炙甘草汤通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化改善糖尿病心肌病

目的探究炙甘草汤对糖尿病心肌病(DCM)模型大鼠心肌纤维化的影响以及调控机制。方法雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,10只大鼠作为对照组;20只通过高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建DCM模型大鼠,造模后按随机数字表法分成DCM组、炙甘草汤组。炙甘草汤组予2 mL/100 g炙甘草汤(1 g/mL)灌胃,对照组及DCM组予等量生理盐水灌胃,连续给药4周,每天1次。灌胃给药结束后,HE染色观察DCM模型大鼠心肌组织的病理改变,Masson染色观察DCM模型大鼠的心肌纤维化情况。提取大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组、高糖组、炙甘草汤组、miRNA-NC组、miR-181a-5p模拟物组、miR-181a-5p拮抗剂组、炙甘草汤+miRNA-NC组和炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组并进行相应处理。通过高糖(30 mmol/L)诱导心肌成纤维细胞增殖模型。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)和鞘氨醇激酶2(SPHK2)蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-181a-5p、CollagenⅠ和CollagenⅢ的相对表达水平。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测心肌成纤维细胞的细胞活力。TargetScan数据库预测miR-181a-5p与SPHK2的结合序列。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a-5p与SPHK2的靶向关系。结果与对照组比较,DCM组大鼠血糖水平显著升高[(30.40±3.48)mmol/L比(5.08±0.17)mmol/L,P<0.01],心肌细胞肥大、排列紊乱、成纤维细胞增生伴炎症细胞浸润,炙甘草汤组大鼠上述情况均得到改善。与对照组比较,DCM组大鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.45±0.20)比(1.00±0.12),P<0.01];而炙甘草汤喂养能够逆转上述表达水平变化。与对照组比较,高糖组心肌成纤维细胞的细胞活力[(194.03±25.59)%比(100.00±11.00)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(3.73±0.81)比(1.00±0.17),P<0.01]、CollagenⅢ[(3.93±0.97)比(1.00±0.24),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.41±0.18)比(1.00±0.21),P<0.01];与高糖组比较,炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力[(147.63±25.80)%比(194.03±25.59)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(1.91±0.58)比(3.73±0.81),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.02±0.45)比(3.93±0.97),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平降低,miR-181a-5p水平显著升高[(0.69±0.17)比(0.41±0.18),P<0.01]。与miRNA-NC比较,心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p模拟物后miR-181a-5p表达显著升高[(2.82±0.86)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达下降;而转染miR-181a-5p拮抗剂后miR-181a-5p表达显著下降[(0.29±0.09)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达升高。TargetScan数据库分析发现,miR-181a-5p与SPHK2的3’UTR存在结合序列。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a-5p和SPHK2存在靶向作用。与炙甘草汤+miRNA-NC组比较,炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组心肌成纤维细胞CollagenⅠ[(2.95±0.67)比(1.89±0.26),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.99±0.74)比(1.85±0.63),P<0.01]、细胞活力[(78.57±10.64)%比(59.75±8.08)%,P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著降低[(0.77±0.17)比(2.89±0.57),P<0.01]。结论炙甘草汤可能通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化来实现对DCM的改善作用。

过表达miR-181a-5p的口腔癌皮下移植瘤小鼠模型的小肠代谢组学研究

目的通过检测口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢通路的变化,分析过表达miR-181a-5p对皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢物组的影响。方法实验分为3组,空白对照(Control)组、阴性对照(negative control,NC)组以及实验(over expression of miR-181a-5p,OE)组。将不同组别处理后的细胞混悬液,通过皮下注射到M-NSG重度免疫缺陷雌性小鼠右侧腹股沟中上部,构建成口腔癌皮下移植瘤小鼠模型。按时记录小鼠体重变化,对小鼠小肠组织进行HE染色,观察各组病理变化。采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪和串联Orbitrap质谱联用仪检测NC组、OE组和Control组小鼠小肠中的代谢物,使用XCMS预分析原始数据,质量评价样本数据,鉴定Control组与NC组、NC组与OE组的差异代谢物,进行KEGG富集分析获取差异代谢通路。结果Control组和NC组小肠组织中共鉴定出170种差异代谢物。代谢物富集的显著性信号通路包括胆碱代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、γ-氨基丁酸(GABA)神经突触代谢、甘油磷脂代谢、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路代谢、癌症中心碳代谢以及烟酸和烟碱胺代谢通路。NC组和OE组相比,小鼠小肠中检测到VIP(variable importance in the projection)>2的差异代谢物有16种,显著性差异代谢物包括甘油磷酰胆碱、棕榈酸、3-羟基丁酰肉碱、β-羟丁酸等。代谢物富集到的显著性差异通路为胆碱代谢通路。结论口腔癌皮下移植瘤可引起小鼠小肠的代谢物发生变化,主要改变了小肠中与能量代谢相关的代谢物。过表达miR-181a-5p影响口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠代谢物,代谢物富集通路为胆碱代谢通路。

MiR-181a-5p调控乳头状甲状腺癌细胞增殖和侵袭的作用及分子机制研究

目的探讨miR-181a-5p对乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer,PTC)细胞的作用及调控机制。方法利用生物信息学工具分析miR-181a-5p和促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor,TSHR)在PTC组织中的表达以及两者的靶向关系,并使用双荧光素酶报告基因实验验证两者的靶向关系。TPC-1细胞转染miR-181a-5p抑制物和shTSHR后,使用定量逆转录聚合酶链反应或免疫印迹实验检测TPC-1细胞中miR-181a-5p、TSHR、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达水平。通过MTT和Transwell实验检测miR-181a-5p和TSHR对TPC-1细胞活性、侵袭的作用。结果在PTC组织和细胞中miR-181a-5p表达上调(P<0.001),在甲状腺癌组织中TSHR低表达,且miR-181a-5p可直接靶向TSHR。下调miR-181a-5p抑制了TPC-1细胞活性、侵袭以及N-cadherin和Vimentin的表达(P<0.01),但促进了E-cadherin的表达(P<0.001)。TSHR敲减产生了相反的结果(P<0.01),并部分逆转了miR-181a-5p下调对TPC-1细胞的影响(P<0.01)。反之,miR-181a-5p下调可以逆转TSHR敲减产生的影响(P<0.05)。结论下调miR-181a-5p可通过促进TSHR的表达来抑制PTC细胞的恶性进展。

hsa-miR-181a-5p靶基因预测及生物信息学分析

目的对hsa-miR-181a-5p进行系统的生物信息学分析,预测hsa-miR-181a-5p的靶基因、基因功能及信号通路,并对其进行生物学功能注释。方法利用数据库对hsa-miR-181a-5p基因定位,分析其序列保守性和在人类组织器官中的表达情况;利用数据库进行靶基因预测分析;并将预测交集靶基因进行GO功能分析及KEGG通路富集分析和蛋白间相互作用(PPI)网络分析;最后利用A549细胞进行hsa-miR-181a-5p转染实验,进行转录组测序同步验证生物信息学预测结果。结果发现基因定位于人类基因组chr1、chr9染色体,成熟序列在物种间具有高度保守性。3个数据库交集靶基因有483个,包含PTEN、MAPK8、AKT3等基因,其分布在胞浆等细胞组分,执行蛋白质结合等生物功能,并参与信号转导等生物学过程。靶基因富集于MAPK、PI3K-Akt、胰岛素抵抗、癌症中的miRNA等信号通路,其编码的蛋白间形成复杂网络图。实验后转录组测序结果验证了生信分析的准确性,对预测及富集结果提供了有力支撑。结论hsa-miR-181a-5p在多种生物学过程发挥重要作用,尤其是在神经系统疾病、血液免疫系统疾病以及癌症的发生发展中其将成为相关疾病发生机制和防治研究的新靶点。

外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平对妊娠期糖尿病不良妊娠结局的预测价值

目的 探究外周血单个核细胞YY1转录因子(YY1)、微小RNA(miR)-181a-5p表达水平对妊娠期糖尿病(GDM)不良妊娠结局的预测价值。方法 纳入2020年6月至2022年6月该院收治的GDM患者200例作为GDM组,选取同期产检健康孕妇100例作为对照组。采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析YY1、miR-181a-5p表达水平对GDM患者不良妊娠结局的预测价值。结果 与对照组比较,GDM组外周血单个核细胞中YY1、miR-181a-5p表达水平均下降(P<0.05),GDM组产后出血、巨大儿、新生儿低血糖的发生率均上升(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,年龄、血糖控制不良是GDM患者妊娠不良结局的独立危险因素(P<0.05),外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平均是GDM患者妊娠不良结局的独立保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平单独及二者联合预测GDM患者不良妊娠结局的曲线下面积(AUC)分别为0.717、0.751、0.832,其中联合预测的AUC明显高于二者单独预测(P<0.05)。结论 GDM患者外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平降低可增加不良妊娠结局的风险,YY1、miR-181a-5p与GDM患者不良妊娠结局的关系密切,二者均可作为GDM患者不良妊娠结局的预测因子。

血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平对慢性肾小球肾炎患者预后的预测价值

目的探讨血清微小RNA(miR)-181a-5p、miR-132-5p水平与慢性肾小球肾炎患者3年内预后的关系。方法选取2018年1月—2020年4月中国人民解放军联勤保障部队第九〇一医院肾内科收治的慢性肾小球肾炎患者128例作为慢性肾小球肾炎组(肾炎组)和体检健康者130例作为健康对照组(对照组)。检测2组肾功能指标、血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平;分析血清miR-181a-5p、miR-132-5p与肾功能指标的相关性,影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的因素,血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的价值。结果与对照组比较,肾炎组血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平显著降低(t/P=47.860/<0.001、75.095/<0.001),血清尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、胱抑素C(CysC)水平显著升高,肾小球滤过率(eGFR)水平显著降低(t=27.103、16.387、37.145、47.506、28.550,P均<0.001);血清miR-181a-5p与miR-132-5p水平呈正相关,血清miR-181a-5p和miR-132-5p均与UA、BUN、Scr、CysC水平呈负相关,与eGFR水平呈正相关(r=0.572、-0.506、-0.514、-0.493、-0.627、0.605、-0.498、-0.546、-0.481、-0.609、0.612,P均<0.001);与预后良好亚组比较,预后不良亚组血清UA、BUN、SCr、CysC水平显著升高,eGFR、血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平显著降低(t=6.730、3.596、10.629、7.760、12.657、8.881、13.932,P均<0.001);高水平UA、高水平BUN、高水平SCr、高水平CysC、低水平eGFR、低水平miR-181a-5p、低水平miR-132-5p是影响慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的危险因素[OR(95%CI)=2.239(1.256~3.992)、2.768(1.237~6.194)、2.173(1.195~3.950)、1.806(1.204~2.709)、3.022(1.620~5.637)、2.565(1.349~4.879)、3.350(1.226~9.157)];血清miR-181a-5p、miR-132-5p及二者联合预测慢性肾小球肾炎患者3年内预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.832、0.801、0.904,其中二者联合预测的AUC显著高于各自单独预测AUC(Z/P=1.714/0.043、2.050/0.020)。结论慢性肾小球肾炎患者血清miR-181a-5p、miR-132-5p水平较低,二者与肾功能关系密切,二者联合有助于评估患者3年内预后情况。

炎症性肠病患者血清miR-181a-5p和miR-126表达水平及其与肠道菌群相关性的研究

目的探讨miR-181a-5p、miR-126在炎症性肠病(IBD)患者血清中的表达及其与肠道菌群的相关性。方法收集2016年10月至2018年12月保定市第二医院收治的100例活动期IBD患者作为研究组,根据IBD类型分为溃疡性肠炎(UC)组(60例)和克罗恩病(CD)组(40例),另选择同期在本院体检的50名健康志愿者作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time qPCR)检测血清miR-181a-5p、miR-126的表达水平,根据检测结果将IBD患者分为miR-181a-5p高表达组(70例)和低表达组(30例)、miR-126高表达组(80例)和低表达组(20例)。对各组的肠道菌群进行培养分析。采用Pearson法分析IBD患者血清miR-181a-5p、miR-126表达水平与肠道菌群数量的相关性。结果与对照组相比,研究组、UC组及CD组的血清miR-181a-5p、miR-126的相对表达量均显著升高(P均<0.05)。与对照组相比,UC组肠球菌属、酵母菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、乳杆菌属、小梭菌属数量显著增多(P<0.05),CD组肠球菌属、酵母菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、乳杆菌属数量显著增多(P<0.05)。与对照组相比,UC组拟杆菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、乳杆菌属的培养阳性率显著升高(P<0.05);与对照组相比,CD组酵母菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、乳杆菌属的培养阳性率显著升高(P<0.05)。与miR-181a-5p低表达组相比,miR-181a-5p高表达组肠球菌属、酵母菌属、葡萄球菌属的数量显著增多(P<0.05);与miR-126低表达组相比,miR-126高表达组肠球菌属、双歧杆菌属、消化球菌属、葡萄球菌属的数量显著增多(P<0.05)。miR-181a-5p表达水平与肠球菌属、酵母菌属、双歧杆菌属、肠杆菌属呈负相关(P<0.05),miR-126表达水平与消化球菌属、葡萄球菌属呈负相关(P<0.05)。结论IBD患者的血清miR-181a-5p、miR-126表达水平升高,两者与IBD患者肠道内肠球菌属、酵母菌属等菌群组成变化密切相关。

miR-181a-5p在ACS患者血清中表达及对人HCASMC细胞增殖迁移的调控作用、与ADAMTS1靶向关系

目的观察微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)在急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)患者血清中的表达及对人冠状动脉平滑肌细胞(human coronary artery smooth muscle cell,HCASMC)增殖和迁移的调控作用,探讨miR-181a-5p与血小板反应蛋白解整合素金属肽酶1(ADAMTS1)的靶向关系。方法采集100例ACS患者[ACS组,其中急性心肌梗死(AMI)患者55例、不稳定心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)患者44例]、40例冠脉造影结果阴性者(对照组)的外周静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测两组血清miR-181a-5p。取对数生长期HCASMC细胞,分为一、二、三、四组,采用脂质体转染法分别转染miR-181a-5p模拟物(miR-181a-5p mimics)、模拟物阴性对照(mimics-NC)、miR-181a-5p抑制物(miR-181a-5p inhibitor)及抑制物阴性对照(inhibitor-NC),培养48 h时采用CCK-8法测算细胞增殖能力、采用Transwell迁移实验测算细胞迁移能力,培养24 h时采用采用Western Blotting法检测各组细胞ADAMTS1蛋白。取对数生长期HCASMC细胞分为A、B、C、D四组,A组先后转染突变型ADAMTS1荧光素酶报告基因质粒(ADAMTS1-MUT)、miR-181a-5p mimics;B组先后转染ADAMTS1-MUT、mimics-NC;C组先后转染野生型ADAMTS1荧光素酶报告基因质粒(ADAMTS1-WT)、miR-181a-5p mimics;D组先后转染ADAMTS1-WT、mimics-NC,培养24 h时取各组细胞采用双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞相对荧光素酶活性。结果与对照组相比,ACS组患者血清miR-181a-5p相对表达量低(P<0.01);与UAP患者相比,AMI患者血清miR-181a-5p相对表达量低(P<0.01)。与二组相比,培养48 h时一组细胞增殖能力和迁移能力降低,培养24 h时一组细胞ADAMTS1蛋白相对表达量低(P均<0.01);与四组相比,培养48 h时三组细胞增殖能力和迁移能力高,培养24 h时三组细胞ADAMTS1蛋白相对表达量高(P均<0.01)。A、B、C、D组细胞荧光素酶活性分别为1.03±0.03、1.01±0.04、0.45±0.06、1.02±0.05;与B组相比,A组细胞荧光素酶活性明显低(P<0.05)。结论miR-181a-5p在ACS患者血清中低表达。miR-181a-5p可抑制HCASMC细胞的增殖、迁移,其机制可能为miR-181a-5p靶向促进细胞ADAMTS1蛋白表达。

血清miR-134-5p、miR-181a-5p联合检测对良恶性肺结节的鉴别价值

目的 探究血清微小RNA-134-5p(miR-134-5p)、微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)联合检测对良恶性肺结节的鉴别价值。方法 2021年1月~2021年12月本院就诊治疗的肺结节病人124例,根据病理结果分为良性组62例、恶性组62例;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定血清miR-134-5p、miR-181a-5p水平;采用Pearson分析血清miR-134-5p与miR-181a-5p相关性;采用多因素Logistic回归分析病人肺结节为恶性的影响因素;采用受试者工作特征曲线(ROC)评价血清miR-134-5p、miR-181a-5p在鉴别肺结节病人为良恶性中的价值。结果 恶性组肺结节病人血清miR-134-5p、miR-181a-5p水平较良性组显著降低(P<0.05);肺结节病人血清miR-134-5p水平与miR-181a-5p呈正相关(r=0.547,P<0.05);恶性肺结节病人血清miR-134-5p、miR-181a-5p水平与淋巴结是否转移、结节直径相关(P<0.05);miR-134-5p、miR-181a-5p为病人肺结节为恶性的独立保护因素,结节直径为独立危险因素(P<0.05);ROC分析显示,血清miR-134-5p、miR-181a-5p水平联合诊断的AUC为0.931,均优于两者单独鉴别(P<0.05)。结论 恶性肺结节病人血清miR-134-5p、miR-181a-5p水平较良性病人均显著降低,两者联合检测对良恶性肺结节的鉴别具有重要价值。

miR-181a-5p对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo浸润和迁移的影响及作用机制

目的探讨miR-181a-5p对胎盘滋养层细胞HTR-8/SVneo浸润和迁移能力的影响及其潜在的作用机制。方法在HTR-8/SVneo细胞中,采用Transwell实验检测过表达miR-181a-5p后浸润和迁移能力的变化情况,通过qRT-PCR验证miR-181a-5p的过表达情况,并通过明胶酶谱实验检测过表达miR-181a-5p后MMP-2和MMP-9的表达情况。结果转染miR-181a-5p类似物的HTR-8/SVneo细胞中,发生浸润的细胞数目是对照组的(0. 45±0. 10)倍,迁移的细胞数目是对照组的(0. 58±0. 16)倍(均P <0. 01);实验组MMP-9蛋白表达量(271. 29±0. 11)低于对照组(1 481. 00±0. 16),差异有统计学意义(P <0. 01);实验组MMP-2蛋白表达量(555. 70±0. 09)与对照组(596. 50±0. 13)相比,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 miR-181a-5p可能通过降调HTR-8/SVneo细胞中MMP-9的分泌而抑制其浸润和迁移能力。

miR-181a-5p靶向PIAS1对雨蛙肽诱导的急性胰腺炎腺泡细胞损伤的影响

背景急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)引起的急性炎症对人们健康的危害性极大,严重时会危及生命.其发病机制复杂,尚未完全清楚,研究发现miRNA参与了AP的发病过程.研究发现miR-181a-5p可抑制癌细胞迁移、侵袭和血管生成;miR-181a-5p还能抑制胃癌细胞增殖、侵袭,转移和上皮间充质转化.抑制miR-181a-5p表达可通过负向靶向INPP5A抑制细胞增殖和侵袭,增强宫颈癌细胞凋亡.miR-181a可抑制胰腺癌细胞系的生长、减少迁移,增加凋亡.但miR-181a-5p在AP的增殖凋亡中的影响及作用机制尚不清楚.目的研究miR-181a-5p对AP腺泡细胞损伤的影响及潜在的作用机制.方法用100 nmol/L的雨蛙肽处理大鼠胰腺腺泡AR42J和MPC-83构建AP模型,设置Con组、Caerulein组、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-181a-5p组(转染miR-181a-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染antimiR-NC)、anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p)、Caerulein+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p后进行Caerulein处)、Caerulein+pcDNA组(转染pcDNA后进行Caerulein处理)、Caerulein+pcDNA-PIAS1组(转染pcDNA-PIAS1后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-NC组(anti-miR-181a-5p和si-NC共转染后进行Caerulein处理)、Caerulein+anti-miR-181a-5p+si-PIAS1组(anti-miR-181a-5p和si-PIAS1共转染后进行Caerulein处理),用脂质体法转染至AR42J和MPC-83细胞.酶联免疫吸附试验法检测雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的TNF-α和IL-6的表达;qRT-PCR检测AR42J和MPC-83细胞中miR-181a-5p、PIAS1 mRNA的表达水平;Western Blot检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性.结果雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞后,TNF-α和IL-6的表达显著升高;miR-181a-5p的表达水平显著升高;PIAS1 mRNA和蛋白的表达水平显著降低.miR-181a-5p抑制表达和PIAS1过表达抑制TNF-α和IL-6的表达,抑制细胞凋亡.miR-181a-5p靶向负调控PIAS1;抑制PIAS1表达逆转了抑制miR-181a-5p对雨蛙肽处理AR42J和MPC-83细胞的凋亡抑制作用.结论抑制miR-181a-5p表达可以抑制雨蛙肽诱导的AP腺泡细胞损伤,其机制可能与靶向调控PIAS1有关.可为AP诊断和治疗提供新靶点和新思路.

miR-181a-5p对人主动脉平滑肌细胞成骨样分化的影响

目的观察miR-181a-5p对动脉钙化细胞模型的影响,探讨其可能的作用机制。方法培养人主动脉平滑肌细胞(HASMC),经成骨样分化诱导后使用茜红素染色检测细胞成骨样分化的程度,采用real-time PCR检测成骨样分化标志基因骨钙素(OCN)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达变化,以及miR-181a-5p的表达变化,分析miR-181a-5p与成骨样分化相关基因表达水平的相关性。miR-181a-5p mimic转染用于上调HASMC内miR-181a-5p的表达。使用TargetScan数据库预测miR-181a-5p发挥作用的靶基因。使用real-time PCR检测miR-181a-5p过表达后对靶基因表达的影响。结果HASMC经诱导成骨样分化后,茜红素染色阳性区域和细胞内钙含量逐渐增加,细胞中成骨样分化相关基因OCN、RUNX2和ALP的表达随时间延长逐渐升高,而miR-181a-5p的表达逐渐下降(P<0.05)。相关性分析显示miR-181a-5p的表达与OCN、RUNX2和ALP的表达均呈负相关(P<0.05)。使用miR-181a-5p mimic转染HASMC后细胞内miR-181a-5p的表达高于对照mimic组,细胞内钙含量及RUNX2和OCN的表达均低于对照mimic组(P<0.05)。TargetScan数据库预测结果显示miR-181a-5p可与促成骨样分化基因丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)和丝裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)的3′UTR区结合,miR-181a-5p mimic组HASMC中靶基因MAPK1和MAPK8的表达显著下调(P<0.05)。结论血管平滑肌细胞成骨样分化时下降的miR-181a-5p可抑制成骨样分化,其可能的机制是抑制促钙化信号转导分子MAPK1和MAPK8的表达。

miR-181a-5p对缺氧诱导的大鼠肺动脉高压的影响

目的探讨miR-181a-5p在缺氧诱导的大鼠肺动脉高压(PAH)中的作用与机制。方法使用野百合碱(MCT)诱导建立PAH大鼠模型,使用miR-181a-5p过表达慢病毒(LV-miR-181a-5p)进行干预,利用HE染色法观察肺动脉组织的病理形态学变化。原代分离与提取大鼠肺动脉内皮细胞,通过缺氧诱导建立PAH细胞模型,在此基础上使用LV-miR-181a-5p进行干预,实时PCR技术检测细胞miR-181a-5p基因的表达;Western blotting检测细胞VEGF、MMP-2与MMP-9蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖水平。结果与对照组大鼠比较,模型组大鼠肺动脉组织中膜明显增厚,肺血管生成数量显著增多,内皮细胞损伤;过表达miR-181a-5p后,LV-miR181a-5p组大鼠肺动脉组织中膜增厚、肺血管生成数量增多、内皮细胞损伤现象显著改善。与对照组细胞比较,模型组细胞miR-181a-5p的表达水平显著下降(P<0.05),VEGF、MMP-2与MMP-9的蛋白表达水平及细胞增殖能力显著升高(P<0.05);过表达miR-181a-5p后,细胞miR-181a-5p的表达水平显著上升(P<0.05),VEGF、MMP-2与MMP-9的蛋白表达水平及细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。结论miR-181a-5p能够降低肺动脉内皮细胞血管生成能力与增殖能力,改善缺氧诱导的大鼠PAH。

长链非编码RNA CCAT1通过调控miR-181a-5p促进肺癌细胞增殖和转移的机制

目的:研究长链非编码RNA结肠癌相关转录本1(long non-coding RNA colon cancer-associated transcript-1,lncRNA CCAT1)调控miR-181a-5p对肺癌细胞增殖和转移能力的影响,并探讨其作用机制。方法:采用qRT-PCR检测CCAT1和miR-181a-5p在肺癌细胞系A549,PC-9和H226及正常人支气管上皮细胞16HBE中的表达水平。采用生物信息学软件和双荧光素酶报告基因检测CCAT1和miR-181a-5p的靶向调控关系;常规培养CCAT1表达最高的肺癌细胞系,分为NC组、si-CCAT1组和si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor,分别进行空白、CCAT1 siRNA和CCAT1 siRNA+miR-181a-5p inhibitor的转染。qRT-PCR检测各组细胞中CCAT1和miR-181a-5p的表达水平;MTS和平板克隆检测CCAT1对各组细胞增殖能力的影响;Transwell检测CCAT1对各组细胞转移能力的影响;蛋白质印迹法检测各组细胞中MAPK信号通路的活性。结果:正常人支气管上皮细胞16HBE相比,CCAT1在肺癌细胞系中的表达均增加,miR-181a-5p在肺癌细胞系中的表达均降低。CCAT1在A549细胞中的表达最高。与NC组相比,CCAT1在si-CCAT1和si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组中表达降低;与si-CCAT1组相比,CCAT1在si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组中表达增加;与NC组相比,miR-181a-5p在si-CCAT1和si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组中表达增加;与si-CCAT1组相比,miR-181a-5p在si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组中表达降低。生物信息学软件和双荧光素酶报告基因结果显示CCAT1与miR-181a-5p有结合位点。与NC组相比,si-CCAT1和si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组细胞的增殖、转移能力和MAPK信号通路活性降低;与si-CCAT1组相比,si-CCAT1+miR-181a-5p inhibitor组细胞增殖、转移能力和MAPK信号通路活性增加。结论:CCAT1通过调控miR-181a-5p促进肺癌细胞增殖和转移。CCAT1可能是治疗肺癌的潜在靶点。

lncRNA NEAT1/miR-181a-5p/bcl-2轴在脓毒症致急性肺损伤中的作用机制研究

目的探讨lnc RNA NEAT1/miR-181a-5p/bcl-2轴在脓毒症急性肺损伤(ALI)中的作用及机制。方法结扎盲肠头尾端穿孔(CLP)构建脓毒症ALI小鼠模型,将C57BL/6雄性小鼠分为假手术组和ALI组,每组各8只。术后24 h取肺组织,测定肺湿/干比(W/D),苏木素-伊红(HE)染色后光镜观察肺组织形态学改变,qRT-PCR检测肺组织长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1,NEAT1的海绵miR-181a-5p以及结合蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)的表达水平。双荧光素酶报告基因实验检测NEAT1和mi R-181a-5p的结合情况。通过Western blot检测肺组织中miR-181a-5p结合蛋白bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果与假手术组相比,ALI组小鼠W/D明显升高(P<0.01);HE染色发现ALI组部分肺组织呈实质肺泡萎缩或消失。与假手术组相比,ALI组小鼠肺组织中lncRNA NEAT1的表达水平显著升高(P<0.01),miR-181a-5p的表达水平显著降低(P<0.01),bcl-2的表达水平显著下降(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验发现NEAT1和miR-181a-5p存在结合位点。结论lncRNA NEAT1通过lnc RNA NEAT1/miR-181a-5p/bcl-2轴发挥了促肺组织细胞凋亡的作用。

circATRNL1靶向miR-181a-5p对高糖诱导肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨circATRNL1靶向miR-181a-5p对高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的影响。方法将HK-2细胞分为对照(Con)组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖(HG)组(25 mmol/L葡萄糖)、HG+pcDNA组(转染pcDNA,25 mmol/L葡萄糖)、HG+pcDNA-circATRNL1组(转染pcDNA-circATRNL1,25 mmol/L葡萄糖)、HG+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC,25 mmol/L葡萄糖)、HG+anti-miR-181a-5p组(转染anti-miR-181a-5p,25 mmol/L葡萄糖)、HG+pcDNA-circATRNL1+miR-NC组(转染pcDNA-circATRNL1和miR-NC,25 mmol/L葡萄糖)、HG+pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p组(转染pcDNA-circATRNL1和miR-181a-5p模拟物,25 mmol/L葡萄糖)。RT-qPCR检测circATRNL1和miR-181a-5p表达;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA试剂盒检测细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平。双荧光素酶报告实验分析circATRNL1和miR-181a-5p的相互作用。结果与Con组比较,HG组HK-2细胞凋亡率、miR-181a-5p相对水平、细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05),circATRNL1相对水平显著降低(P<0.05)。与HG+pcDNA组比较,HG+pcDNA-circATRNL1组HK-2细胞凋亡率、细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05)。与HG+anti-miR-NC组比较,HG+anti-miR-181a-5p组HK-2细胞凋亡率、细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05)。circATRNL1与miR-181a-5p直接特异性结合。与HG+pcDNA-circATRNL1+miR-NC组比较,HG+pcDNA-circATRNL1+miR-181a-5p组HK-2细胞凋亡率、细胞培养上清中IL-6和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。结论circATRNL1靶向miR-181a-5p可抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和炎症损伤。

MiR-181a-5p通过靶向KLF6信号调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移的机制研究

目的探讨miR-181a-5p对肺动脉血管平滑肌细胞增殖以及迁移的影响,并探索了相应的分子调控通路。方法本研究于2021年11月—2022年5月进行,实时定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测肺动脉平滑肌细胞中miR-181a-5p和KLF6 mRNA的表达水平;CCK-8试验检测肺动脉平滑肌细胞的活性;双荧光素酶试验检测miR-181a-5p与KLF6的相互作用。结果低氧诱导能够促进肺动脉平滑肌细胞的活性并抑制miR-181a-5p的表达。miR-181a-5p过表达能够部分反转低氧诱导对肺动脉平滑肌细胞的活性和迁移。miR-181a-5p敲减能够促进肺动脉平滑肌细胞的活性和迁移。miR-181a-5p能够靶向KLF6的3’UTR区域从而抑制KLF6在肺动脉平滑肌细胞的表达。营救试验发现,KLF6过表达能够反转miR-181a-5p过表达对低氧诱导的肺动脉血管平滑肌细胞增殖、迁移的抑制作用。结论本研究结果提示miR-181a-5p能够抑制低氧诱导下的肺动脉平滑肌细胞增殖和迁移,其作用机制可能是通过靶向抑制KLF6表达来实现。

miR-181a-5p靶向HMGB1调节急性胰腺炎腺泡细胞凋亡的实验研究

目的探讨miR-181a-5p调控HMGB1的表达在雨蛙素(cerulein)联合脂多糖(lipopolyasccharide,LPS)诱导的严重急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)大鼠胰腺腺泡细胞(AR42J)凋亡相关基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的影响。方法以未处理的AR42J细胞作为正常组,1×10-8 mol/L的cerulein联合10μg/mL的LPS诱导AR42J细胞24 h建立体外严重AP组,用脂质体转染法将miR-NC(空载体)和miR-181a-5p mimic转染至严重AP组作为miR-NC对照组和miR-181a-5p过表达组。采用qRT-PCR检测AR42J细胞中miR-181a-5p、HMGB1和Caspase-3 m RNA的表达水平;Western Blot检测HMGB1和Caspase-3蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验明确miR-181a-5p和HMGB1的靶向关系;Pearson相关分析确定miR-181a-5p、HMGB1和Caspase-3 mRNA表达的相互关系。结果与正常组相比,严重AP组中miR-181a-5p mRNA表达水平显著下调(P<0.01),HMGB1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01),Caspase-3 mRNA表达水平升高(P<0.05),HMGB1、Caspase-3的蛋白表达升高(P<0.05);与miR-NC对照组相比,miR-181a-5p过表达组miR-181a-5p mRNA表达水平显著上调(P<0.01),HMGB1、Caspase-3 mRNA表达水平显著下降(P<0.01),HMGB1、Caspase-3的蛋白表达下降(P<0.05);双荧光素酶报告基因显示miR-181a-5p可抑制野生型HMGB1细胞的荧光活性,miR-181a-5p可靶向调控HMGB1的表达;Pearson相关性分析显示,miR-181a-5p与HMGB1表达水平呈负相关(r=-0.905,P<0.01);miR-181a-5p与Caspase-3表达水平呈负相关(r=-0.809,P<0.01);HMGB1与Caspase-3表达水平呈正相关(r=0.691,P<0.05)。结论miR-181a-5p在cerulein+LPS诱导AR42J细胞中低表达,HMGB1和Caspase-3高表达,过表达miR-181a-5p可抑制凋亡相关基因Caspase-3的表达,其机制可能与靶向HMGB1有关,这将为AP的诊断及治疗提供新的思路。

miR-181a-5p靶基因预测及其在鹅卵泡颗粒层中的表达分析

为深入探究miR-181a-5p在鹅颗粒细胞中可能的功能及其作用机制奠定基础。以多个网络数据库资源为基础,通过生物信息学的方法预测可能的靶基因及其信号通路,然后利用q PCR检测miR-181a-5p及其靶基因在不同阶段颗粒层中的表达水平。结果显示,miR-181a-5p在脊椎动物中高度保守;靶基因的GO和KEGG分析发现,miR-181a-5p主要参与调控细胞的增殖、分化、凋亡等过程,多数靶基因主要富集到FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路;根据靶基因互作网络图,筛选出10个核心靶基因VEGFA、MAPK1、FOS、KRAS、HRAS、SIRT1、BCL2、ESR1、PTEN和CDKN1A,其中多数靶基因均与细胞增殖凋亡相关。结果表明,miR-181a-5p在2～4 mm表达量最高,但在4～6 mm急剧下降,之后在4～6 mm、8～10 mm、F5这3个阶段均呈现显著上升趋势。miR-181a-5p可能通过靶向调控SIRT1、BCL2、CDKN1B、PTEN等基因,参与FOXO、MAPK、PI3K-Akt等信号通路来调控颗粒细胞的增殖凋亡过程。

miR-181a-5p靶向LRRFIP1基因介导高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及炎症反应

目的:探讨微小RNA-181a-5p(miR-181a-5p)靶向富含亮氨酸的重复失速相互作用蛋白1(LRRFIP1)基因介导高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡及炎症反应的分子机制。方法:体外培养小鼠肾小球系膜细胞SV40MES13,30 mmol/L高糖处理肾小球系膜细胞建立细胞损伤模型。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)与蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测miR-181a-5p、LRRFIP1的表达量。分别将miR-181a-5p mimics、miR-NC、si-LRRFIP1、si-NC、pcDNA-LRRFIP1与miR-181a-5p mimics、pcDNA-NC与miR-181a-5p mimics转染至肾小球系膜细胞,使用含有30 mmol/L高糖培养基培养细胞。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶实验检测miR-181a-5p过表达对野生型和突变型LRRFIP1荧光素酶活性的影响;Western blot检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)表达量。结果:高糖处理后,miR-181a-5p的表达水平显著降低(P<0.05),LRRFIP1的表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05);miR-181a-5p过表达或抑制LRRFIP1表达后,细胞凋亡率显著升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3蛋白水平显著升高(P<0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著降低(P<0.05);双荧光素酶实验结果证实miR-181a-5p能够抑制LRRFIP1的3′-UTR区荧光素酶活性(P<0.05);与miR-181a-5p+pcDNA-NC+HG组相比,miR-181a-5p+pcDNA-LRRFIP1+HG组细胞凋亡率显著降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3蛋白水平显著降低(P<0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著升高(P<0.05)。结论:miR-181a-5p靶向干扰LRRFIP1的表达从而促进高糖诱导的肾小球系膜细胞凋亡,降低炎症反应。