远华蟾毒精通过下调miR-181a抑制胃癌细胞生长及侵袭研究

目的 回顾性分析胃癌患者样本中miR-181a的表达水平,根据临床病例病理数据分析miR-181a与胃癌的相关性。采用药物干预的方法,观察远华蟾毒精对胃癌细胞中miR-181a表达的影响以及参与胃癌生长及侵袭的作用机制。方法 本实验纳入2019年1月—2020年12月于滨州医学院附属医院诊治的90例胃癌患者的胃部病变标本及血液,另纳入30份癌旁组织样本。远华蟾毒精组使用0.05、0.10、0.50、1.00、1.25μg/ml的远华蟾毒精干预,对照组不加药。RT-qPCR探究组织层面的miR-181a表达水平。比较miR-181a在胃癌患者癌组织和癌旁组织中的表达水平,分析miR-181a表达水平与临床参数的相关性。以胃癌细胞系SGC-7901为研究对象,利用MTT法、细胞凋亡实验和Transwell实验探究远华蟾毒精对胃癌细胞增殖、细胞系SGC-7901细胞活力、侵袭力、细胞凋亡率的影响,并检测远华蟾毒精对miR-181a表达水平的影响。结果 与癌旁组织相比,胃癌组织中miR-181a呈高表达(P<0.05)。miR-181a低表达的胃癌患者生存曲线优于高表达者(P<0.05)。miR-181a高表达患者间肿瘤Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移率大于miR-181a低表达(P<0.05);miR-181a高表达与miR-181a低表达患者年龄、体质指数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。远华蟾毒精组细胞系SGC-7901 24、48 h存活率及侵袭数低于对照组,浓度为0.50、1.00、1.25μg/ml的远华蟾毒精组48 h存活率低于24 h存活率(P<0.05)。浓度为1.00、1.25μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901细胞早期和晚期的凋亡率及总凋亡率高于对照组,且浓度为1.25μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901晚期凋亡率低于早期凋亡率(P<0.05)。与对照组比较,浓度为1.00、1.25μg/ml的远华蟾毒精组细胞系SGC-7901中miR-181a表达水平降低(P<0.05),且浓度为1.00μg/ml的远华蟾毒精组48 h的miR-181a表达水平较24 h低(P<0.05)。结论 miR-181a表达水平是胃癌患者中的风险基因,远华蟾毒精可以通过下调miR-181a表达来发挥抗癌功能。

miR-181a靶向Bcl-2调控氧糖剥夺/再灌注模型诱导的SH-SY5Y神经细胞凋亡

目的皮层是响应脑缺血缺氧最为敏感的组织之一,基于前期深度测序技术,我们筛选获得响应脑缺血缺氧应激的皮层区目标基因miR-181a及Bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y细胞株氧糖剥夺/复糖复氧模型验证二者靶向调控关系及功能,明确miR-181a—Bcl-2调控网络在OGD/R诱导的神经细胞凋亡中的作用。方法采用线栓法构建大鼠缺血缺氧再灌注损伤模型,脑切片TTC染色及行为学评分法评估模型。应用qRT-PCR及Western Blot验证目标基因的表达。生物信息学分析miR-181a与Bcl-2的靶向结合位点并比对结合位点的保守性,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a与Bcl-2靶向结合的特异性。采用OGD/R细胞模型体外模拟脑缺血再灌注损伤,检测凋亡相关蛋白表达及Hoechst荧光染色评估细胞凋亡。结果大鼠大脑中动脉阻塞后miR-181a、Bcl-2表达变化趋势相反。RNA hybird软件预测miR-181a可结合Bcl-2的3′-UTR区,且结合区域高度保守。双荧光素酶报告基因实验发现,相对于Bcl-23′UTR-WT与mimic-NC共转染组,Bcl-23′UTR-WT与miR-181a mimic共转染后的荧光活性更低(P<0.001),而Bcl-2-Mut与miR-181a mimic共转染组,荧光活性无显著差异(P>0.05)。分别用miR-181a的模拟物及抑制物转染OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞,miR-181a可以抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平(P<0.001)。过表达miR-181a显著增加了SH-SY5Y细胞的凋亡(P<0.001),而抑制miR-181a表达可使SH-SY5Y细胞凋亡显著降低(P<0.001)。结论miR-181a可靶向结合Bcl-2,下调miR-181a可通过促进Bcl-2的表达进而抑制SH-SY5Y神经细胞OGD/R损伤诱导的细胞凋亡。

MiR-181a过表达参与调控Treg细胞对儿童变应性鼻炎的机制研究

目的:探讨miR-181a在AR儿童血清中的表达,并分析miR-181a对AR患儿Treg细胞分化和功能的调控作用。方法:选择20例AR患儿和20例年龄相近,无过敏史的儿童为研究对象。Pearson相关分析外周血Treg数量与miR-181a表达之间关系。从AR患儿外周血中分离纯化Tregs。将miR-181a模拟物和抑制剂转染到Tregs细胞中。用流式细胞仪和ELISA法评价Tregs的功能。用卵清蛋白建立AR小鼠模型,然后通过功能增益和功能损失法确定miR-181a在AR中的作用。结果:与对照组相比,AR患儿外周血Treg数量减少,并且miR-181a表达显著降低。Pearson相关分析显示外周血Treg数量与miR-181a表达呈显著正相关(R2=0.335,P<0.001)。miR-181a模拟物促进了Tregs的增殖,并上调了IL-10和TGF-β的mRNA表达。荧光素酶报告试验表明,miR-181a直接靶向OPN的3'UTR。在动物实验中,与AR和AR+miR-NC组相比,AR+miR-181a模拟组炎症减轻,AR+miR-181a抑制剂组炎症更严重。重组OPN蛋白显著逆转了miR-181a模拟物的抗炎作用。此外,AR组小鼠Treg细胞明显减少,miR-181a模拟物显著增加了AR小鼠的Treg细胞,而重组OPN蛋白显著逆转了miR-181a模拟物诱导的Treg细胞增多。结论:miR-181a的上调显著降低了OPN的表达,进而减少了嗜酸性粒细胞和增强Treg功能,减轻了AR发病过程中气道炎症的发生。

炙甘草汤通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化改善糖尿病心肌病

目的探究炙甘草汤对糖尿病心肌病(DCM)模型大鼠心肌纤维化的影响以及调控机制。方法雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,10只大鼠作为对照组;20只通过高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建DCM模型大鼠,造模后按随机数字表法分成DCM组、炙甘草汤组。炙甘草汤组予2 mL/100 g炙甘草汤(1 g/mL)灌胃,对照组及DCM组予等量生理盐水灌胃,连续给药4周,每天1次。灌胃给药结束后,HE染色观察DCM模型大鼠心肌组织的病理改变,Masson染色观察DCM模型大鼠的心肌纤维化情况。提取大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组、高糖组、炙甘草汤组、miRNA-NC组、miR-181a-5p模拟物组、miR-181a-5p拮抗剂组、炙甘草汤+miRNA-NC组和炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组并进行相应处理。通过高糖(30 mmol/L)诱导心肌成纤维细胞增殖模型。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)和鞘氨醇激酶2(SPHK2)蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-181a-5p、CollagenⅠ和CollagenⅢ的相对表达水平。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测心肌成纤维细胞的细胞活力。TargetScan数据库预测miR-181a-5p与SPHK2的结合序列。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a-5p与SPHK2的靶向关系。结果与对照组比较,DCM组大鼠血糖水平显著升高[(30.40±3.48)mmol/L比(5.08±0.17)mmol/L,P<0.01],心肌细胞肥大、排列紊乱、成纤维细胞增生伴炎症细胞浸润,炙甘草汤组大鼠上述情况均得到改善。与对照组比较,DCM组大鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.45±0.20)比(1.00±0.12),P<0.01];而炙甘草汤喂养能够逆转上述表达水平变化。与对照组比较,高糖组心肌成纤维细胞的细胞活力[(194.03±25.59)%比(100.00±11.00)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(3.73±0.81)比(1.00±0.17),P<0.01]、CollagenⅢ[(3.93±0.97)比(1.00±0.24),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.41±0.18)比(1.00±0.21),P<0.01];与高糖组比较,炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力[(147.63±25.80)%比(194.03±25.59)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(1.91±0.58)比(3.73±0.81),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.02±0.45)比(3.93±0.97),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平降低,miR-181a-5p水平显著升高[(0.69±0.17)比(0.41±0.18),P<0.01]。与miRNA-NC比较,心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p模拟物后miR-181a-5p表达显著升高[(2.82±0.86)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达下降;而转染miR-181a-5p拮抗剂后miR-181a-5p表达显著下降[(0.29±0.09)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达升高。TargetScan数据库分析发现,miR-181a-5p与SPHK2的3’UTR存在结合序列。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a-5p和SPHK2存在靶向作用。与炙甘草汤+miRNA-NC组比较,炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组心肌成纤维细胞CollagenⅠ[(2.95±0.67)比(1.89±0.26),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.99±0.74)比(1.85±0.63),P<0.01]、细胞活力[(78.57±10.64)%比(59.75±8.08)%,P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著降低[(0.77±0.17)比(2.89±0.57),P<0.01]。结论炙甘草汤可能通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化来实现对DCM的改善作用。

过表达miR-181a-5p的口腔癌皮下移植瘤小鼠模型的小肠代谢组学研究

目的通过检测口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢通路的变化,分析过表达miR-181a-5p对皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢物组的影响。方法实验分为3组,空白对照(Control)组、阴性对照(negative control,NC)组以及实验(over expression of miR-181a-5p,OE)组。将不同组别处理后的细胞混悬液,通过皮下注射到M-NSG重度免疫缺陷雌性小鼠右侧腹股沟中上部,构建成口腔癌皮下移植瘤小鼠模型。按时记录小鼠体重变化,对小鼠小肠组织进行HE染色,观察各组病理变化。采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪和串联Orbitrap质谱联用仪检测NC组、OE组和Control组小鼠小肠中的代谢物,使用XCMS预分析原始数据,质量评价样本数据,鉴定Control组与NC组、NC组与OE组的差异代谢物,进行KEGG富集分析获取差异代谢通路。结果Control组和NC组小肠组织中共鉴定出170种差异代谢物。代谢物富集的显著性信号通路包括胆碱代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、γ-氨基丁酸(GABA)神经突触代谢、甘油磷脂代谢、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路代谢、癌症中心碳代谢以及烟酸和烟碱胺代谢通路。NC组和OE组相比,小鼠小肠中检测到VIP(variable importance in the projection)>2的差异代谢物有16种,显著性差异代谢物包括甘油磷酰胆碱、棕榈酸、3-羟基丁酰肉碱、β-羟丁酸等。代谢物富集到的显著性差异通路为胆碱代谢通路。结论口腔癌皮下移植瘤可引起小鼠小肠的代谢物发生变化,主要改变了小肠中与能量代谢相关的代谢物。过表达miR-181a-5p影响口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠代谢物,代谢物富集通路为胆碱代谢通路。

miR-181a、GAL3在急性缺血性脑卒中病情及预后评估中的临床价值

目的研究miR-181a、半乳凝素-3(galectin-3,GAL3)在急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)病情及预后评估中的临床价值。方法选取2019年1月至2021年1月诊治的82例AIS患者(AIS组)和40例同期无缺血性脑卒中的颅脑血管疾病患者(对照组)为研究对象,比较两组患者的血清miR-181a、GAL3、美国国立卫生研究院卒中量表(National Institute of Health stroke scale,NIHSS)、改良Barthel指数评定量表(modified Barthel index,MBI)及Fugl-Meyer肢体运动功能(Fugl-Meyer assessment of gait,FMA)评分的差异。Pearson相关性分析miR-181a、GAL3与神经功能指标(NIHSS、MBI、FMA评分)的相关性。采用受试者操作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)分析miR-181a、GAL3预测AIS患者1年预后不良的效能。Logistic回归分析AIS患者1年死亡的危险因素。结果与对照组比较,AIS组患者的miR-181a、GAL3、NIHSS评分显著增高(P<0.05);MBI及FMA评分均显著降低(P<0.05)。AIS组患者的miR-181a、GAL3与NIHSS评分呈正相关(r>0,P<0.05);与MBI评分、FMA评分呈负相关(r<0,P<0.05)。miR-181a、GAL3预测AIS组患者1年预后不良的敏感度、特异性、曲线下面积(areaunder the curve,AUC)均高于NIHSS评分、MBI评分、FMA评分;miR-181a联合GAL3预测AIS组患者1年预后不良的敏感度、特异性、AUC均高于miR-181a、GAL3、NIHSS评分、MBI评分、FMA评分。miR-181a≥1.3、GAL3≥12.3ng/ml、NIHSS评分≥17.4分、MBI评分<67.6分、FMA评分<84.2分为AIS患者1年死亡的独立危险因素(P<0.05)。结论AIS患者血清miR-181a及GAL3水平明显增高,在AIS病情及预后评估中具有一定的临床价值。

MiR-181a-5p调控乳头状甲状腺癌细胞增殖和侵袭的作用及分子机制研究

目的探讨miR-181a-5p对乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)细胞的作用及调控机制。方法利用生物信息学工具分析miR-181a-5p和促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor,TSHR)在PTC组织中的表达以及两者的靶向关系,并使用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。TPC-1细胞转染miR-181a-5p抑制物和shTSHR后,使用定量逆转录聚合酶链反应或免疫印迹实验检测TPC-1细胞中miR-181a-5p、TSHR、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。通过MTT和Transwell实验检测miR-181a-5p和TSHR对TPC-1细胞活性、侵袭的作用。结果在PTC组织和细胞中miR-181a-5p表达上调(P<0.001),在甲状腺癌组织中TSHR低表达,且miR-181a-5p可直接靶向TSHR。下调miR-181a-5p抑制了TPC-1细胞活性、侵袭以及N-cadherin和Vimentin的表达(P<0.01),但促进了E-cadherin的表达(P<0.001)。TSHR敲减产生了相反的结果(P<0.01),并部分逆转了miR-181a-5p下调对TPC-1细胞的影响(P<0.01)。反之,miR-181a-5p下调可以逆转TSHR敲减产生的影响(P<0.05)。结论下调miR-181a-5p可通过促进TSHR的表达来抑制PTC细胞的恶性进展。

hsa-miR-181a-5p靶基因预测及生物信息学分析

目的对hsa-miR-181a-5p进行系统的生物信息学分析,预测hsa-miR-181a-5p的靶基因、基因功能及信号通路,并对其进行生物学功能注释。方法利用数据库对hsa-miR-181a-5p基因定位,分析其序列保守性和在人类组织器官中的表达情况;利用数据库进行靶基因预测分析;并将预测交集靶基因进行GO功能分析及KEGG通路富集分析和蛋白间相互作用(PPI)网络分析;最后利用A549细胞进行hsa-miR-181a-5p转染实验,进行转录组测序同步验证生物信息学预测结果。结果发现基因定位于人类基因组chr1、chr9染色体,成熟序列在物种间具有高度保守性。3个数据库交集靶基因有483个,包含PTEN、MAPK8、AKT3等基因,其分布在胞浆等细胞组分,执行蛋白质结合等生物功能,并参与信号转导等生物学过程。靶基因富集于MAPK、PI3K-Akt、胰岛素抵抗、癌症中的miRNA等信号通路,其编码的蛋白间形成复杂网络图。实验后转录组测序结果验证了生信分析的准确性,对预测及富集结果提供了有力支撑。结论hsa-miR-181a-5p在多种生物学过程发挥重要作用,尤其是在神经系统疾病、血液免疫系统疾病以及癌症的发生发展中其将成为相关疾病发生机制和防治研究的新靶点。

原花青素下调miR-181a抑制颗粒细胞氧化损伤的作用机制

旨在研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins, GSP)抑制颗粒细胞氧化损伤的作用及其可能机制。腹腔注射3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid, 3-NP)诱导小鼠卵泡氧化损伤,并补充GSP进行干预处理;体外分离培养小鼠卵巢颗粒细胞,通过抑制或过表达miR-181a,研究原花青素B2(grape seed procyanidin B2,GSPB2)通过下调miR-181a抑制颗粒细胞氧化损伤的作用。采用定量PCR方法检测miR-181a表达水平,应用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)法检测细胞活力,利用免疫组化法检测活化天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3),应用酶标仪法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性,采用双荧光素酶报告基因检测miR-181a和转化生长因子β受体Ⅰ(TGFBR1)的靶向调控关系,使用原位末端标记法(TUNEL)染色检测颗粒细胞凋亡情况,应用Western blot法检测TGFBR1蛋白水平。结果显示:在动物试验中,与对照组相比,3-NP组颗粒细胞活力显著降低(P<0.05);同时caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白及miR-181a表达明显升高(P<0.05);而GSP干预处理可扭转上述各指标的改变(P<0.05)。双荧光素酶报告试验结果显示,TGFBR1为miR-181a的靶基因;进一步分析发现,与对照组相比,miR-181a模拟物转染后TGFBR1蛋白表达和细胞活力均显著降低(P<0.05),而miR-181a抑制剂转染后TGFBR1蛋白表达和细胞活力均显著升高(P<0.05)。在细胞试验中,与对照组比较,H2O2组细胞中miR-181a表达升高,TGFBR1表达降低(P<0.05),细胞活力下降,caspase-3活性和细胞凋亡率均显著升高;而GSPB2预处理可扭转上述各指标的改变(P<0.05)。综上,GSP可抑制颗粒细胞的氧化损伤,其作用可能是通过抑制miR-181a表达而调控TGFBR1表达实现。

miR-181a-5p靶向HMGB1调节急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的实验研究

目的探讨miR-181a-5p调控HMGB1的表达在雨蛙素(cerulein)联合脂多糖(lipopolyasccharide,LPS)诱导的严重急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的影响。方法以未处理的AR42J细胞作为正常组,1×10-8 mol/L的cerulein联合10μg/mL的LPS诱导AR42J细胞24 h建立体外严重AP组,用脂质体转染法将miR-NC(空载体)和miR-181a-5p mimic转染至严重AP组作为miR-NC对照组和miR-181a-5p过表达组。采用qRT-PCR检测AR42J细胞中miR-181a-5p、HMGB1和Caspase-3 m RNA的表达水平;Western Blot检测HMGB1和Caspase-3蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验明确miR-181a-5p和HMGB1的靶向关系;Pearson相关分析确定miR-181a-5p、HMGB1和Caspase-3 mRNA表达的相互关系。结果与正常组相比,严重AP组中miR-181a-5p mRNA表达水平显著下调(P<0.01),HMGB1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),Caspase-3 mRNA表达水平升高(P<0.05),HMGB1、Caspase-3的蛋白表达升高(P<0.05);与miR-NC对照组相比,miR-181a-5p过表达组miR-181a-5p mRNA表达水平显著上调(P<0.01),HMGB1、Caspase-3 mRNA表达水平显著下降(P<0.01),HMGB1、Caspase-3的蛋白表达下降(P<0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-181a-5p可抑制野生型HMGB1细胞的荧光活性,miR-181a-5p可靶向调控HMGB1的表达;Pearson相关性分析显示,miR-181a-5p与HMGB1表达水平呈负相关(r=-0.905,P<0.01);miR-181a-5p与Caspase-3表达水平呈负相关(r=-0.809,P<0.01);HMGB1与Caspase-3表达水平呈正相关(r=0.691,P<0.05)。结论miR-181a-5p在cerulein+LPS诱导AR42J细胞中低表达,HMGB1和Caspase-3高表达,过表达miR-181a-5p可抑制凋亡相关基因Caspase-3的表达,其机制可能与靶向HMGB1有关,这将为AP的诊断及治疗提供新的思路。

miR-181a通过NF-κB通路调控胃癌细胞系SGC-7901的凋亡及迁移

目的:检测miR-181a和NF-κB信号通路相关蛋白在胃癌组织及胃癌细胞系中的差异性表达,探讨miR-181a通过NF-κB信号通路影响胃癌细胞凋亡、迁移的机制,以期为胃癌的临床治疗提供新依据。方法:检测90例胃癌患者样本中miR-181a及NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平,根据临床病例标本数据分析miR-181a及NF-κB信号通路与胃癌的相关性。采用细胞转染的方法调节细胞系SGC-7901中miR-181a表达,之后利用RT-qPCR检测其对NF-κB信号通路的影响,TUNEL法检测细胞凋亡及划痕实验检测细胞迁移的影响。结果:TUNEL法结果显示与miR-181a-up组比较,miR-181a-down组凋亡率更高。Western印迹结果显示与miR-181a-up组比较,miR-181a-down组Caspase3和Caspase9的表达量更高。结论:miR-181a抑制SGC7901癌细胞凋亡并促进癌细胞迁移,激活NF-κB信号通路。

新生儿脓毒血症血清miR-141、miR-181a水平及对病情严重程度的影响

目的分析新生儿脓毒血症血清miR-141、miR-181a水平及对病情严重程度的影响。方法选取2021年6月—2022年8月海南现代妇女儿童医院新生儿科诊治脓毒血症患儿50例为研究对象,根据患儿的序贯器官衰竭评分(SOFA)分为轻症组27例和重症组23例。比较2组患儿血清miR-141、miR-181a、C反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)及急性生理与慢性健康评分(APACHE-Ⅱ)水平,采用Pearson法分析血清miR-141、miR-181a与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT的相关性,采用多因素Logistic回归分析脓毒血症患儿病情严重程度的影响因素,采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-141、miR-181a预测病情严重程度的价值。结果重症组血清miR-141和miR-181a水平低于轻症组,CRP、PCT水平及APACHE-Ⅱ评分高于轻症组(t=8.977、5.972、9.605、7.981、7.054,P均<0.001);血清miR-141、miR-181a与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT均呈负相关(miR-141:r=-0.570、-0.741、-0.582;miR-181a:-0.569、-0.513、-0.576,P均<0.001)。血清miR-141高、miR-181a高为脓毒血症患儿病情加重的保护因素[OR(95%CI)=0.33(0.18~0.52)、0.27(0.14~0.46)],APACHE-Ⅱ评分高、CRP高和PCT高为病情加重的危险因素[OR(95%CI)=1.56(1.14~1.83)、2.18(1.52~2.71)、1.67(1.27~1.93)]。血清miR-141、miR-181a及二者联合预测新生儿脓毒血症病情严重程度的AUC分别为0.936、0.856、0.959,二者联合优于各自单独预测效能(Z=5.318、9.652,P均<0.001)。结论血清miR-141、miR-181a在新生儿脓毒血症中低表达,与APACHE-Ⅱ评分、CRP、PCT呈负相关,其水平升高是脓毒血症患儿病情加重的保护因素,对新生儿脓毒血症病情变化有较好的预测价值。

血浆miR-181a-5p可评估急性脑梗死的病情及预后

目的:探讨急性脑梗死(ACI)患者血浆中微小RNA(miR)-181a-5p的表达水平及临床价值。方法:收集148例ACI患者(ACI组)的临床资料,根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分将其分为:轻度72例、中度35例、重度41例。ACI患者发病4.5h内用阿替普酶静脉溶栓治疗。根据出院后第90天的预后情况,将患者分为预后良好组(102例)和预后不良组(46例)。另选取同期健康体检者100例为对照组。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测血浆miR-181a-5p表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆中凋亡分子B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase-1)表达水平。相关性检验用Pearson分析;用Logistic多因素回归分析影响预后的因素;绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析血浆miR-181a-5p预测预后的价值,计算曲线下面积(AUC)、灵敏度及特异性。结果:与对照组比较,ACI组血浆miR-181a-5p和caspase-1表达水平较高,而Bcl-2表达水平较低(P均<0.05)。miR-181a-5p与caspase-1呈正相关(r=0.176,P=0.032),与Bcl-2呈负相关(r=-0.209,P=0.011)。轻度、中度和重度ACI患者血浆miR-181a-5p表达水平分别为(1.35±0.32)、(1.79±0.20)、(2.34±0.59),经单因素方差分析,组间比较差异有统计学意义(F=32.001,P<0.001),病情越重,血浆miR-181a-5p表达水平越高。与预后良好组比较,预后不良组年龄更大,入院时NIHSS评分、血浆miR-181a-5p和caspase-1水平较高,而Bcl-2水平较低(P均<0.05)。多因素分析显示,年龄、入院时NIHSS评分及血浆miR-181a-5p水平是ACI患者预后不良的独立影响因素(OR=1.532、1.832、3.111,P均<0.05)。血浆miR-181a-5p预测不良预后的AUC为0.856(95%CI:0.815~0.886,P<0.01),灵敏度为89.56%,特异性为70.12%。结论:ACI患者血浆中miR-181a-5p表达水平明显升高,对ACI病情和预后的早期评估有一定价值。

miR-181a调控结肠癌细胞生长的作用和机制研究

结肠癌是指结肠黏膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变，是常见的恶性肿瘤之一，占所有恶性肿瘤的10％～15％^[1]。结肠癌的发病原因与遗传、结肠腺瘤、息肉病、慢性炎症、高脂肪、少纤维饮食习惯等都有一定关系^[2]，结肠癌发病隐匿，病程慢早期无明显的临床表现，出现明显症状时大多已到了中晚期，病死率仅次于肺癌和肝癌，是危害人们健康的可怕杀手^[3]。

上调miR-181a对胃癌细胞AGS增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-181a对胃癌细胞增殖、周期及凋亡的影响及其作用机制。方法荧光实时定量PCR检测5种胃癌细胞及人胃黏膜细胞系GES-1中miR-181a的表达情况,以及胃癌细胞AGS瞬时转染miR-181amimic后miR-181a的表达情况;MTT法和流式细胞仪检测上调miR-181a表达对胃癌细胞AGS增殖、周期和凋亡等生物学行为的影响;Western blot检测上调miR-181a后细胞周期调控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相关蛋白(Bcl-2和Bax)的表达变化。结果与人胃黏膜细胞系GES-1比较,miR-181a在人胃癌细胞株SGC-7901和MKN28表达升高(P均<0.01),在MGC-803、BGC-823、AGS表达差异无统计学意义(P均>0.05);瞬时转染miR-181amimic后,胃癌细胞AGS中miR-181a的表达明显上调(P<0.05);转染miR-181amimics后AGS细胞增殖明显,G0/G1期细胞减少,S期细胞明显增多,细胞凋亡明显减弱(P均<0.05)。Western blot结果显示,上调miR-181a后胃癌细胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表达升高(P均<0.05),cyclinD1和p21表达差异没有统计学意义(P>0.05),Bax表达降低(P<0.05)。结论上调miR-181a可以促进胃癌细胞AGS增殖,其作用机制可能与CDC25A、CyclinA2表达升高有关;上调miR-181a可抑制胃癌细胞凋亡,其作用机制可能与Bcl-2表达升高及Bax表达降低有关。

MiR-181a靶向RASSF1A促进骨肉瘤细胞的生长和转移

目的:探讨miR-181a是否靶向调控抑癌基因RAS相关区域家族1A(Ras-association domain family 1,isoform A,RASSF1A),从而促进骨肉瘤细胞的生长和转移。方法:采用real-time PCR检测30例人骨肉瘤组织及其癌旁正常骨组织中miR-181a的表达,并分析miR-181a表达水平与骨肉瘤患者临床病理特征的相关性。在骨肉瘤细胞MG-63中瞬时转染miR-181a模拟物和miR-181a抑制剂,分别采用MTT和transwell检测miR-181a对骨肉瘤细胞生长和转移的作用。随后,预测并通过双荧光素酶报告基因验证miR-181a与RASSF1A基因3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)的特异性结合作用。结果:与癌旁正常骨组织比较,miR-181a在骨肉瘤组织中高表达(P<0.001),但其表达水平与骨肉瘤患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤病理分期等无明显相关性(P>0.05)。MTT及transwell结果显示过表达miR-181a促进了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著高于阴性对照组(P<0.05);而抑制miR-181a的表达降低了MG-63细胞生长、迁移和侵袭,显著低于阴性对照组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-181a可靶向结合RASSF1A基因3'-UTR,从而调控RASSF1A的表达。结论:miR-181a可特异性结合RASSF1A基因3'-UTR,下调RASSF1A基因的表达,从而促进人骨肉瘤细胞MG-63的生长和转移。

miR-181a、miR-181b在人胃癌细胞和组织中的表达

目的:研究miR-181a、miR-181b在不同分化程度人胃癌细胞株和胃癌组织中的表达情况,探索其在胃癌发生发展过程中的作用.方法:体外培养3种不同分化程度的胃癌细胞株(AGS,SGC-7901、MGC-803)及正常胃黏膜细胞GES-1,收集28例胃癌患者手术切除的癌组织及正常组织样本,通过实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerasechain reaction,qRT-PCR)方法检测上述细胞和组织中miR-181a、miR-181b的表达量,比较胃癌细胞与正常胃黏膜细胞、胃癌组织与正常胃组织中miR-181a,miR-181b表达的差异性.结果:经qRT-PCR方法检测发现,AGS、S GC-7901、MGC-803 3种胃癌细胞中miR-181a及miR-181b的表达量均高于GES-1细胞中的表达量(P<0.05),而AGS,SGC-7901、MGC-803 3种胃癌细胞之间miR-181a及miR-181b的表达量差异均无统计学意义(P>0.05).与正常胃组织相比,miR-181a,miR-181b在胃癌组织中的表达量显著升高(P<0.05).Ⅲ/Ⅳ期组胃癌组织中miR-181a,miR-181b的相对表达量高于Ⅰ/Ⅱ期组(P<0.05).有淋巴结转移组胃癌组织中miR-181a,miR-181b的相对表达量高于无淋巴结转移组(P<0.05).miR-181a,miR-181b的相对表达量与年龄、性别、胃癌的分化程度无明显关系(P>0.05).结论:miR-181a、miR-181b在胃癌细胞和组织中高表达,两者的表达水平与胃癌的分期、淋巴结转移相关,可能在胃癌的发生发展中发挥癌基因的作用.

miR-181a促进人子宫内膜间质细胞蜕膜化催乳素的表达

目的目前虽已发现一些在胚胎着床过程中起重要作用的分子,但微小RNA(microRNA,miRNA)在蜕膜化过程中作用的研究报道较少,文中调查孕鼠围着床期子宫组织中miR-181a的表达规律,并探讨miR-181a对人子宫内膜间质细胞(human endometrial stromal cell,hESC)体外诱导蜕膜化过程中蜕膜化标志基因蜕膜化催乳素(decidual prolactin,dPRL)表达的调控作用。方法收集怀孕0～6.5 d孕鼠子宫组织,采用TRIZOL法提取总RNA,通过实时定量PCR检测子宫组织中miR-181a的表达。制备Ad-miR-181a重组腺病毒,并感染hESC,24 h后采用0.5 mmol/L 8-Br-cAMP和1μmol/L Medroxyproges-terone(MPA)联合进行体外蜕膜化诱导培养;通过化学发光免疫法和实时定量PCR分别检测细胞培养液上清中dPRL的浓度与间质细胞中催乳素(prolactin,PRL)mRNA的表达;同时采用荧光素酶报告基因检测miR-181a对hESC中dPRL(-332/+65)启动子的调控作用。结果早孕小鼠子宫组织中miR-181a的表达高于非妊娠小鼠子宫,且随着妊娠天数的增加呈逐渐上升的趋势,在小鼠着床"窗口期"即孕4.5 d达到高峰(2.60±0.15倍,P<0.01,n=5),孕5.5 d子宫miR-181a的表达开始平稳下降;成功获得滴度为5.19×1010ifu/ml的miR-181a腺病毒,该腺病毒介导的miR-181a过表达显著增加hESC蜕膜化标志基因dPRL mRNA表达水平,增高超过8倍(P<0.01);在8-Br-cAMP和MPA联合诱导hESC体外蜕膜化时,高表达miR-181a可明显增加8-Br-cAMP联合MPA诱导的PRL mRNA表达水平与PRL蛋白分泌(P<0.01)。荧光素酶报告基因进一步证实miR-181a可以激活dPRL(-332/+65)启动子的活性达到2倍(P<0.05)。结论 miR-181a参与8-Br-cAMP和MPA诱导子宫内膜间质细胞蜕膜化过程中PRL的表达调控。

miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达对肺癌细胞顺铂耐药的影响

目的:研究miR-181a/b在肺癌细胞顺铂耐药形成中的作用。方法:运用miRNA实时定量PCR方法检测miR-181a/b在肺癌顺铂耐药细胞A549/CDDP与母代A549细胞中的表达差异,运用Western blot检测A549/CDDP细胞与母代细胞抗凋亡蛋白BCL2、MCL1和XIAP的表达差异,分别构建BCL2、MCL1和XIAP的3′UTR荧光素酶报告质粒验证miR-181a/b的靶基因,在耐药细胞中瞬时转染miR-181a/b模拟物以检测上调miR-181a/b对A549/CDDP细胞中BCL2、MCL1和XIAP蛋白表达及耐药性的影响,并运用流式细胞术检测转染后耐药细胞对CDDP(Cisplatin,顺铂)诱导凋亡的影响。结果:在A549/CDDP细胞中miR-181a/b均呈低表达,而抗凋亡蛋白BCL2、MCL1和XIAP则呈高表达,荧光素酶报告实验证实BCL2、MCL1和XIAP是直接受miR-181a/b调控的靶基因,在耐药细胞中上调miR-181a/b显著抑制BCL2、MCL1和XIAP蛋白表达水平,显著增加耐药细胞对顺铂的敏感性,并显著增加耐药细胞对顺铂诱导的凋亡。结论:miR-181a/b靶向抑制多种抗凋亡蛋白表达可显著增加A549/CDDP细胞对顺铂的敏感性。

miR-181a及其靶基因Atg5在胃癌中的表达及临床意义

目的研究miR-181a及其靶基因Atg5在人胃癌细胞株和胃癌组织中的表达及其与临床病理参数的关系。方法体外培养人胃癌细胞株(MGC-803、SGC-7901、BGC-823)和正常胃黏膜细胞株(GSE-1),收集30例胃癌血清和手术切除的癌组织及癌旁正常组织,并以30名正常人血清标本为对照,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测血清、细胞株、组织中miR-181a及细胞株、组织中Atg5 mRNA的表达情况。结果胃癌细胞株、组织、血液中miR-181a的表达较正常细胞、癌旁正常组织及正常人血清明显升高(P<0.05);Atg5 mRNA相对表达量在胃癌细胞株和胃癌组织中均分别低于正常胃黏膜细胞株和癌旁正常组织(P<0.05)。在胃癌组织和癌旁正常组织中,miR-181a与Atg5 mRNA表达呈负相关。结论 miR-181a在胃癌细胞株、胃癌组织和血清中显著高表达,提示其有望成为潜在的胃癌标志物。Atg5在胃癌中低表达并与miR-181a表达呈负相关,提示其可能是miR-181a在胃癌中的潜在作用靶基因。