健脾祛痰化瘀方调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬防治动脉粥样硬化机制研究

目的探讨健脾祛痰化瘀方调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬防治动脉粥样硬化(atherosclerotic,AS)的机制。方法将40只ApoE小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,8只C57BL/6 Cnc小鼠作为正常组。除正常组给予基础饲料外,其余各组给予高脂饲料。造模12周后,灌胃给药,正常组与模型组给予相应体积的生理盐水,阿托伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组给予相应药物。4周后全自动生物化学分析仪检测血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量;HE染色观察主动脉病理及斑块变化情况;采用透射电镜观察主动脉自噬体超微结构的变化;实时荧光定量Q-PCR法检测miR-155、LC3、Rheb、GAPDHmRNA的表达;采用Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测LC3、Rheb、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR及β-actin蛋白的表达。结果与正常对照组相比,模型组ApoE小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均显著升高,HDL-C水平显著下降(P<0.01);HE染色结果显示模型组小鼠主动脉管腔中斑块面积范围较大、程度较重;电镜结果显示模型组小鼠主动脉超微结构自噬小体增多;模型组ApoEAS小鼠主动脉LC3-I、LC3-II、miR-155 mRNA表达显著下调(P<0.01),Rheb mRNA表达显著升高(P<0.01);模型组ApoEAS小鼠主动脉LC3-II/LC3-I显著下降(P<0.01),Rheb、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K蛋白表达显著升高(P<0.01)。经阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组治疗后,与模型组相比,阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组血清中TG、TC、LDL-C水平均发生显著性降低(P<0.01),HDL-C水平无明显变化趋势;HE染色结果显示阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组小鼠主动脉管腔中斑块面积范围明显减小、程度明显减轻;电镜结果显示阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组小鼠主动脉超微结构显示自噬小体减少;阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组LC3-I、LC3-II、miR-155mRNA表达显著上调(P<0.01或P<0.05),Rheb mRNA表达显著下调(P<0.01或P<0.05);阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组LC3-II/LC3-I表达有所上调(P<0.01或P<0.05),Rheb、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K蛋白表达显著下调(P<0.01或P<0.05)。结论健脾祛痰化瘀方可能通过调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬从而达到防治AS的作用。

miR-155通过抑制靶基因Rheb促进血管内皮细胞自噬

目的研究miR-155抑制Rheb促进血管内皮细胞自噬的机制.方法应用生物信息学方法预测Rheb基因3′UTR区与miR-155的结合位点并通过双荧光素酶报告基因试验进行验证;转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor进入氧化低密度脂蛋白刺激的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),实时荧光定量PCR法检测细胞内miR-155及Rheb mRNA含量,Western印迹法检测细胞中Rheb蛋白含量;电子显微镜观察细胞内自噬情况.结果双荧光素酶报告基因试验验证结果表明,成功预测了miR-155与Rheb基因3′UTR区的结合位点,与对照组相比,miR-155与野生型荧光素酶报告基因共转染可以明显抑制或增强荧光素酶活性(P<0.05).Western印迹检测发现转染miR-155 mimics和miR-155 inhibitor能明显抑制或促进HUVEC内Rheb蛋白的表达(P_(均)<0.05).实时荧光定量PCR检测结果表明,miR-155 mimics组细胞内miR-155明显上升,而miR-155 inhibitor组细胞内miR-155含量明显下降(P_(均)<0.05),miR-155 mimics转染的内皮细胞中Rheb mRNA表达水平明显降低,而miR-155 inhibitor转染的内皮细胞中Rheb mRNA表达水平明显增高.电子显微镜结果显示:miR-155 mimics组能够显著促进脐静脉内皮细胞的自噬活性,miR-155 inhibitor组能够降低内皮细胞自噬活性.结论miR-155通过抑制靶基因Rheb促进血管内皮细胞自噬.