中异常表达的lncRNA,并且利用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测lnc-HOXC-AS3的表达水平;在对lnc-HOXC-AS3功能的研究中,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和transwell等方法确定了lnc-HOXC-AS3对胃癌细胞(MGC803)增殖和迁移的影响;在机制上,采用双荧光素酶报告基因检测lnc-HOXC-AS3、miR-15b-5p和E2F3的靶向调控关系。结果:Lnc-HOXC-AS3在胃癌组织和胃癌细胞系中异常高表达。功能上,lnc-HOXC-AS3促进胃癌细胞增殖和迁移,相反,敲低lnc-HOXC-AS3则明显抑制胃癌细胞增殖和迁移。在机制的探讨中,通过双荧光素酶报告基因和一系列体外实验证实lnc-HOXC-AS3通过靶向下调miR-15b-5p的表达,进而解除miR-15b-5p对E2F3的抑制作用,促进了胃癌细胞增殖和迁移。结论:Lnc-HOXC-AS3在胃癌中异常高表达,并通过调控miR-15b-5p/E2F3生物学轴促进胃癌细胞增殖和迁移,渴望成为研究胃癌早期诊断和治疗的靶点。

利多卡因调控miR-15a-5p对肝癌细胞生物学功能的影响及其机制

目的探讨利多卡因对肝癌细胞凋亡、迁移和侵袭的影响及其机制。方法使用不同浓度利多卡因作用于肝癌细胞HepG2,正常培养的HepG2细胞为对照组。流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹法(Western blot)检测B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)蛋白表达,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭,qPCR检测细胞中miR-15a-5p表达。在细胞中转染miR-15a-5p、anti-miR-15a-5p及各自阴性对照的转染并使用0.1 mmol/L利多卡因处理细胞,观察其对HepG2细胞凋亡、迁移、侵袭的影响。结果与对照组相比,0.01、0.1和1 mmol/L利多卡因增加细胞凋亡率和Bax蛋白表达量(P<0.05),降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05)。0.1 mmol/L利多卡因明显降低迁移细胞数、侵袭细胞数和MMP-2蛋白表达量(P<0.05),升高E-cadherin蛋白水平和miR-15a-5p表达量(P<0.05)。过表达miR-15a-5p增加细胞凋亡率、Bax和E-cadherin蛋白表达量(P<0.05),减少迁移细胞数、侵袭细胞数、Bcl-2和MMP-2蛋白表达量(P<0.05)。结论利多卡因通过调控miR-15a-5p表达抑制肝癌细胞迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡。