疏风解毒胶囊经miR-155/JAK1-STAT1信号通路发挥对甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠的保护作用

目的:探讨疏风解毒胶囊(SFJDC)是否通过调控微小RNA-155(miR-155)/Janus激酶1(JAK1)-信号转导及转录激活因子1(STAT1)信号通路而保护甲型流感病毒H1N1肺炎模型小鼠。方法:实验分组为对照组、模型组、低剂量SFJDC组、高剂量SFJDC组和SFJDC+miR-155 siRNA组,每组10只。除对照组外,其余各组以15×LD50流感病毒液鼻滴感染小鼠,每只0.035 mL,对照组鼻滴等体积蒸馏水。感染当天起,低、高剂量SFJDC组分别灌胃0.1和0.5 g/(kg·d)SFJDC,SFJDC+miR-155 siRNA组灌胃0.5 g/(kg·d)SFJDC+尾静脉注射miR-155 siRNA,对照组和模型组灌胃等体积蒸馏水,每天1次,连续5 d。计算小鼠肺指数;HE染色检测肺组织病理情况;ELISA检测肺组织中转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;实时荧光定量PCR检测肺组织中miR-155水平;蛋白免疫印迹检测肺组织中JAK1、p-JAK1、STAT1和p-STAT1蛋白水平。结果:模型组小鼠肺结构消失,肺泡出现明显断裂、融合、渗出,肺间质出现明显炎症浸润、充血现象;随着SFJDC剂量的升高,肺泡断裂现象减少,肺泡融合和肺间质炎症浸润现象减轻。与对照组相比,模型组肺指数,肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平,以及p-JAK1/JAK1和p-STAT1/STAT1比值均显著升高(P<0.05),肺组织中miR-155水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,低、高剂量SFJDC组肺指数,肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平,以及p-JAK1/JAK1和p-STAT1/STAT1比值均显著降低(P<0.05),肺组织中miR-155水平显著升高(P<0.05);随着SFJDC剂量的升高,肺指数,肺组织中TGF-β、IL-6和TNF-α水平,以及p-JAK1/JAK1和p-STAT1/STAT1比值逐渐降低(P<0.05),肺组织中miR-155水平逐渐升高(P<0.05),呈剂量依赖效应;使用miR-155 siRNA下调miR-155表达可减弱高剂量SFJDC对以上指标的影响。结论:SFJDC能够通过升高miR-155而抑制JAK1-STAT1炎症通路活化,从而实现对甲型流感病毒H1N1肺炎小鼠的保护作用。

缺氧诱导因子-1α通过miR-126/JAK2-STAT3轴调控慢性肾病小鼠肾纤维化

目的:探究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)通过miR-126/JAK2-STAT3轴促进慢性肾病小鼠肾纤维化的分子机制。方法:选取8周龄雄性C57/BL6小鼠,分为假手术组、模型组、HIF-1αmimic组、miR-126 mimic组、HIF-1α+miR mimic组、WP1066组、miR-126 mimic+WP1066组;用全自动生化仪检测小鼠肾24 h尿蛋白、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平,qRT-PCR检测肾组织内miR-126相对表达量,免疫印迹检测肾组织内HIF-α,肾纤维化关键蛋白fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA,JAK2/STAT3信号通路关键蛋白表达;Masson染色分析小鼠肾病理形态及间质纤维化程度。结果:模型组模型建立后miR-126表达受到抑制,差异有统计学意义。与假手术组相比,模型组小鼠24 h尿蛋白、BUN、SCr水平均上调,肾组织肾小管、间质结构紊乱,肾纤维化明显,fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA、p-JAK2、p-STAT3表达上调;HIF-1α过表达进一步上调24 h尿蛋白、BUN、SCr、fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA、p-JAK2、p-STAT3表达;miR-126过表达下调24 h尿蛋白、BUN、SCr、fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA、p-JAK2、p-STAT3表达;HIF-1α过表达可以逆转miR-126过表达抑制肾纤维化的趋势,差异有统计学意义。与模型组相比,JAK2/STAT3信号通路被阻断后,p-JAK2、p-STAT3、fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA表达明显下调,miR-126的过表达可以进一步下调小鼠肾组织内p-JAK2、p-STAT3、fibronectin、collagen-Ⅰ、α-SMA表达,差异有统计学意义。结论:小鼠肾纤维化促进肾组织内HIF-1α高表达,HIF-1α通过抑制miR-126提升JAK2-STAT3信号通路活性,最终促进肾纤维化进展。

基于PTPN22干扰的艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞JAK1-STAT4信号通路的影响

目的:研究艾灸对实验性类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大耳白兔滑膜组织非受体22型蛋白酪氨酸磷酸酶基因(protein tyrosine phosphatase,nonreceptor type 22,PTPN22)、JAK1及STAT4表达的影响,探索慢病毒介导的PTPN22干扰对艾灸治疗实验性RA大耳白兔滑膜细胞JAK1-STAT4信号通路的影响。方法:日本大耳白兔随机分为对照组、模型组、艾灸组、PTPN22干扰组,6只/组。将FCA按0.5 mL/kg注入模型组、艾灸组及PTPN22干扰组动物双后腿膝关节腔内造模,对照组同法注入无菌生理盐水。将慢病毒介导的PTPN22 RNAi作为干预手段,艾灸组及PTPN22干扰组动物双侧“肾俞”“足三里”穴进行小艾炷灸治疗。治疗前后测量各大耳白兔左、右膝关节周长,治疗第21天行滑膜取材,采用RT-PCR法检测滑膜组织PTPN22 mRNA、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA表达;采用Western blot法检测滑膜组织PTPN22蛋白表达情况。结果:与对照组相比,模型组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达升高(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达降低(P<0.05);与模型组相比,艾灸组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达降低(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达升高(P<0.05);与艾灸组相比,PTPN22干扰组大耳白兔双膝关节周长、JAK1 mRNA及STAT4 mRNA的表达升高(P<0.05),PTPN22 mRNA及蛋白的表达降低(P<0.05)。结论:艾灸可能通过PTPN22途径良性调控RA中JAK-STAT通路异常激活的JAK1与STAT4基因表达水平,负向调节JAK1-STAT4信号通路而达到抗炎治疗效应,其对JAK1-STAT4信号通路的调控可能是艾灸治疗RA抗炎效应实现的途径之一。

Th1/Th2免疫平衡偏移介导JAK2-STAT3信号通路参与感染性早产发生机制研究

目的:探讨Th1/Th2免疫平衡偏移情况及JAK2-STAT3信号通路参与感染性早产发生机制。方法:选取就诊于大理大学第一附属医院的60例早产患者为研究对象(早产组),根据产后胎膜组织病理检查结果分为感染性早产组和非感染性早产组,选取同期正常足月分娩的产妇20例为正常对照(正常对照组)。采用酶联免疫吸附测定试剂盒检测各产妇外周血清中干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平,并计算Th1/Th2免疫调节平衡指数;采用免疫组织化学染色法检测胎膜组织中信号转导及转录激活因子3(STAT3)、核因子κB(NF-κB)蛋白的表达情况。结果:IFN-γ、TNF-α表达水平在早产组中显著升高(P<0.05),尤其是在感染性早产组中升高更明显,Th1/Th2免疫平衡具有明显向Th1方向偏移趋势;IL-6表达水平、STAT3及NF-κB蛋白表达水平在感染性早产组中显著升高(P<0.05),非感染性早产组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Th1/Th2免疫平衡可通过TNF-α、NF-κB、IL-6、JAK2-STAT3信号通路参与感染性早产的发生。

miR-155-5p调控Ndfip1表达影响乳腺癌细胞恶性生物学行为及相关机制研究

目的:探究miR-155-5p靶向调控Ndfip1影响乳腺癌细胞增殖、凋亡、侵袭与迁移改变及相关机制。方法:实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测本院25例有明确病理诊断的乳腺癌及对应的癌旁正常组织中miR-155-5p及Ndfip1基因表达量。选取MCF-7细胞,构建Control组、NC-inhibitor组、miR-155-5p inhibitor组、miR-155-5p inhibitor+si-NC组、miR-155-5p inhibitor+si-Ndfip1组细胞,CCK8实验、流式细胞仪、Transwell实验、划痕愈合实验分别检测细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移能力改变,Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达。Targetscan生物信息学网站预测miR-155-5p下游靶基因,双荧光素酶实验检测miR-155-5p与靶基因Ndfip1相关性。结果:与癌旁正常组织相比,miR-155-5p在乳腺癌组织中的基因表达量显著升高(P<0.05),Ndfip1在乳腺癌组织中的基因表达量明显降低(P<0.05),且乳腺癌组织中miR-155-5p和Ndfip1表达呈负相关(r=-0.969 8,P<0.001)。与Control组及NC-inhibitor组相比,miR-155-5p inhibitor组细胞增殖、侵袭及迁移能力均降低(P<0.05),细胞凋亡数量增多(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达量降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测证明Ndfip1是miR-155-5p的靶标。回复实验检测得出,与miR-155-5p inhibitor组及miR-155-5p inhibitor+si-NC组相比,miR-155-5p inhibitor+si-Ndfip1组细胞增殖、侵袭及迁移能力均明显提升(P<0.05),细胞凋亡数量减少(P<0.05),p-PI3K和p-AKT蛋白表达量增高(P<0.05)。结论:miR-155-5p靶向调控Ndfip1影响乳腺癌MCF-7细胞恶性生物学行为改变,这种改变可能与PI3K/AKT信号通路蛋白表达相关。

JAK_2-STAT_3信号通路在白介素-1β经动脉外膜给药致平滑肌细胞增殖迁移中的作用

目的研究白细胞介素-1β经血管外膜给药导致动脉平滑肌细胞发生的改变及其与JAK2-STAT3信号通路的关系,明确JAK2-STAT3信号通路在血管增殖性病变中的作用。方法 6～8周龄SD雄性大鼠24只,分离左侧颈总动脉,实验组(n=18)血管外膜包裹含白介素-1β2.5μg的琼脂缓释悬液,对照组(n=6)包裹不含白介素的琼脂悬液,术后2、8、24、48 h,1、2周分别处死实验组大鼠3只,对照组1只,血管标本经切片HE染色观察形态,Western blot法检测JAK2、STAT3、磷酸化JAK2以及磷酸化STAT3的表达,免疫组化标记定位磷酸化JAK2及磷酸化STAT3;另取SD雄性大鼠9只,分离两侧颈总动脉,左侧滴加JAK2抑制剂AG490缓释凝胶,右侧滴加等量空白凝胶后两侧均包裹等量白介素-1β,术后8、48 h,1周处死动物分别行HE染色及Western blot检测。结果白介素-1β包裹血管外膜后出现血管平滑肌细胞的增殖、迁移,通道蛋白JAK2、STAT3在不同时间点出现不同程度的磷酸化,经Western blot检测并行灰度分析,p-JAK2相对灰度值对照组(0.337±0.216),8 h组(1.764±0.513),1周组(0.451±0.229);p-STAT3相对灰度值对照组(0.125±0.870),24 h组(1.909±0.309),2周组(0.448±0.516),各组间有明显差异(P<0.05)。加用抑制剂后,8 h组p-JAK2相对灰度值实验侧(0.085±0.031),对照侧(1.416±0.468),48 h组p-STAT3相对灰度值实验侧(0.460±0.065),对照侧(2.425±0.638),提示JAK2、STAT3的磷酸化水平被明显抑制(P<0.05),平滑肌细胞变化程度下降。结论炎性因子白细胞介素-1β经动脉外膜给药可致动脉平滑肌细胞增殖、迁移,这种改变与JAK2-STAT3信号通路有直接关系。

生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭迁移及与JAK2-STAT3通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭转移及上皮-间质转化(EMT)的影响,并阐述其与JAK2-STAT3信号通路相关蛋白的关系。方法:实时荧光定量PCR法(qPCR)以及蛋白质印迹法(WB)检测CNE2细胞中Per1基因及蛋白水平;构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体并转染CNE2细胞;实验分为过表达组(Per1-OE)、过表达对照组(Per1-OENC)、干扰组(Per1-sh)、干扰对照组(Per1-shNC);利用划痕愈合、Transwell实验检测Per1基因对各组细胞侵袭、迁移能力;WB检测Per1基因对EMT相关蛋白:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的影响;WB检测Per1基因对JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。结果:WB和PCR结果显示:与人永生化鼻咽上皮细胞NP69相比,Per1在鼻咽癌细胞CNE2中表达降低。通过构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体,有效地上调和下调了CNE2中Per1在转录及蛋白水平的表达,并分别成功筛选出稳转细胞株。划痕实验结果显示:Per1-OE组较Per1-OENC组24 h、48 h细胞迁移率均明显下降(P=0.04,P=0.01),Per1-sh组较Per1-shNC组24 h、48 h细胞迁移率均明显升高(P=0.01,P=0.005)。Transwell实验结果显示:Per1-sh组较Per1-shNC组穿过Transwell小室细胞数明显增加(P=0.02),Per1-OE组较Per1-OENC组穿过Transwell小室细胞数明显减少(P=0.001)。WB结果显示:JAK2、p-JAK2、STAT3蛋白在各组细胞中表达无统计学差异(P>0.05)。Per1-sh组较Per1-shNC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达下降,E-cadherin表达升高(P<0.05),Per1-OE组较Per1-OENC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达均升高,E-cadherin表达下降(P<0.05)。结论:过表达Per1基因后可抑制鼻咽癌细胞CNE2侵袭、迁移,使N-cadherin、Vimentin、p-STAT3蛋白表达下降,E-cadherin表达增加;干扰Per1基因后则相反,进而表明Per1基因在鼻咽癌细胞CNE2中可能扮演着抑癌基因的角色;同时我们推测Per1基因与p-STAT3的表达有一定的相关性,但其具体作用机制有待进一步研究。

TM4SF1与肺癌细胞JAK2-STAT3信号通路相互作用机制及其在NSCLC中的表达

目的:探讨四次跨膜蛋白1(four transmembrane protein 1,TM4SF1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达情况及其与NSCLC患者临床病理特征之间的关系。构建高表达TM4SF1的慢病毒表达载体稳定转染肺癌A549细胞,研究TM4SF1与肺癌细胞JAK2-STAT3信号通路的相互作用机制。方法:收集61例NSCLC患者手术切除的癌组织、相应配对的癌旁组织及因良性肺部疾病切除的正常肺组织10例。采用qRT-PCR及Western blot检测NSCLC组织、癌旁组织及正常肺组织中TM4SF1的表达水平。利用慢病毒转染技术在肺癌A549细胞中高表达TM4SF1基因,应用q RT-PCR及Western blot分析TM4SF1基因及JAK2-STAT3信号通路下游Sox2基因的表达水平,采用Transwell检测TM4SF1高表达对A549迁移的影响。结果:癌组织中TM4SF1 mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)及正常肺组织(P<0.05);TM4SF1的表达与患者年龄及性别无明显关联,与肿块的大小、分化程度、淋巴结转移、临床分期相关(P<0.05)。成功在肺癌细胞株中高表达TM4SF1,高表达TM4SF1后对A549细胞的迁移能力明显增强,并且上调JAK2-STAT3信号通路下游Sox2表达水平。结论:TM4SF1在NSCLC中呈现高表达,过表达该基因可以促进A549细胞的迁移并且上调JAK2-STAT3信号通路下游Sox2表达水平。TM4SF1可能通过该通路促进NSCLC的发生发展及远处转移,TM4SF1可能成为NSCLC的潜在治疗靶点。

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞MALAT1表达降低、 hsa-miR155-3p表达增加并参与Notch信号通路调节

目的观察类风湿性关节炎(RA)患者长链非编码RNA(lncRNA)转移相关肺腺癌转录本1(MALAT1)、hsa-miR155-3p表达及其与Notch信号通路关系,探讨RA可能发病机制。方法采取RA患者(RA组)、健康对照者(NC组)外周血,采用高通量基因测序筛选差异表达的lncRNA和mRNA。利用反转录PCR检测筛选的lncRNA MALAT1和hsa-miR155-3p及Notch信号通路受体配体表达。结果通过lncRNA测序分析发现,共有9158条差异表达的lncRNA。基因本体(GO)功能分类注释得出差异表达的mRNA参与免疫炎症反应、细胞转录调节等。通过通路(pathway)分析显示差异表达的mRNA与免疫炎症、应激、Notch通路等功能基因变化有关。经顺式(Cis)和反式(Trans)预测,Jagged1/2、Delta1/2、Notch1/2可能与RA发生密切相关。与NC组相比,RA组MALAT1降低,hsa-miR155-3p明显升高;Notch通路配体Delta1、Delta2、Jagged1、Jagged2及受体Notch1、Notch2表达升高。相关性分析显示,hsa-miR155-3p与MALAT1呈负相关,hsa-miR155-3p与Notch通路Delta1、Jagged1呈正相关,MALAT1与Jagged2呈负相关。结论RA患者lncRNA MALAT1降低、hsa-miR155-3p增加,共同调节Notch信号通路变化。

下调miR-155通过抑制HIF-1α/VEGF通路增强人结直肠癌细胞的放射敏感性

目的:探讨miR-155对结直肠癌细胞SW620放射敏感性的影响及其特异性的作用机制。方法:将anti-miRNA-155和anti-miRNA-155 NC转染至结直肠癌细胞SW620,分别标记为anti-miR-155组和NC组;利用qRT-PCR检测细胞转染效率;对转染后的细胞进行电离辐射;经过电离辐射后采用克隆形成实验评估SW620细胞放射生物学参数;采用CCK8、细胞划痕、Transwell侵袭和流式细胞术分别检测SW620的增殖、迁移、侵袭和凋亡情况;双荧光素酶报告试验检测HIF-1α和miR-155的靶向关系;Western blotting检测HIF-1α、VEGF的表达水平。结果:转染anti-miRNA-155后,miRNA-155的表达量明显减少。与NC组比较,anti-miR-155组中SW620细胞的放射敏感性显著增加(P<0.05)。抑制miR-155的表达显著降低结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力(P<0.05),而细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。miRNA-155靶向调控HIF-1α。下调miRNA-155显著降低HIF-1α和VEGF的蛋白表达水平。结论:miR-155的下调能够增加结直肠癌细胞的放射敏感性,其作用机制可能是通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路来实现。

复方西羚解毒胶囊调控JAK2-STAT3信号通路抗H1N1病毒感染作用

目的:研究复方西羚解毒胶囊抗H1N1病毒感染作用,并探讨其初步作用机制。方法:建模给药后,解剖,测定小鼠肺指数,肺病毒载量,肺组织病理变化,血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)细胞因子分泌水平,肺泡巨噬细胞分型及眼球血CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比例,检测JAK2-STAT3信号通路相关基因mRNA和蛋白表达。结果:与模型组比较,复方西羚解毒胶囊高、中剂量组可显著降低小鼠肺指数(P<0.01),抑制H1N1病毒的复制载量(P<0.01,P<0.05),减轻肺组织病理状况,显著降低TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌(P<0.05,P<0.01),显著升高肺泡巨噬细胞M2抗炎表型的比例(P<0.01),降低外周血CD4^(+)/CD8^(+)T细胞比例(P<0.01),降低IFN-β、JAK2、STAT3、OAS1 mRNA表达(P<0.01,P<0.05),降低p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达(P<0.01)。结论:复方西羚解毒胶囊对H1N1病毒感染具有显著的治疗效果,这可能是通过调节JAK2-STAT3信号通路发挥炎性控制和免疫调节作用实现的。

白头翁汤治疗溃疡性结肠炎的信号通路机制分析

溃疡性结肠炎(UC)是一种反复发作的炎症性肠病。目前研究认为,其发病与肠道上皮屏障缺陷、肠道菌群失调、免疫应答失调及遗传等因素密切相关。白头翁汤治疗UC具有一定的疗效。白头翁汤及其加减方可通过多种信号通路减少促炎细胞因子的表达,增加机体抗炎因子,促进肠上皮细胞增殖以加速肠上皮修复,保护肠道黏液屏障,减轻肠道炎症反应,从而减少肠上皮细胞异常增殖,避免“炎-癌”的发生。

miR-155对兔鼻窦炎骨质重塑和Notch-1及DLL4的影响

目的探讨miR-155对鼻窦炎模型兔Notch-1信号通路及鼻窦骨质重塑的影响。方法将32只兔随机分为假手术组、模型组、miR-155 antagomir组、miR-155 antagomir阴性对照组,除假手术组外,其余各组构建鼻窦炎模型。建模同时,药物处理组兔尾静脉注射miR-155 antagomir、miR-155 antagomir阴性对照,假手术组和模型组兔尾静脉注射等量生理盐水,给药结束24 h后对兔鼻部症状进行评分,然后处死,苏木精-伊红(HE)染色法检测各组兔鼻窦黏膜病理变化情况,并进行炎症评分,CT扫描及碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测兔鼻窦骨壁结构骨质重塑活性并进行评分;酶联免疫吸附法(ELISA)检测兔血清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、骨保护素(OPG)、核因子κβ受体活化因子配体(RANKL)水平;实时荧光定量PCR检测鼻窦组织中miR-155及Notch信号通路相关因子mRNA水平;采用免疫印迹法检测鼻窦组织中Notch信号通路相关因子蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组兔鼻部症状评分、鼻窦黏膜炎症评分,鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分,血清TNF-α、IL-6、OPG及RANKL水平,鼻窦组织miR-155表达水平,Notch-1和DLL4 mRNA及蛋白表达水平均升高(P均<0.05)。与模型组比较,miR-155 antagomir组兔鼻部症状评分,鼻窦黏膜炎症评分,鼻窦骨壁结构骨质重塑活性评分,血清TNF-α、IL-6、OPG及RANKL水平,鼻窦组织miR-155表达水平,Notch-1和DLL4 mRNA及蛋白表达水平均降低(P均<0.05);miR-155antagomir阴性对照组各指标均无明显变化(P均>0.05)。结论下调miR-155表达可抑制Notch-1信号通路激活,降低炎性因子及OPG、RANKL表达,减轻炎性反应,减弱鼻窦骨质重塑,改善鼻窦炎症状。

miR-1-5p修饰脐带间充质干细胞治疗MRL/lpr狼疮小鼠的作用

背景:大量研究表明间充质干细胞能够通过多种免疫调节途径治疗自身免疫性疾病,基因修饰可能提高间充质干细胞的治疗潜力。miR-1-5p在系统性红斑狼疮中呈低表达,过表达miR-1-5p的间充质干细胞可能对系统性红斑狼疮具有治疗作用。目的:探讨miR-1-5p修饰的脐带间充质干细胞是否介导JAK2/STAT3通路对系统性红斑狼疮MRL/lpr模型小鼠存在治疗作用。方法:将20只MRL/lpr狼疮小鼠随机分为miR-1-5p转染脐带间充质干细胞治疗组(UC-MSCs+miR-1-5p组)、miRNA阴性对照转染脐带间充质干细胞治疗组(UC-MSCs+miR-NC组)、脐带间充质干细胞治疗组(UC-MSCs组)、PBS治疗组(PBS组)、MRL/lpr狼疮小鼠未处理组(对照组)。以尾静脉移植的方式治疗MRL/lpr狼疮小鼠,每周1次,治疗5次。结束治疗后间隔1周处死小鼠,苏木精-伊红染色观察各组MRL/lpr小鼠肝组织和肠组织的病理变化;Western blot法检测各组小鼠肾组织JAK2/STAT3通路蛋白及其磷酸化水平和白细胞介素18的表达水平。结果与结论:(1)与对照组相比,UC-MSCs+miR-1-5p组、UC-MSCs+miR-NC组和UC-MSCs组MRL/lpr小鼠肝组织中炎性细胞浸润明显减少,UCMSCs+miR-NC组可见肝细胞水肿变性;UC-MSCs+miR-1-5p组MRL/lpr小鼠肠组织中杯状细胞明显增多,其余各组差异不显著。(2)与对照组相比,UC-MSCs+miR-1-5p组狼疮小鼠肾组织中p-JAK2(Y1007+Y1008)、p-STAT3(s727)、白细胞介素18的表达水平显著下调(P <0.05);UC-MSCs组狼疮小鼠肾组织中p-STAT3(s727)(P <0.05)、白细胞介素18 (P <0.01)显著下调;UC-MSCs+miR-NC组白细胞介素18的表达水平显著下调(P <0.05);各组狼疮小鼠肾组织中p-STAT3(Y705)的表达差异无显著性意义(P> 0.05)。与PBS组相比,UC-MSCs组白细胞介素18表达明显下调(P <0.05)。(3)结果表明,miR-1-5p修饰的脐带间充质干细胞可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活和白细胞介素18的表达来缓解MRL/lpr小鼠肝肠损害,从而对狼疮小鼠起到一定的治疗作用。

miR-31对小鼠大脑中动脉闭塞后神经元炎症反应以及氧化应激损伤的影响

目的探讨星状胶质细胞内miR-31调控PKD1基因表达并抑制JAK-STAT3信号通路活化介导缺血性脑卒中小鼠的炎症反应以及神经元氧化应激损伤的保护机制。方法将雄性C57BL/6J小鼠60只构建大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,分组为:MCAO组、miR-31 mimic MCAO组、miR-31 inhibitor MCAO组、si-PKD1 MCAO组,并设Control组和Sham组。TTC染色计算脑梗死体积;Nissl染色检测神经元缺失;免疫荧光法检测GFAP和PKD1蛋白表达;TUNEL法检测细胞凋亡;MTT检测神经元存活率;乳酸脱氢酶(LDH)漏出率测定神经元细胞损伤;免疫荧光法检测4-HNE和8-HOdG表达;TBA法检测MDA含量;黄嘌呤氧化酶法检测SOD含量;ELISA检测炎症因子;qRT-PCR检测miR-31和PKD1的表达;Western blot检测PKD1及JAK-STAT3通路相关蛋白表达。结果与MCAO组相比,miR-31 inhibitor MCAO组神经功能评分,梗死体积,神经元缺失,凋亡率,cleaved Caspase-3和Bax的表达,4-HNE和8-OHd G免疫染色强度,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α,MDA含量,PKD1表达均显著升高,SOD表达量降低(均P<0.05);miR-31 mimic MCAO组和si-PKD1 MCAO组神经功能评分,梗死体积,神经元缺失,凋亡率,cleaved Caspase-3和Bax的表达,4-HNE和8-OHd G免疫染色强度,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α,MAD含量,PKD1表达均显著降低,SOD表达量上升(均P<0.05);在MCAO小鼠的星状胶质细胞内,miR-31呈低表达,PKD1呈高表达,JAK-STAT3通路呈激活状态。结论MCAO小鼠的星状胶质细胞内miR-31靶向下调PKD1基因抑制JAK/STAT3信号通路,降低炎症反应,从而减轻MCAO神经元氧化应激损伤。

OGD模型乳小鼠的星状胶质细胞内miR-31对共培养神经元氧化应激损伤的影响

目的探究氧-糖剥夺(OGD)模型乳小鼠的星状胶质细胞内miR-31调控PKD1基因表达,进而抑制JAK-STAT3信号通路活化介导的OGD共培养神经元炎症反应以及氧化应激损伤的保护机制.方法提取乳小鼠原代星状胶质细胞和神经元,流式细胞仪分选纯化,之后将星状胶质细胞分别转染miR-31 mimic、miR-31 inhibitor、si-PKD1或加入JAK-STAT3通路抑制剂;构建OGD模型将转染后的星状胶质细胞与神经元共培养,并分为七组:normal组,blank OGD组,NC OGD组,miR-31 mimic OGD组,miR-31 inhibitor OGD组,si-PKD1 OGD组,si-PKD1+CdCl_(2)OGD组.MTT法检测OGD共培养体系中神经元存活率;LDH漏出率测定OGD共培养体系中神经元细胞损伤;TUNEL法检测OGD共培养体系中神经元凋亡;免疫荧光法检测OGD共培养体系中氧化应激损伤相关蛋白4-HNE和8-OHdG表达;TBA法检测OGD共培养体系中MDA含量;黄嘌呤氧化酶法检测OGD共培养体系中SOD含量;ELISA检测OGD共培养体系中炎症因子;qRT-PCR检测OGD共培养体系中miR-31和PKD1的表达;Western blot检测OGD共培养体系中PKD1及JAK-STAT3通路相关蛋白表达.结果OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控炎症反应结果显示:与blank组和NC组相比,miR-31 mimic组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著降低(均P<0.05),miR-31 inhibitor组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达量显著上升(均P<0.05).与blank组和NC组相比,miR-31 mimic组神经元存活率上升,LDH漏出率、ROS表达量显著降低(均P<0.05),miR-31 inhibitor组神经元存活率显著降低,LDH漏出率和ROS表达量显著升高(均P<0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控对神经元的活性的影响结果显示:与单独培养(Neuron组)相比,共培养条件下神经元(Neuron+astrocytes)的增殖及存活率、LDH表达及凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05);与神经元组(Neuron组)相比,神经元OGD模型组(Neuron OGD组)细胞增殖及存活率减少,培养液中LDH表达增加,细胞凋亡率增加(均P<0.05);与神经元OGD模型(Neuron OGD组)相比,神经元+星状胶质细胞OGD组(Neuron+astrocytes OGD)细胞存活率减少,培养液中LDH表达增加,细胞凋亡率增加(均P<0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1各组细胞中mRNA、蛋白表达水平及炎症因子表达结果显示:相比于normal组,blank OGD组的星状胶质细胞中miR-31的表达量下降(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升(P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调(P<0.05);相比于blank OGD组,miR-31 mimic OGD组星状胶质细胞中miR-31的表达量上调(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低(P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调(P<0.05);miR-31 inhibitor OGD组miR-31的表达量下降(P<0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著上升(均P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量上调(P<0.05);si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组miR-31的表达量无显著变化(P>0.05),而PKD1表达和p-STAT3/STAT3显著降低(均P<0.05),炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达量下调(P<0.05);NC OGD组各指标差异无统计学意义(均P>0.05);OGD模型乳小鼠星状胶质细胞miR-31调控PKD1基因抑制OGD导致的神经元氧化应激损伤结果显示:相比于normal组,blank OGD组LDH和MDA表达量上升,SOD表达下降,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强,神经元存活率降低,神经元出现氧化应激损伤(均P<0.05);与blank OGD组相比,miR-31 inhibitor OGD组LDH漏出量和MDA表达量上升,SOD表达下降,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度增强,神经元存活率降低,细胞凋亡率上升,神经元氧化应激损伤加重(均P<0.05);miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组LDH漏出量和MDA表达量下降,SOD表达上升,神经元膜脂质过氧化损伤标志蛋白4-HNE和DNA氧化损伤标志蛋白8-OHdG免疫染色强度降低,神经元存活率增加,细胞凋亡率下降,神经元氧化应激损伤减缓(均P<0.05);NC OGD组各指标差异无统计学意义(均P>0.05);采用TUNEL染色及Western blot检测OGD共培养体系中神经元凋亡结果显示:相比于normal组,blank OGD组神经元细胞凋亡率及凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、Bax表达显著增加(均P<0.05);与blank OGD组相比,miR-31 inhibitor OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显上升(均P<0.05);miR-31 mimic OGD组、si-PKD1 OGD组和si-PKD1+CdCl_(2)OGD组神经元细胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bax表达明显下调(均P<0.05);NC OGD组各cleaved caspase-3、Bax表达差异无统计学意义(均P>0.05).结论OGD模型乳小鼠星状胶质细胞内miR-31靶向下调PKD1基因,进而通过抑制JAK/STAT3信号通路降低炎症反应,从而减轻OGD神经元氧化应激损伤.

miR-888-5p对非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭能力的促进作用及其机制

目的观察miR-888-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、侵袭能力的影响,并探讨其可能的机制。方法采用实时荧光定量PCR法检测NSCLC细胞系(A549、NCI-H1299、PC-9、LLC、NCI-H1650)及人正常肺上皮细胞系(BEAS-2B)miR-888-5p相对表达量,选择NSCLC细胞系中miR-888-5p相对表达量升高最明显的A549细胞用于后续实验。将A549细胞分为miR-888-5p mimics组、miR-888-5p inhibit组及scramble组,分别转染miR-888-5p mimics、miR-888-5p inhibit、scramble序列。取各组细胞,采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-888-5p相对表达量,MTT法检测培养0、24、48及72 h的细胞增殖能力,Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力(以侵袭细胞数表示)。StarBase在线预测网站预测miR-888-5p的靶基因为Tob1,并经荧光素酶实验进行验证,采用Western blotting法检测细胞Tob1及上皮—间质转化相关指标E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)蛋白相对表达量,并计算p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。结果miR-888-5p mimics组、miR-888-5p inhibit组及scramble组miR-888-5p相对表达量分别为48.9±1.78、1.06±0.24、8.23±0.90,组间两两比较P均<0.05。随着培养时间的延长,三组细胞增殖能力均呈升高趋势;miR-888-5p mimics组、scramble组、miR-888-5p inhibit组同时间点细胞增殖能力、侵袭细胞数依次下降,组间两两比较P均<0.05。miR-888-5p mimics组、scramble组、miR-888-5p inhibit组细胞Tob1、E-cadherin蛋白相对表达量均依次升高,Vimentin蛋白相对表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3均依次降低(P均<0.05)。结论miR-888-5p可增强NSCLC细胞的增殖和侵袭能力,其机制可能与激活JAK2/STAT信号通路、靶向下调Tob1表达从而促进上皮—间质转化有关。

miR-155抑制剂对内毒素血症小鼠肺组织JAK／STATl信号通路的影响

目的探讨microRNA-155（miR．155）抑制剂对内毒素血症小鼠肺脏JAK／STATl信号通路的影响，以及miR-155在内毒素血症诱导肺损伤中的作用。方法120只BALB／c小鼠按随机数字表法分为内毒素血症组（LPS组）、miR-155抑制组（inhibitor＋LPS组）和对照组，每组40只。内毒素血症组腹腔注射LPS20mg／kg；miR-155抑制组尾静脉注射miR-155抑制物80mg／kg24h后，腹腔注射LPS20mg／kg；对照组注射等容量生理盐水。注射LPS6、12、24、48h后，每组各处死10只小鼠，留取肺脏标本。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测肺组织中miR-155、SOCSlmRNA、STATlmRNA表达；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素-10（IL-10）和肿瘤坏死因子-d（TNF-α）含量；苏木素-伊红（HE）染色观察肺组织病理学改变。结果小鼠腹腔注射LPS后，肺组织miR-155表达在24h内呈升高趋势，48h时已下降。LPS组各时间点miR-155表达分别为6h（8．52±1．12）、12h（11．04±0．99）、24h（15．84±0．80）、48h（4．03±2．55）。inhibitor＋LPS组miR-155表达量较LPS组低，12h（t=6．08，P〈0．01）、24h（t=23．64，P〈0．01）差异具有统计学意义。STATlmRNA和SOCSlmRNA表达均在6h最高，后逐渐下降。LPS组STATlmRNA高于inhibitor＋LPS组，6h（t=4．41，P〈0．01）、12h（t=2．69，P〈0．05）、24h（t=5．62，P〈0．01）差异具有统计学意义。inhibitor＋LPS组SOCSlmRNA表达高于LPS组，6h（t=4．55，P〈0．01）、12h（t=4．12，P〈0．01）、24h（t=2．38，P〈0．05）差异具有统计学意义。TNF—α含量于6h最高，IL-10含量于48h最高。LPS组含量高于对照组和inhibitor＋LPS组，6、12、24、48h差异均有统计学意义（P〈0．01）。光镜下观察到inhibitor＋LPS组肺组织病变轻于LPS组。结论miR-155在内毒素血症小鼠肺组织中表达升高，抑制miR-155能下调JAK／STATl信号通路，减轻内毒素血症小鼠肺损伤。

丹皮酚通过下调miR-155/JAK1-STAT1通路抑制巨噬细胞M1极化

探究丹皮酚(paeonol)对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7 M1型极化的影响,并从基因层面探讨该干预作用是否与miR-155的下调及下游JAK1-STAT1通路受抑制有关,进一步为丹皮酚抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的分子机制提供新的思路。实验采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)共刺激24 h建立巨噬细胞M1型极化的模型,丹皮酚在刺激前24 h给予细胞起到预保护作用。CCK-8法检测LPS和IFN-γ共刺激对细胞的损伤作用,流式细胞术检测M1型表面标志物F4/80和CD86的表达,ELISA法检测细胞上清液中炎症因子白介素-6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌,RT-qPCR法检测各组细胞miR-155的表达,Western blot法检测JAK1-STAT1-SOCS1通路上的蛋白表达。结果显示,LPS和IFN-γ在最适浓度下对细胞没有明显损伤作用,但可诱导巨噬细胞向M1极化,使得细胞表面的M1型标志性因子F4/80和CD86高表达,同时导致细胞表面炎症因子IL-6和TNF-α的分泌增多(P<0.05或P<0.01)。丹皮酚可显著降低RAW264.7细胞由LPS和IFN-γ诱导的表面M1型标志物F4/80和CD86的高表达,同时减少了炎症因子IL-6和TNF-α的分泌(P<0.05或P<0.01),降低了miR-155的表达水平,显著下调了JAK1-STAT1的蛋白磷酸化水平,上调SOCS1蛋白表达(P<0.01)。结果表明,丹皮酚通过下调细胞表面标志性因子及细胞分泌的炎症因子,达到抑制巨噬细胞M1型极化的作用,这种作用可能与丹皮酚下调miR-155的表达,抑制JAK1-STAT1通路的活化有关。

麻杏石甘汤通过JAK1/2-STAT1信号通路改善流感病毒感染所致肺组织与结肠组织损伤

该研究基于Janus激酶1/2-信号转导与转录激活子1(Janus kinase 1/2-signal transducer and activator of transcription 1,JAK1/2-STAT1)信号通路探讨麻杏石甘汤改善流感病毒感染小鼠肺组织与结肠组织损伤的免疫机制。采用流感病毒滴鼻法制备流感病毒感染模型,实验设正常组、模型组、奥司他韦组、抗病毒颗粒组、麻杏石甘汤组。经灌胃给药或生理盐水3、7 d后,常规法检测体质量,计算肺指数、脾指数、胸腺指数;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)法观察肺组织、结肠组织的病理变化;酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清炎症因子白细胞介素8(interleukin-8,IL-8)、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法和实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polyme-rase chain reaction,RT-qPCR)法分别检测肺组织、结肠组织中JAK1、JAK2、STAT1、干扰素调节因子9(interferon regulatory factor 9,IRF9)、IFN-γ蛋白和mRNA的表达水平。结果显示,给药3、7 d后,与正常组比较,模型组小鼠体质量、脾指数和胸腺指数显著降低(P<0.05或P<0.01),肺指数显著升高(P<0.01);肺组织充血水肿,大量淋巴细胞及巨噬细胞浸润;结肠黏膜结构不齐,上皮细胞溃疡、脱落,大量炎性细胞浸润;血清炎症因子IFN-γ水平显著升高(P<0.01);肺组织JAK1、JAK2、STAT1、IRF9、IFN-γ蛋白和mRNA的表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01);结肠组织JAK2蛋白表达水平显著升高(P<0.01),STAT1、IRF9蛋白和mRNA的表达水平显著升高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,麻杏石甘汤组小鼠体质量、脾指数和胸腺指数显著升高(P<0.05或P<0.01),肺指数显著降低(P<0.05或P<0.01);肺、结肠组织病理损伤得到显著改善;血清炎症因子IFN-γ水平显著降低(P<0.05或P<0.01);肺组织JAK1、JAK2、STAT1、IRF9、IFN-γ蛋白和mRNA的表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01);结肠组织JAK2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),STAT1、IRF9蛋白和mRNA表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。给药3 d后,模型组小鼠血清炎症因子IL-8水平较正常组显著升高(P<0.01),麻杏石甘汤组小鼠血清炎症因子IL-8水平显著降低(P<0.01)。结果表明,麻杏石甘汤能显著上调体质量、脾指数和胸腺指数,下调肺指数,降低炎症因子IL-8、IFN-γ的水平,下调肺组织JAK1、JAK2、STAT1、IRF9、IFN-γ与结肠组织JAK2、STAT1、IRF9蛋白和mRNA的表达水平,改善肺组织、结肠组织的免疫病理损伤。其可能机制是通过抑制JAK1/2-STAT1信号通路的活化,从而达到减少肺与结肠组织损伤的治疗目的。