miR-15a/16-1基因敲除小鼠的鉴定及其脾脏免疫细胞频率分析

目的 :探讨mi R-15a/16-1基因敲除小鼠的繁育与子代鼠的鉴定,及其脾脏免疫细胞频率。方法 :从子鼠鼠尾中提取基因组DNA,采用PCR方法进行基因型鉴定。mi R-15a/16-1基因敲除小鼠眼眶取血,用动物血液分析仪进行全血细胞分析。采用流式细胞仪分析mi R-15a/16-1基因敲除小鼠脾脏中免疫细胞频率。结果:mi R-15a/16-1+/+、mi R-15a/16-1+/-、mi R-15a/16-1-/-各表型小鼠互交繁殖结果基本符合孟德尔遗传规律。流式结果显示,mi R-15a/16-1基因敲除小鼠与野生型小鼠相比,CD19+、NKG2D+细胞增多,其余无明显差异。全血细胞分析结果显示淋巴细胞增多。结论:实验所用PCR方法可以鉴定mi R-15a/16-1-/-小鼠;mi R-15a/16-1-/-小鼠的获得为进一步探究mi R-15a/16-1的作用提供了较理想的动物模型;敲除mi R-15a/16-1基因,小鼠脾脏CD19+、NKG2D+细胞增多。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

CCND1基因3'-UTR区miR-15a-5p和miR-16-5p结合位点的荧光素酶报告载体构建及分析

目的:构建miR-15a-5p和miR-16-5p的荧光素酶报告载体,利用此载体分析并验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因3'-UTR区域的确切结合位点,探讨miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的相互作用关系。方法:通过Pubmed和miRBase数据库分别寻找到CCND1基因3'-UTR区域碱基序列和miR-15a-5p、miR-16-5p的碱基序列。找出理论结合位点后,构建荧光素酶报告载体,并用荧光素酶报告基因方法验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因之间的作用关系。结果:通过基因测序表明,本实验成功构建了CCND1a/Ma和CCND1b/Mb荧光素酶报告基因表达载体。将上述载体应用于荧光素酶报告基因实验,结果发现CCND1 b组的荧光素酶表达强度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的3'-UTR区域存在结合位点,其具体结合位置在CCND1b区。这在理论上意味着miR-15a-5p和miR-16-5p可以抑制CCND1基因的表达。

miR-15a和miR-16-1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达及意义

目的研究miR-15a和miR-16-1在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的表达,探讨miR-15a、miR-16-1的表达与DLBCL临床病理特征的关系及其在DLBCL发生发展中的意义。方法采用Real-time RT-PCR方法检测30例DLBCL和10例反应性增生的淋巴结中miR-15a、miR-16-1的表达,并采用免疫组织化学MaxVision两步法检测Bcl-2、Ki-67在DLBCL中的表达。结果 miR-15a、miR-16-1在DLBCL中低表达,30例DL-BCL中有13例表达bcl-2(43.3%),17例Ki-67≥50%(56.7%)。DLBCL中miR-15a、miR-16-1表达水平与Bcl-2蛋白表达、高增殖指数(Ki-67≥50%)呈负相关。结论 miR-15a和miR-16-1低表达的DLBCL患者Ki-67增殖指数高,Bcl-2可能是miR-15a和miR-16-1发挥作用的靶基因。

NKX2-1-AS1介导miR-96-5p/PRDM16轴对未分化甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)NK2同源异形盒1-反义RNA 1(NKX2-1-AS1)介导微RNA(miR)-96-5p/含有PR结构域的蛋白16(PRDM16)轴对未分化甲状腺癌(ATC)细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长的影响。方法基于生物信息学筛选ATC组织及细胞中差异表达的lncRNA NKX2-1-AS1,并进一步筛选其靶基因miR-96-5p和下游靶基因PRDM16。双荧光素酶报告基因实验验证NKX2-1-AS1与miR-96-5p以及miR-96-5p与PRDM16之间的关系。Western blotting检测过表达miR-96-5p对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞PRDM16表达的影响。平板克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验分别检测敲减PRDM16对过表达NKX2-1-AS1的CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响。裸鼠皮下注射CAL-62细胞,观察敲减PRDM16对NKX2-1-AS1过表达的CAL-62细胞移植瘤生长的影响。结果基于生物信息学筛选出参与调节ATC发展的NKX2-1-AS1/miR-96-5p/PRDM16轴。双荧光素酶报告基因实验验证结果显示NKX2-1-AS1与miR-96-5p、miR-96-5p与PRDM16结合。过表达NKX2-1-AS1上调CAL-62细胞中PRDM16蛋白表达;而过表达miR-96-5p可逆转此上调作用。过表达NKX2-1-AS1抑制CAL-62细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长;而敲减PRDM16可逆转此抑制作用。结论NKX2-1-AS1可能作为竞争性内源性RNA与miR-96-5p竞争结合下游靶基因PRDM16,上调PRDM16表达,从而抑制ATC细胞体外增殖、迁移和侵袭以及体内移植瘤生长。

miR-15a/16-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建miR-15a/16-1过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定、滴度测定与感染靶细胞。方法:利用PCR法钓取miR-15a/16-1序列片段;将目的基因miR-15a/16-1克隆到慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定并大量抽提;利用脂质体将重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G共转染293T细胞包装产生慢病毒。收集病毒悬液梯度稀释,感染293T细胞进行病毒滴度检测;将所得慢病毒感染靶细胞。结果:酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为1×109 TU/ml,对照组病毒滴度为2×109 TU/ml。慢病毒成功感染靶细胞,其转染效率可达到80%左右。结论:成功构建miR-15a/16-1慢病毒表达载体,可获得高效miR-15a/16-1的慢病毒颗粒。

重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的构建与表达

目的:构建针对人鼻咽癌CNE-2Z细胞Bcl-2基因pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a真核表达质粒,转染至CNE-2Z细胞并检测其表达。方法:采用PCR法从重组质粒PGH-16-1/15a中获得16-1/15a-X2370G全长序列,在T4DNALigase连接酶作用下连接入重组载体pENTR-CMV-EGFP。重组质粒经酶切及测序鉴定。将构建成功的重组质粒转染入人鼻咽癌细胞株CNE-2Z,用荧光显微镜观察转染结果。结果:重组质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a经酶切与测序证实构建成功,转染至鼻咽癌CNE-2Z细胞后,荧光显微镜观察证实该重组质粒能在CNE-2Z中表达。结论:成功构建真核表达质粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a,并在鼻咽癌CNE-2Z细胞中得到表达,可用于进一步检测其抗肿瘤机制。

LncRNA SLC16A1-AS1通过靶向miR-15a-5p负向调控子宫颈癌细胞的增殖和侵袭

目的探讨LncRNA SLC16A1-AS1通过靶向miR-15a-5p调控子宫颈癌细胞增殖和侵袭的作用机制。方法采用qRT-PCR法检测SLC16A1-AS1在子宫颈癌组织、癌旁组织、人正常子宫颈上皮细胞(H8)及子宫颈癌细胞株(HeLa、HCC94、SiHa、C33A)中的表达水平。选择SLC16A1-AS1表达最少的子宫颈癌细胞株,分别转染阴性质粒和SLC16A1-AS1过表达质粒,标记为NC组和SLC16A1-AS1组。应用MTT法和Transwell实验分别检测过表达SLC16A1-AS1对子宫颈癌细胞增殖和侵袭能力的影响。生物信息学网站预测及双荧光素酶报告基因实验,验证SLC16A1-AS1与靶基因的靶向关系。qRT-PCR和Western blot法检测靶基因及相关蛋白的表达。结果子宫颈癌组织中SLC16A1-AS1的表达水平显著低于癌旁组织(P<0.01)。与H8细胞相比,HeLa、HCC94、SiHa、C33A细胞中SLC16A1-AS1的表达水平降低(P<0.05)。与NC组相比,过表达SLC16A1-AS1的C33A细胞增殖能力降低(P<0.05),过表达SLC16A1-AS1的C33A细胞侵袭数下降(P<0.01)。生物信息学网站预测显示,SLC16A1-AS1可与miR-15a-5p有特异性结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果证实SLC16A1-AS1可与miR-15a-5p直接结合(P<0.01)。SLC16A1-AS1可负向调控miR-15a-5p的表达(P<0.01)。与NC组相比,SLC16A1-AS1组细胞增殖表型蛋白(如PCNA、Ki-67)和细胞侵袭表型蛋白(如N-cadherin、Slug)表达均降低。结论SLC16A1-AS1在子宫颈癌中低表达,SLC16A1-AS1通过靶向下调miR-15a-5p的表达,抑制子宫颈癌细胞C33A的增殖和侵袭。

miR-15a/miR-16-1增强Raji细胞对阿糖胞苷的敏感性

目的探讨miR-15a和miR-16-1寡核苷酸能否增强Raji细胞对阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)的敏感性。方法将化学合成的miR-15a和miR-16-1寡核苷酸利用脂质体2000转染入Raji细胞后,联合Ara-C,CCK8法检测Ara-C的IC50值变化;锥虫蓝细胞计数法检测细胞增殖活性;Hoechst染色观察细胞的凋亡形态;流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染法测凋亡率。结果miR-15a和miR-16-1寡核苷酸转染Raji细胞后,再加入Ara-C,24h Ara-C的IC50值分别为10.41和10.86,明显低于单用Ara-C组(15.43)和随机序列联用Ara-C组(14.92,P<0.05)。锥虫蓝拒染法结果显示,转染后各时间点miR-15a/miR-16-1+Ara-C组较单用miR-15a/miR-16-1组、单用Ara-C组及随机序列+Ara-C组明显抑制了Raji细胞的生长,Hoechst染色可见大量凋亡细胞;流式细胞仪AnnexinⅤ/PI双染色法检测显示,miR-15a+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.93%和25.27%,miR-16-1+Ara-C组早期凋亡率和晚期凋亡率分别为20.69%和23.13%,均明显高于miR-15a组、miR-16-1组、Ara-C组及随机序列+Ara-C组(P<0.05),后四者的早期凋亡率分别为6.99%、4.73%、10.88%和14.39%,晚期凋亡率分别为10.08%、10.64%、11.83%和11.93%。结论miR-15a和miR-16-1寡核苷酸可增强Raji细胞对Ara-C的敏感性。

miR-15a与miR-16-1在前列腺癌患者血清中的表达及意义

目的探讨微小RNA-15a(miR-15a)与微小RNA-16-1(miR-16-1)在前列腺癌患者血清中的表达及意义。方法选取该院收治的前列腺癌、良性前列腺增生患者及同期健康体检者各41例为研究对象,检测其血清中miR-15a与miR-16-1的表达水平,分析前列腺癌患者血清miR-15a和miR-16-1表达水平与患者年龄、Gleason评分、病理分期、血清前列腺特异性抗原(PSA)间的关系。结果3组血清miR-15a和miR-16-1表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05),其中前列腺癌组患者血清miR-15a与miR-16-1表达水平低于良性前列腺增生组和健康组(P<0.05);良性前列腺增生组患者血清miR-15a与miR-16-1表达水平低于健康组(P<0.05)。前列腺癌组血清miR-15a、miR-16-1表达水平与患者年龄及血清PSA水平无关(P>0.05),与患者Gleason评分及病理分期有关(P<0.05)。结论miR-15a与miR-16-1在前列腺癌患者血清中的表达水平明显下降,且与肿瘤的病理分期、组织学分级有关,可作为辅助诊断前列腺癌的生物标志物。

LncRNA MCM3AP-AS1靶向调控miR-16-5p表达对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响及机制

目的研究LncRNA MCM3AP-AS1对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响和潜在机制。方法以BEAS-2B为对照组,实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)检测MCM3AP-AS1和miR-16-5p RNA的表达,四氮唑蓝(MTT)法测定A549细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western印迹检测增殖蛋白CyclinD1、p21和p27及迁移蛋白基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-14,双荧光素酶报告系统验证MCM3AP-AS1和miR-16-5p的关系。结果与对照组相比,肺癌细胞系A549、SPC-A1和NCI-H460中MCM3AP-AS1表达量均显著升高(P<0.05),miR-16-5p表达量显著下降(P<0.05);抑制MCM3AP-AS1表达和过表达miR-16-5p均可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭;MCM3AP-AS1靶向负向调控miR-16-5p的表达;抑制miR-16-5p表达逆转了下调MCM3AP-AS1表达对A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用。结论LncRNA MCM3AP-AS1通过靶向miR-16-5p调控肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭。MCM3AP-AS1是肺癌潜在分子靶点。

circTLK1靶向miR-16-5p对MPP+诱导的帕金森病模型细胞损伤的影响

目的探讨circTLK1对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)模型细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法采用MPP+诱导人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH建立PD模型记为PD组;用脂质体法分别将si-阴性对照(NC)、si-环状RNA(circTLK)1、miR-NC、miR-16-5p mimics、si-circTLK1+anti-miR-NC、si-circTLK1+anti-miR-16-5p转染至SK-N-SH细胞,转染成功后建立PD模型记为PD+si-NC组、PD+si-circTLK1组、PD+miR-NC组、PD+miR-16-5p组、PD+si-circTLK1组+anti-miR-NC组、PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p组。qRT-聚合酶链反应(PCR)法检测circTLK1、miR-16-5p的表达量;利用试剂盒检测丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)的水平;流式细胞术测定细胞凋亡;双荧光素酶报告实验验证circTLK1与miR-16-5p的靶向关系;Western印迹测定蛋白切割型(cleaved)-含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、cleaved-caspase9表达。结果与Con组比较,PD组circTLK1的表达量和MDA的水平增加,凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加,miR-16-5p的表达量和GSH的水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与PD+si-NC组比较,PD+si-circTLKL组MDA水平、凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平降低,GSH水平增高,差异均有统计学意义(P<0.05);circTLK1可靶向调节miR-16-5p的表达。与PD+si-circTLK1组+anti-miR-NC组比较,PD+si-circTLK1+anti-miR-16-5p组MDA水平、凋亡率和蛋白cleaved-caspase3、cleaved-caspase9水平增加,GSH水平和miR-16-5p表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论干扰circTLK1表达可减轻MPP+诱导的神经细胞氧化应激及凋亡从而改善PD模型细胞损伤,其机制与靶向上调miR-16-5p表达相关。

miR-16-5p通过调控PD-L1表达影响肝星状细胞炎症反应的研究

目的分析miR-16-5p在肝星状细胞中对程序性死亡受体-1(PD-1)表达的影响,并探讨其在肝纤维化及炎症反应中的作用机制。方法以大鼠肝星状细胞HSC-T6为研究对象,用5 ng/ml转化生长因子β1(TGF-β1)处理细胞0、24、48、72 h后,光镜下观察细胞形态,RT-qPCR法检测细胞TNF-α和IFN-γ表达水平,筛选出TGF-β1最佳作用时间。将细胞分为6组:对照组、模型组、miR-16-5p超表达组、miR-16-5p抑制组、超表达-空载组、抑制-空载组,采用RT-qPCR法检测miR-16-5p表达水平以验证转染效果;光镜下观察细胞形态变化;采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力;采用Western blot法检测细胞PD-1配体(PD-L1)、NF-κB、p-NF-κB蛋白表达水平;采用RT-qPCR法检测细胞miR-16-5p、PD-L1以及炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10 mRNA表达水平。结果5 ng/ml TGF-β1处理细胞0、24、48、72 h后,细胞增殖且形态发生改变;炎症因子TNF-α、IFN-γ在TGF-β1处理48 h时后表达水平均明显增高(均P<0.05)。与模型组相比,对照组和miR-16-5p超表达组细胞miR-16-5p的mRNA表达水平以及PD-L1和IL-10蛋白表达水平均明显升高(均P<0.05),p-NF-κB/NF-κB的蛋白表达水平以及TNF-α、IFN-γ和IL-6的mRNA表达水平均降低(均P<0.05),miR-16-5p超表达组细胞增殖能力降低(P<0.05);miR-16-5p抑制组miR-16-5p、PD-L1、IL-10的mRNA表达水平均降低(均P<0.05),p-NF-κB/NF-κB的蛋白表达水平以及TNF-α、IFN-γ、IL-6的mRNA表达水平均升高(均P<0.05),细胞增殖能力增强(P<0.05)。结论miR-16-5p在肝星状细胞中通过调控PD-L1表达降低肝细胞炎症水平,抑制细胞增殖,其机制可能参与抑制肝纤维化发生。

长链非编码RNA ASB16-AS1调控miR-670-3p/ATXN7L3轴影响胃癌细胞增殖、迁移和侵袭

背景多种长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNAs)在胃癌(gastric cancer,GC)进展中被证实发挥抑癌或促癌作用.但lncRNAs数量众多,仍有多种lncRNAs在GC进展中的作用并不明确.因此,筛选具有影响GC细胞增殖、迁移和侵袭的lncRNAs对GC防治十分必要.目的探讨LncRNA ASB16-AS1调控miR-670-3p/ATXN7L3轴对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响.方法实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RTqPCR)和western blot检测人胃黏膜细胞GES-1、GC细胞HGC-27、AGS、NUGC-4中ASB16-AS1、miR-670-3p和ATXN7L3的表达水平.将HGC-27细胞分为si-NC、si-ASB16-AS1、miR-NC、miR-670-3p、si-ATXN7L3、si-ASB16-AS1+anti-miR-NC、si-ASB16-AS1+anti-miR-670-3p、si-ASB16-AS1+pcDNA-NC、si-ASB16-AS1+pcDNA-ATXN7L3组.采用细胞计数试剂盒、transwell实验分别测定细胞活力、迁移侵袭能力;双荧光素酶报告实验、RT-qPCR、western blot确定ASB16-AS1与miR-670-3p、miR-670-3p与ATXN7L3之间的相互作用.结果GC细胞中ASB16-AS1、ATXN7L3呈高表达,miR-670-3p呈低表达(P<0.05).抑制ASB16-AS1表达,或过表达miR-670-3p,或抑制ATXN7L3表达后,HGC-27细胞增殖活力、迁移和侵袭能力均显著降低(P<0.05).ASB16-AS1靶向负调控miR-670-3p表达.miR-670-3p靶向负调控ATXN7L3表达.抑制miR-670-3p表达部分逆转抑制ASB16-AS1对HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响(P<0.05).过表达ATXN7L3部分逆转抑制ASB16-AS1对HGC-27细胞增殖、迁移和侵袭的影响(P<0.05).结论抑制ASB16-AS1通过调控miR-670-3p/ATXN7L3轴抑制GC细胞增殖、迁移和侵袭.

茶多酚EGCG通过调控miR-16-5p/含铜胺氧化酶1轴发挥对过氧化氢诱导的人心肌细胞凋亡的保护作用

目的:探究茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导人心肌细胞HCM凋亡的保护作用中的分子机制。方法:利用H_(2)O_(2)建立HCM细胞凋亡模型;通过caspase-3活性检测实验评价细胞凋亡水平;利用CCK-8法检测药物的细胞毒性;qPCR和Western blot用于检测含铜胺氧化酶1(AOC1)和miR-16-5p的表达水平;通过细胞转染调控AOC1和miR-16-5p在HCM细胞中的表达;通过TargetScan预测以及双荧光素酶报告基因实验验证miR-16-5p和AOC1 mRNA 3'UTR区的结合关系以及结合位点。结果:EGCG处理后可以显著抑制H_(2)O_(2)诱导的HCM细胞凋亡(P<0.05);在凋亡细胞中,AOC1表达显著下降,EGCG可以显著上调AOC1的表达,而敲减AOC1显著逆转EGCG对凋亡的抑制(P<0.05);同时,在凋亡细胞中,miR-16-5p表达显著上升,EGCG可以显著抑制miR-16-5p的表达,而上调miR-16-5p显著逆转了EGCG对凋亡的抑制(P<0.05);上调miR-16-5p显著逆转了EGCG对凋亡细胞中AOC1表达的促进;最后,miR-16-5p可以靶向抑制AOC1的表达,而过表达AOC1显著逆转了miR-16-5p诱导的HCM细胞凋亡。结论:EGCG通过调控miR-16-5p/AOC1轴发挥了对H_(2)O_(2)诱导HCM细胞凋亡的保护作用,同时提示AOC1是保护心肌细胞损伤治疗的潜在新靶点。

过表达miR-16下调IL-4诱导分化的THP-1细胞IL-10和Arg1的表达

目的探讨慢病毒介导的miR-16对THP-1巨噬细胞表达白细胞介素10(IL-10)和精氨酸酶1(Arg1)的影响。方法利用重组人IL-4(rh IL-4)将THP-1细胞诱导分化为M2型巨噬细胞,利用ELISA检测诱导前后细胞IL-10的分泌,实时荧光定量PCR检测THP-1巨噬细胞诱导前后miR-16的表达;通过慢病毒感染获得miR-16过表达细胞;ELISA检测miR-16过表达细胞和对照细胞IL-10的分泌;流式细胞术检测miR-16过表达细胞和对照细胞IL-10的表达;Western blot法检测miR-16过表达细胞和对照细胞Arg1的表达。结果 THP-1细胞经IL-4诱导后,培养上清中IL-10的分泌逐渐增加,并在第6天达峰值。IL-4将THP-1细胞诱导为M2型巨噬细胞后,miR-16表达下调;慢病毒感染M2型巨噬细胞经嘌呤霉素筛选后GFP表达率提高至97.7%;ELISA检测M2型巨噬细胞miR-16过表达组上清液中IL-10的分泌量为(72.15±0.16)pg/m L,较对照组(103.47±0.14)pg/m L低。流式细胞术检测显示miR-16过表达细胞IL-10的平均荧光强度(Gm)为3.47,胞内IL-10的表达水平较对照组(Gm=12.40)低。过表达miR-16后,M2型巨噬细胞中Arg1表达降低。结论慢病毒介导的miR-16能够抑制IL-4诱导分化的THP-1巨噬细胞中IL-10和Arg1的表达。

miR-16-5p靶向NLRP1抑制乳腺癌增殖的机制研究

目的:探讨miR-16-5p靶向NOD样受体蛋白1(NLRP1)抑制乳腺癌增殖的机制。方法:收集经手术切除的乳腺癌组织、正常乳腺组织,提取细胞进行培养、传代。将正常乳腺组织设为正常组,将乳腺癌组织设为癌症组。采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miR-16-5p、NLRP1在正常组、癌症组细胞中的表达,采用CCK-8法检测癌症组细胞中miR-16-5p、NLRP1的增殖情况,采用RT-qPCR法检测癌症组细胞中miR-16-5p过表达后miR-16-5p、NLRP1的相对表达情况,采用蛋白免疫印迹(WB)法检测癌症组细胞中miR-16-5p过表达后NLRP1的表达情况,采用双荧光素酶报告基因实验测定miR-16-5p可能结合的靶位点NLRP1。结果:癌症组细胞比正常组细胞miR-16-5p的mRNA相对表达值显著下降(P<0.05);癌症组细胞比正常组细胞NLRP1的mRNA相对表达值显著上升(P<0.05)。癌症组细胞miR-16-5p过表达后miR-16-5p的表达水平显著上升、NLRP1的表达水平显著下降(P<0.05)。癌症组细胞中过表达miR-16-5p可减少细胞增殖,过表达NLRP1可增加细胞增殖(P<0.05)。癌症组细胞miR-16-5p过表达后NLRP1的表达明显降低(P<0.05)。miR-16-5p可显著抑制WT质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK质粒(野生型)的荧光素酶活性,而不影响MT质粒+miR-16-5p mimics+pRL-TK质粒(突变型)的荧光报告基因活性(P<0.05)。结论:miR-16-5p在乳腺癌中呈低表达,NLRP1在乳腺癌中呈高表达。miR-16-5p可靶向调控NLRP1而抑制乳腺癌的增殖。

16q缺失调节miR-3145-5p/CYP2E1表达对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡及患者预后的影响

目的:探讨人16号染色体长臂(16q)缺失相关差异表达基因(DEGs)和miRNAs(DEmiRs)对肝癌细胞增殖、迁移和凋亡及肝细胞癌(HCC)患者预后的影响及其机制。方法:从肿瘤与癌症基因组图谱(TCGA)数据库的HCC数据集中获取全转录组数据和拷贝数变异(CNV)数据,就16q缺失对数据集进行DEGs和DEmiRs筛选;从Kaplan-Meier Plotter数据库中获取DEGs对患者生存影响图谱;通过miRWalk网站预测DEGs表达调节相关的miRNAs。构建miRNA mimic慢病毒载体转染Huh7细胞,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blotting法检测DEmiRs(miR-3145-5p)、DEGs(CYP2E1)的表达,分别采用CCK-8、细胞克隆形成实验、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验和流式细胞术检测细胞增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡。结果:从数据集中筛选出与16q缺失相关的8个miRNAs和12个关键DEGs;根据miRWalk网站预测和分析结果,选择miR-3145-5p与CYP2E1进行后续实验验证。与NC-con294组比较,miR-3145-5p mimic组miR-3145-5p表达和细胞凋亡率升高,CYP2E1蛋白表达水平降低,细胞增殖和侵袭能力增强(均P<0.01),两组各周期细胞所占百分比和细胞迁移能力比较无明显差异(P>0.05)。结论:16q缺失可能通过上调miR-3145-5p靶向下调CYP2E1表达来促进HCC细胞的增殖和侵袭而进一步增加细胞的恶性表型,其将来可作为16q缺失亚型HCC的潜在治疗靶标,为HCC的诊断与治疗提供新的依据。

miR-16-5p靶向NLRP1抑制缺氧复氧诱导的BRL-3A细胞焦亡

目的探讨mi R-16-5p对缺氧复氧诱导的大鼠正常肝细胞系BRL-3A焦亡的作用以及作用机制。方法通过细胞缺氧复氧的方法构建肝缺血再灌注损伤(HIRI)的体外模型,通过流式细胞术检测细胞焦亡率;通过荧光实时定量PCR(RT-qPCR)检测mi R-16-5p的表达水平;运用mi R-16-5p mimic在细胞中过表达mi R-16-5p并研究mi R-16-5p对细胞焦亡的影响;通过蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测焦亡相关蛋白caspase1、IL-1β、IL-18的蛋白表达水平;通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因实验预测并鉴定mi R-16-5p与NLRP1的靶向关系;通过过表达和干扰NLRP1,研究NLRP1及mi R-16-5p/NLRP1轴对细胞焦亡的影响。结果与空白对照组相比,模型组焦亡率极显著上升(P<0.01),mi R-16-5p表达量显著降低(P<0.05)。过表达mi R-16-5p极显著抑制细胞焦亡(P<0.01)并抑制焦亡相关蛋白caspase1、IL-1β、IL-18的表达(P<0.01或P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示NLRP1是mi R-16-5p的靶基因,过表达mi R-16-5p显著降低了NLRP1的m RNA和蛋白水平(P<0.01或P<0.05)。此外,过表达NLRP1逆转了mi R-16-5p对细胞焦亡的抑制作用(P<0.01)和对caspase1、IL-1β、IL-18表达的抑制作用(P<0.01或P<0.05)。结论MiR-16-5p通过靶向NLRP1来抑制caspase1、IL-1β、IL-18的表达,从而改善缺氧复氧引起的BRL-3A细胞焦亡。