miR-18a-5p靶向调控RORA在结直肠癌增殖进展中的作用及临床意义

目的探讨miR-18a-5p和RORA在结直肠癌增殖中的作用机制及临床意义。方法采用qRT-PCR、FISH、IHC方法检测miR-18a-5p和RORA在结直肠癌细胞和组织中的表达情况。通过EdU和CFSE实验检测细胞增殖能力、FCM实验检测细胞凋亡情况,细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力。进一步通过双荧光素酶报告实验、细胞功能挽救实验、RT-PCR和Western blot实验验证miR-18a-5p对RORA的靶向调控作用。最后运用生物信息学探究miR-18a-5p调控RORA促进结直肠癌恶性增殖和侵袭进展的分子机制。结果miR-18a-5p在结直肠癌组织和细胞中高表达(P<0.05),并且能够促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.05)。此外RORA是miR-18a-5p的靶基因,过表达RORA能够有效消减miR-18a-5p促结直肠癌细胞恶性生物学表型的作用(P<0.05)。RORA在结直肠癌组织中的表达与CD8+T细胞浸润及其表面标志蛋白CD8A的表达显著正相关(P<0.05)。结论miR-18a-5p可能通过靶向调控RORA促进结直肠癌的进展;miR-18a-5p/RORA调控通路可能参与了结直肠癌免疫微环境的塑造,是结直肠癌的潜在治疗靶点。

齐墩果酸通过miR-18a-5p/STK4轴抑制白血病K562细胞恶性进展

慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是由于骨髓造血干细胞的恶性增生导致的疾病。虽然酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKI)对慢性粒细胞性白血病的治疗取得长足进展,但耐药问题仍未解决。因此,寻找新的治疗药物和靶点十分关键。有研究表明,miRNAs与慢性粒细胞白血病在内的多种肿瘤有密切联系,齐墩果酸(oleanolic acid,OA)对白血病细胞有较好的抑制效果。通过对转录物组测序结果发现,齐墩果酸可以显著上调丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶4(serine/threonine-protein kinase 4,STK 4)的水平,而miR1a-5p是STK 4的靶miRNA。因此,本文旨在探究齐墩果酸是否可以通过miR-18a-5p/STK4影响K562细胞恶性进展。K562细胞经齐墩果酸处理后差异表达基因富集在凋亡相关通路上。EdU实验和CCK-8实验结果发现,齐墩果酸降低K562细胞增殖能力(P<0.05)。qRT-PCR,免疫荧光和Western印迹结果显示,齐墩果酸处理后,K562细胞中STK 4蛋白质水平表达显著上调(P<0.05),miR-18a-5p表达下调(P<0.05)。在细胞中转染miR-18a-5p mimics,能显著抑制STK 4的表达(P<0.05);转染miR-18a-5p inhibitor能显著增加STK 4的表达(P<0.05)。活性氧(reactive oxygen species、ROS)检测和线粒体膜电位检测结果显示,齐墩果酸可以促进K562细胞中ROS的增加,降低线粒体膜电位。过表达STK 4后,与Vector组相比,细胞的线粒体膜电位下降;敲降STK 4可以逆转齐墩果酸组导致的线粒体膜电位下降。流式细胞术检测显示,齐墩果酸能明显促进细胞凋亡的发生,而转染miR-18a-5p mimics后凋亡率显著下调(P<0.05);过表达STK 4可以促进细胞从早期凋亡向晚期凋亡转化,而同时转染miR-18a-5p mimics可以抑制这一现象。我们的研究结果证实,齐墩果酸可以通过维持miR-18a-5p的低表达和保持STK 4的高表达状态来促进K562细胞的凋亡。

circDCUN1D4调节miR-18a-5p/FBP1轴对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的探讨环状RNA(circRNA)DCUN1D4调节微小RNA(miR)-18a-5p/果糖-1,6-二磷酸酶1(FBP1)轴对肺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响。方法选取人肺癌细胞系(H1975、H1650、A549、SPCA-1)和人正常肺表皮细胞(HPL-1),qRT-PCR检测各种细胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表达水平。取对数生长期的A549细胞并分为空白组、circDCUN1D4过表达质粒(circDCUN1D4)组、过表达质粒阴性对照(NC)组、circDCUN1D4+miR-18a-5p模拟物阴性对照(circDCUN1D4+mimics NC)组、circDCUN1D4+miR-18a-5p模拟物(circDCUN1D4+miR-18a-5p mimics)组。CCK-8法检测各组A549细胞活力,流式细胞术检测各组A549细胞凋亡水平,qRT-PCR检测各组A549细胞中circDCUN1D4、miR-18a-5p、FBP1 mRNA表达水平,Western blot检测各组A549细胞中FBP1、caspase-3、Ki67、增殖细胞核抗原(PCNA)及程序性死亡分子配体-1(PD-L1)表达水平,双荧光素酶实验验证miR-18a-5p分别与circDCUN1D4、FBP1的靶向关系。结果与HPL-1细胞相比,人肺癌细胞系中circDCUN1D4、FBP1 mRNA表达显著下降(P<0.05),miR-18a-5p表达显著增加(P<0.05)。miR-18a-5p分别与circDCUN1D4、FBP1存在靶向关系。与空白组、NC组相比,circDCUN1D4组细胞24 h和48 h的OD值、Ki67、PCNA、miR-18a-5p、PD-L1表达显著降低(P<0.05),细胞凋亡率、circDCUN1D4、FBP1、caspase-3表达显著增加(P<0.05);过表达miR-18a-5p逆转了circDCUN1D4对肺癌细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05)。结论circDCUN1D4过表达可以促进肺癌细胞凋亡,抑制肺癌细胞增殖及免疫逃逸,其作用机制可能与调控miR-18a-5p/FBP1轴有关。

MiR-18a-5p通过介导自噬加重同型半胱氨酸诱导的心肌损伤

目的:高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平是心脑血管疾病的独立危险因素。MiR-18a-5p是微RNA(microRNA,miR)家族中的重要成员,与心血管疾病密切相关。本研究旨在探讨miR-18a-5p对Hcy损伤心肌细胞的影响。方法:对H9c2细胞进行miR-18a-5p模拟物(mimic)/miR-18a-5p mimic阴性对照(negative control,NC)转染或与Hcy联合干预,另设未处理细胞作为对照组。采用实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)验证转染效率,细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,蛋白质印迹法检测微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassociated protein 1 light chain 3,LC3)-I、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62、Bax、Bcl-2和Notch2的蛋白质表达水平,双荧光素酶报告分析检测miR-18a-5p与Notch2的相互作用。结果:与对照组相比,Hcy或转染miR-18a-5p mimic单独处理,或转染miR-18a-5p mimic/miR-18a-5p mimic NC与Hcy联合干预均显著降低H9c2细胞的活力,增加H9c2细胞的凋亡率和ROS的生成,上调Bax和Beclin1的蛋白质表达水平,下调Bcl-2、p62和Notch2的蛋白质表达水平,同时使LC3-Ⅱ/LC3-I值增加(均P<0.05)。与miR-18a-5p mimic NC和Hcy联合干预相比,miR-18a-5p mimic和Hcy联合干预的H9c2细胞上述指标的改变更显著,且2组之间差异有统计学意义(均P<0.05)。Notch2与miR-18a-5p存在靶向结合。结论:MiR-18a-5p通过增加心肌细胞内ROS的生成,诱导自噬和凋亡,加重Hcy诱导的心肌损伤。Notch2是miR-18a-5p的作用靶点。

血清miRNA-107、miR-18a-5p对胃癌和癌前病变的鉴别诊断价值

目的:探究在胃癌和癌前病变中血清miRNA-107、miR-18a-5p的鉴别诊断价值。方法:选取2020年6月至2023年6月我院收治的60例胃癌患者作为胃癌组,50例癌前病变患者作为癌前病变组,另选取在我院进行体检的健康人群30例作为健康对照组。比较三组受检者血清miRNA-107、miR-18a-5p水平,探讨其表达水平在临床诊断价值。结果:三组受检者性别、年龄无统计学差异(P>0.05);与健康对照组相比,胃癌组与癌前病变组血清miRNA-107、miR-18a-5p指标较高(P<0.05);与癌前病变组相比,胃癌组血清miRNA-107、miR-18a-5p指标较高(P<0.05)。本次研究中以病理结果为“金标准”发现,本次研究中联合miRNA-107与miR-18a-5p阳性例数高于单独血清检测阳性例数,统计学有差异性(P<0.05)。与血清miRNA-107、miR-18a-5p相比,二项联合灵敏度、特异度和准确度均较高,统计学有差异性(P<0.05)。结论:血清miRNA-107、miR-18a-5p在胃癌和癌前病变患者均存在高表达,说明其在胃癌和癌前病变中具有较高的鉴别诊断价值。

血清miR-18a-5p、miR-21在老年胃癌临床诊断及预后评估中的应用

目的 探讨血清微小RNA-18a-5p(miR-18a-5p)、微小RNA-21(miR-21)在老年胃癌临床诊断及预后评估中的价值。方法 收集85例胃癌患者(胃癌组)术前和术后血清,以及45例非胃癌对照者(对照组)血清,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测两组受试者血清样本中miR-18a-5p和miR-21的表达水平,分析其在不同临床病理特征老年胃癌患者中的表达,探讨其表达水平在临床诊断及预后评估中的价值。结果 胃癌组血清miR-18a-5p、miR-21、癌胚抗原(CEA)及糖类抗原199(CA199)水平均高于对照组(P<0.05);血清miR-18a-5p、miR-21、CEA及CA199诊断胃癌的曲线下面积(AUC)分别为0.750、0.807、0.656、0.690,4项联合诊断的AUC为0.879,明显高于各单一指标(P<0.05);不同TNM分期、肿瘤最大径、肿瘤浸润深度、组织分化程度及淋巴结转移情况的胃癌患者miR-18a-5p、miR-21表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与术前比较,术后患者miR-18a-5p、miR-21、CEA及CA199表达水平均下降(P<0.05);预后良好者术后30 d时血清miR-18a-5p、miR-21、CEA及CA199表达水平均低于预后不良者(P<0.05);术后30 d时血清miR-18a-5p、miR-21、CEA及CA199联合预测胃癌不良预后的AUC为0.821,明显高于各单一指标(P<0.05)。结论 血清miR-18a-5p、miR-21表达水平在老年胃癌患者中异常升高,可辅助性用于患者临床诊断和预后评估。

miR-18a-5p在鸡不同生长时期的表达及其生物信息学分析与靶基因预测

为探究miR-18a-5p在鸡不同生长时期组织表达变化规律及其生物信息学特点,本研究以苏禽3号鸡为试验动物,利用实时荧光定量PCR技术检测不同生长时期鸡miR-18a-5p的组织表达变化。通过文献和miRBase检索脊椎动物的miR-18a-5p序列,利用Ensembl数据库确定miR-18a-5p在基因组中的位置,根据成熟序列构建系统进化树;使用miRmap、microT、miRanda和TargetScan网站预测miR-18a-5p靶基因,并进行GO和KEGG分析。组织表达分析结果显示,miR-18a-5p序列在鸡心脏、脾脏、肾脏和下丘脑中的表达量显著高于除大脑以外的其他组织(P<0.05)。与3日龄雏鸡相比,90日龄鸡心脏、脾脏、肾脏、腿肌和下丘脑中miR-18a-5p的表达量均显著上升(P<0.05)。在50种脊椎动物中共发现52条miR-18a-5p序列,几乎所有物种都只有1条成熟序列;基因定位分析发现,鸡miR-18a-5p位于1号染色体上的基因间隔区。多序列比对分析表明,不同物种miR-18a-5p的成熟序列同源性较高,物种间较为保守。系统进化树分析发现,鸡miR-18a-5p与原鸽、斑胸草雀等其他鸟类聚为一类,这表明miR-18a-5p进化过程中是保守的。靶基因预测和功能分析发现,miR-18a-5p共有121个靶基因。GO分析结果显示,靶基因主要富集到蛋白质泛素化、细胞周期阻滞、白细胞介素-6产生的负调控等功能。KEGG通路分析表明,靶基因主要富集到细胞周期及Wnt和FoxO信号通路等。多个与肌肉生长及细胞增殖等相关的基因富集到相关通路之上。综上,鸡miR-18a-5p是组织广泛表达的miRNA,其可能通过Wnt及FoxO信号通路调控肌肉生长及细胞增殖分化。本研究为miR-18a-5p功能及调控机制的深入研究提供参考依据。

miR-18a-5p调控PSORS1C1对类风湿关节炎成纤维细胞样滑膜细胞迁移、侵袭及炎症反应的影响

目的探讨微小RNA-18a-5p(miR-18a-5p)对类风湿关节炎成纤维细胞(SFs)样滑膜细胞迁移、侵袭及炎症反应的影响及其作用机制。方法体外培养人类风湿关节炎滑膜成纤维细胞MH7A,分为miR-18a-5p组、miR-NC组、si-PSORS1C1组、si-NC组、miR-18a-5p+pcDNA3.1-PSORS1C1组、miR-18a-5p+pcDNA3.1组。qRT-聚合酶链反应(PCR)检测miR-18a-5p表达;分别采用Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭的情况。双荧光素酶报告基因实验检测miR-18a-5p与PSORS1C1的靶向关系;Western印迹检测PSORS1C1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、钙黏附蛋白-E(E-cadherin)蛋白表达;测定细胞上清液中白细胞介素(IL)-1、IL-2水平。结果miR-18a-5p在MH7A细胞中的表达水平显著降低(P<0.05),miR-18a-5p过表达可明显抑制MH7A细胞迁移及侵袭能力,IL-1水平与MMP-2表达水平显著降低(P<0.05),而IL-2水平与E-cadherin表达水平均显著升高(P<0.05);miR-18a-5p可靶向结合PSORS1C1;抑制PSORS1C1表达后,与si-NC组相比,MH7A细胞迁移及侵袭能力显著降低(P<0.05),IL-1水平与MMP-2表达水平显著降低(P<0.05),而IL-2水平与E-cadherin表达水平显著升高(P<0.05);过表达PSORS1C1可逆转miR-18a-5p对MH7A细胞迁移、侵袭及炎症因子的作用。结论miR-18a-5p过表达通过抑制PSORS1C1表达而减弱SFs样滑膜细胞迁移、侵袭能力,并可减轻炎症反应。

circ_0007762通过miR-18a-5p调节肺成纤维细胞自噬的机制研究

目的探索circ_0007762和miR-18a-5p的相互作用及在肺成纤维细胞中的作用。方法利用生物信息学分析circ_0007762在特发性肺纤维化(IPF)患者的表达并筛选其miRNA靶标,在转化生长因子(TGF)-β1干预的肺成纤维细胞HFL1中验证其表达。双荧光素酶报告基因实验验证miR-18a-5p mimics与报告基因载体共转染后的荧光素酶活性。CCK-8法检测circ_0007762、miR-18a-5p敲低及TGF-β1、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预后的细胞活力。Western blot检测circ_0007762、miR-18a-5p敲低及TGF-β1、3-MA干预后的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、P62及微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)水平。结果HFL1细胞中,TGF-β1组较Control组circ_0007762表达水平上调,miR-18a-5p表达下调(P<0.05)。在circ_0007762野生型载体中,过表达miR-18a-5p抑制了荧光素酶活性(P<0.05)。circ_0007762敲低后细胞增殖活力下降,并由miR-18a-5p的抑制而恢复,同时3-MA可逆转TGF-β1诱导的成纤维细胞增殖(P<0.05)。TGF-β1促进α-SMA、collagenⅠ及LC3BⅡ/Ⅰ表达,而抑制P62水平(P<0.05)。相较于TGF-β1+si-NC组,TGF-β1+si-circ_0007762组P62表达上调,其余蛋白下调,并能由miR-18a-5p的抑制而逆转(P<0.05)。此外,3-MA增强了P62的表达而降低了α-SMA、collagenⅠ的表达及LC3BⅡ/Ⅰ水平(P<0.05)。结论circ_0007762可与miR-18a-5p相互作用,通过激活自噬促进肺成纤维细胞增殖,诱导纤维化相关表型。

过表达miR-18a-5p对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

目的探讨过表达miR-18a-5p对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法将结肠癌SW480细胞随机分为miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组、空白对照组,miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组分别转染含miR-18a-5p-e GFP、NC-e GFP的质粒DNA,空白对照组不予转染。转染48 h,采用MTT法检测各组细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测各组早期凋亡率和晚期凋亡率,采用qRT-PCR法检测各组miR-18a-5p靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表达。结果 miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组细胞增殖抑制率分别为(66.02±0.51)%、(23.81±0.64)%,两组比较P<0.05。miR-18a-5p-e GFP组、NC-e GFP组早期凋亡率和晚期凋亡率均高于空白对照组,且miR-18a-5p-e GFP组高于NC-e GFP组(P均<0.05)。miR-18a-5p-e GFP组miR-18a-5p靶基因DUSP5、FZD3表达明显高于NC-e GFP组,CCND2表达明显低于NC-e GFP组(P均<0.05)。结论过表达miR-18a-5p能够抑制结肠癌SW480细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控靶基因DUSP5、FZD3、CCND2表达有关。

过表达miR-181a-5p的口腔癌皮下移植瘤小鼠模型的小肠代谢组学研究

目的通过检测口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢通路的变化,分析过表达miR-181a-5p对皮下移植瘤小鼠小肠中代谢物和代谢物组的影响。方法实验分为3组,空白对照(Control)组、阴性对照(negative control,NC)组以及实验(over expression of miR-181a-5p,OE)组。将不同组别处理后的细胞混悬液,通过皮下注射到M-NSG重度免疫缺陷雌性小鼠右侧腹股沟中上部,构建成口腔癌皮下移植瘤小鼠模型。按时记录小鼠体重变化,对小鼠小肠组织进行HE染色,观察各组病理变化。采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪和串联Orbitrap质谱联用仪检测NC组、OE组和Control组小鼠小肠中的代谢物,使用XCMS预分析原始数据,质量评价样本数据,鉴定Control组与NC组、NC组与OE组的差异代谢物,进行KEGG富集分析获取差异代谢通路。结果Control组和NC组小肠组织中共鉴定出170种差异代谢物。代谢物富集的显著性信号通路包括胆碱代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、γ-氨基丁酸(GABA)神经突触代谢、甘油磷脂代谢、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路代谢、癌症中心碳代谢以及烟酸和烟碱胺代谢通路。NC组和OE组相比,小鼠小肠中检测到VIP(variable importance in the projection)>2的差异代谢物有16种,显著性差异代谢物包括甘油磷酰胆碱、棕榈酸、3-羟基丁酰肉碱、β-羟丁酸等。代谢物富集到的显著性差异通路为胆碱代谢通路。结论口腔癌皮下移植瘤可引起小鼠小肠的代谢物发生变化,主要改变了小肠中与能量代谢相关的代谢物。过表达miR-181a-5p影响口腔癌皮下移植瘤小鼠小肠代谢物,代谢物富集通路为胆碱代谢通路。

益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠miR-126a-5p及VEGF信号通路的影响

目的探讨益气活血通络方对脊髓型颈椎病模型大鼠微小RNA-126a-5p(miR-126a-5p)及血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的影响。方法30只健康雄性SD大鼠按照随机数字表法均分为假手术组、模型组和中药组。模型组、中药组均制备脊髓型颈椎病模型。中药组给予益气活血通络方灌胃,假手术组、模型组给予生理盐水灌胃,均为12周。各组干预结束后进行大鼠行为学测试,测定机械性刺激阈值和热刺激回缩时间。处死大鼠,HE染色观察各组椎间盘软骨终板结构的差异。TUNEL染色观察大鼠椎间盘纤维环细胞变化。实时荧光定量聚合酶链式反应检测大鼠椎间盘纤维环组织miR-126a-5p和VEGF mRNA。采用Western blot法检测大鼠椎间盘纤维环组织VEGF蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠椎间盘血管芽数目减少,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏明显、大量凋亡且细胞密度降低;模型组和中药组机械性刺激阈值降低,热刺激回缩时间缩短,miR-126a-5p水平降低,VEGF mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,中药组大鼠椎间盘血管芽数目增加,大鼠椎间盘纤维环细胞破坏减轻,大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡减少且细胞密度增加,机械性刺激阈值升高,热刺激回缩时间延长,miR-126a-5p水平增加,VEGF mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论益气活血通络方治疗脊髓型颈椎病的机制可能与上调miR-126a-5p、下调VEGF表达有关。

炙甘草汤通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化改善糖尿病心肌病

目的探究炙甘草汤对糖尿病心肌病(DCM)模型大鼠心肌纤维化的影响以及调控机制。方法雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,10只大鼠作为对照组;20只通过高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建DCM模型大鼠,造模后按随机数字表法分成DCM组、炙甘草汤组。炙甘草汤组予2 mL/100 g炙甘草汤(1 g/mL)灌胃,对照组及DCM组予等量生理盐水灌胃,连续给药4周,每天1次。灌胃给药结束后,HE染色观察DCM模型大鼠心肌组织的病理改变,Masson染色观察DCM模型大鼠的心肌纤维化情况。提取大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组、高糖组、炙甘草汤组、miRNA-NC组、miR-181a-5p模拟物组、miR-181a-5p拮抗剂组、炙甘草汤+miRNA-NC组和炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组并进行相应处理。通过高糖(30 mmol/L)诱导心肌成纤维细胞增殖模型。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)和鞘氨醇激酶2(SPHK2)蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-181a-5p、CollagenⅠ和CollagenⅢ的相对表达水平。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测心肌成纤维细胞的细胞活力。TargetScan数据库预测miR-181a-5p与SPHK2的结合序列。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a-5p与SPHK2的靶向关系。结果与对照组比较,DCM组大鼠血糖水平显著升高[(30.40±3.48)mmol/L比(5.08±0.17)mmol/L,P<0.01],心肌细胞肥大、排列紊乱、成纤维细胞增生伴炎症细胞浸润,炙甘草汤组大鼠上述情况均得到改善。与对照组比较,DCM组大鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.45±0.20)比(1.00±0.12),P<0.01];而炙甘草汤喂养能够逆转上述表达水平变化。与对照组比较,高糖组心肌成纤维细胞的细胞活力[(194.03±25.59)%比(100.00±11.00)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(3.73±0.81)比(1.00±0.17),P<0.01]、CollagenⅢ[(3.93±0.97)比(1.00±0.24),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.41±0.18)比(1.00±0.21),P<0.01];与高糖组比较,炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力[(147.63±25.80)%比(194.03±25.59)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(1.91±0.58)比(3.73±0.81),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.02±0.45)比(3.93±0.97),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平降低,miR-181a-5p水平显著升高[(0.69±0.17)比(0.41±0.18),P<0.01]。与miRNA-NC比较,心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p模拟物后miR-181a-5p表达显著升高[(2.82±0.86)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达下降;而转染miR-181a-5p拮抗剂后miR-181a-5p表达显著下降[(0.29±0.09)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达升高。TargetScan数据库分析发现,miR-181a-5p与SPHK2的3’UTR存在结合序列。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a-5p和SPHK2存在靶向作用。与炙甘草汤+miRNA-NC组比较,炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组心肌成纤维细胞CollagenⅠ[(2.95±0.67)比(1.89±0.26),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.99±0.74)比(1.85±0.63),P<0.01]、细胞活力[(78.57±10.64)%比(59.75±8.08)%,P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著降低[(0.77±0.17)比(2.89±0.57),P<0.01]。结论炙甘草汤可能通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化来实现对DCM的改善作用。

黄芪甲苷经由miR-125a-5p/NLRP1轴减轻椎间盘突出髓核细胞损伤

目的在白介素-1β(IL-1β)诱导退变的人髓核细胞中,探究黄芪甲苷对miR-125a-5p及其靶基因介导的信号通路的作用,揭示黄芪甲苷(astragaloside IV,AS-IV)对髓核细胞增殖、凋亡以及炎症反应的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-125a-5p和核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体蛋白1(nucleotide oligomerization domain(NOD)-like receptor protein 1,NLRP1)在椎间盘突出患者髓核组织中的表达,用IL-1β诱导髓核细胞退变,在20、50和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷干预浓度下检测miR-125a-5p和NLRP1的表达,在IL-1β和80μg·mL^(-1)黄芪甲苷处理的髓核细胞中单独或共同转染miR-125a-5p模拟物和NLRP1过表达质粒,然后分别检测细胞增殖、凋亡和炎症因子分泌情况,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测细胞中信号通路相关蛋白p56和p38的磷酸化水平。结果椎间盘突出(lumbar disc herniation,LDH)患者的髓核组织中miR-125a-5p表达下调,NLRP1表达上调。黄芪甲苷促进IL-1β处理的髓核细胞中miR-125a-5p表达,减少NLRP1表达以及p56和p38蛋白的磷酸化水平。黄芪甲苷促进髓核细胞增殖,减少凋亡和炎症反应。结论黄芪甲苷通过上调miR-125a-5p表达,抑制NLRP1的表达和NF-κB/MAPK信号通路,减少IL-1β诱导的髓核细胞损伤。

Linc01419调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖与侵袭

目的:探讨长链非编码RNA Linc01419对膀胱癌细胞增殖和侵袭的影响及作用机制。方法:通过UALCAN软件(https://ualcan.path.uab.edu/)分析TCGA数据库中Linc01419在膀胱癌组织与正常膀胱组织中的表达差异;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测Linc01419在不同膀胱癌细胞系、22例经病理证实为膀胱癌的手术患者的肿瘤组织及癌旁正常膀胱组织中的表达水平;应用细胞增殖/毒性检测(cell counting kit-8,CCK-8)实验和Transwell小室侵袭实验检测敲低Linc01419表达对膀胱癌细胞增殖与侵袭的影响;采用双荧光素酶报告基因检测法分析Linc01419与miR-34a-5p及miR-34a-5p与E2F3之间的靶向调控关系。结果:UALCAN数据库分析显示相较正常膀胱组织,Linc01419在膀胱癌组织中显著高表达(P<0.001);RT-qPCR分析结果显示相较癌旁正常膀胱组织,Linc01419在22例膀胱癌组织中表达明显上调(P<0.001),与UALCAN数据库分析结果一致;Linc01419在4株膀胱癌细胞中的表达明显高于正常膀胱上皮细胞(P<0.01);敲低Linc01419表达,可显著抑制膀胱癌细胞的增殖、侵袭及N-cadherin、PCNA蛋白的表达,而显著促进E-cadherin的蛋白表达(P<0.05);miR-34a-5p过表达对膀胱癌细胞具有类似的抑制作用;双荧光素酶报告基因实验、RIP及Pull-down实验证实Linc01419可靶向结合miR-34a-5p,而后者进一步介导了对E2F3的靶向调控;抑制miR-34a-5p表达,可显著削弱Linc01419沉默对膀胱癌细胞生物学行为及E-cadherin、N-cadherin、PCNA、E2F3表达的影响。结论:Linc01419在膀胱癌中异常高表达,其通过调控miR-34a-5p/E2F3轴促进膀胱癌细胞增殖和侵袭,很可能是膀胱癌发生、发展过程中的一个重要环节。

miR-25a-5p促进乳腺癌蒽环类药物治疗所致的心肌损伤

目的:探讨蒽环类药物诱导心肌毒性的机制和新的治疗靶点。方法:106例乳腺癌患者根据超声心动图检查鉴别出肿瘤治疗相关心功能障碍,分为心功能障碍组及对照组。通过微阵列技术高通量筛选两组患者差异表达miRNA。体外构建蒽环类药物诱导H9C2心肌细胞损伤模型,通过调控miR-25a-5p的表达,观察miR-25a-5p在蒽环类药物诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用。结果:乳腺癌患者中9例发生肿瘤治疗相关心功能障碍,并从两组患者中鉴定出9个差异表达的miRNA。其中8个miRNA在体外模型中进一步得到验证,尤其是miR-25a-5p。通过上调miR-25a-5p,可进一步加重蒽环类药物诱导心肌细胞氧化损伤。结论:miR-25a-5p促进蒽环类药物诱导的心肌损伤,可能是新的生物标志物及治疗靶点。

NONHSAT248596.1内源性竞争miR-146a-5p调控骨关节炎软骨退变的机制

背景:目前已有针对lncRNA\miRNA\mRNA的共表达网络对骨关节炎发生发展调控机制的研究,课题组前期研究已通过数据库筛选出符合条件的NONHSAT248596.1和miR-146a-5p,尚缺乏体内实验来验证上述调控机制。目的:探究NONHSAT248596.1在基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴介导体内骨关节炎软骨退变进程中对miR-146a-5p发挥的竞争性内源性RNA调控作用。方法:取36只新西兰兔,通过向右侧后肢膝关节注射基质细胞衍生因子1溶液建立骨关节炎模型,采用随机数字表法分4组,lncRNA组、miRNA组、ceRNA组、对照组分别向造模膝关节内注射NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p过表达的慢病毒载体、miR-146a-5p+NONHSAT248596.1过表达的慢病毒载体及空慢病毒载体。造模第4,8,12周,取膝关节软骨组织和软骨下骨组织进行相关检测。结果与结论:①苏木精-伊红与番红O固绿染色显示,4组软骨组织都有不同程度的退变表现,造模第4周时,lncRNA组软骨组织中的软骨细胞肿胀、细胞极性消失,细胞外基质破坏,出现表层糜烂、裂缝形成和软骨组织局部或全层缺失,并随时间延长软骨损伤程度逐渐加重,4组中miRNA组关节软骨炎症进展最缓慢;②qRT-PCR检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量高于其他3组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量低于其他3组(P<0.05);造模后第8,12周,miRNA组软骨组织中的NONHSAT248596.1、4型趋化因子受体、基质金属蛋白酶3,9及13的mRNA表达量低于ceRNA组、对照组(P<0.05),miR-146a-5p、聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原的mRNA表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);③Western Blot检测显示,相同时间点下,lncRNA组软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量始终低于其他3组(P<0.05);miRNA组造模后第8,12周软骨组织中的聚集蛋白聚糖及Ⅱ型胶原蛋白表达量高于ceRNA组、对照组(P<0.05);④结果表明,miR-146a-5p作为NONHSAT248596.1的作用靶点会受到其竞争性内源性RNA的作用造成活性被抑制,NONHSAT248596.1作用于miR-146a-5p后调控基质细胞衍生因子1/4型趋化因子受体轴,影响骨关节炎软骨组织中基质金属蛋白、Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达,造成细胞外基质的降解及蛋白多糖的丢失。

LncRNA MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA/B介导结直肠癌细胞免疫逃逸

目的:探究长链非编码RNA母系表达基因8(LncRNA MEG8)通过靶向miR-15a-5p调控MHCⅠ类相关蛋白A/B(MICA/B)介导的结直肠癌(CRC)细胞免疫逃逸机制。方法:RT-qPCR、Western blot检测CRC组织和细胞系MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平;双荧光素酶实验验证MEG8对miR-15a-5p的调控关系;采用脂质体转染法将NC、MEG8、miR-NC、miR-15a-5p分别或共转染至SW480、SW620细胞,记为NC组、MEG8组、MEG8+miR-NC组、MEG8+miR-15a-5p组;将NK细胞分别与SW480、SW620细胞共培养;ELISA检测共培养液中TNF-α、IFN-γ水平;CCK-8、EdU染色、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR、Western blot检测细胞MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平。结果:与癌旁组织或正常结肠上皮细胞相比,CRC组织和细胞系中MEG8、MICA、MICB、NKG2D mRNA和蛋白水平降低,miR-15a-5p水平升高(P<0.05)。MEG8靶向调控miR-15a-5p。共培养体系中,与NC组相比,MEG8组细胞MICA、MICB、NKG2D蛋白水平、共培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平明显升高,培养1 d、2 d、3 d后,OD值、EdU阳性率、迁移和侵袭细胞数明显降低(P<0.05);过表达miR-15a-5p能部分逆转过表达MEG8对细胞MICA、MICB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ水平和增殖、侵袭转移能力的影响(P<0.05)。结论:MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA、MICB表达,促进NK细胞活性,抑制CRC细胞免疫逃逸。

骨髓间充质干细胞来源的miR-199a-5p通过抑制ZIK1/MAP3K11调节肾细胞癌细胞的增殖和侵袭

目的:研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)来源的外泌体(exsome)中miR-199a-5p对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)细胞增殖和侵袭的影响。方法:分离骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BM-MSCs-Exo),电子显微镜观察外泌体形态,Western blot方法检测外泌体标志蛋白CD9和CD63。CCK-8法检测RCC细胞在不同条件下的增殖速度,Transwell法检测RCC细胞的侵袭能力,q-PCR法检测miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,双荧光素酶实验验证miR-199a-5p以及ZIK1和MAP3K11基因的3’UTR区域靶向结合。结果:BM-MSCs-Exo电镜下呈圆形囊泡状,直径约100 nm,且高表达CD9和CD63,RCC细胞摄取BM-MSCs-Exo后增殖和侵袭能力均被抑制,过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著抑制RCC细胞的增殖和侵袭能力,抑制BM-MSCs-Exo中的miR-199a-5p后能缓解BM-MSCs-Exo对RCC的抑制作用,且发现过表达miR-199a-5p的BM-MSCs-Exo能显著降低ZIK1和MAP3K11的mRNA表达,而在BM-MSCs-Exo中抑制miR-199a-5p有相反作用。结论:BM-MSCs-Exo通过向RCC细胞转运miR-199a-5p抑制ZIK1和MAP3K11的表达,进而抑制RCC细胞的增殖和侵袭。

miR-125a-5p通过靶向STAT3减轻戊四唑诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应

目的:探讨miR-125a-5p通过靶向信号转导与转录激活因子3(STAT3)对戊四唑(PTZ)诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应的影响。方法:采用PTZ点燃法建立大鼠癫痫模型,并将其随机分为6组:Con组、PTZ组、PTZ+agomir NC组、PTZ+miR-125a-5p agomir组、PTZ+miR-125a-5p agomir+pcDNA组和PTZ+miR-125a-5p agomir+pc-STAT3组,评价miR-125a-5p对大鼠癫痫持续时间、潜伏期、惊厥次数和严重程度的影响。qRT-PCR检测miR-125a-5p和STAT3 mRNA表达;改良神经系统严重程度评分(mNSS)、开场实验和Rotarod测试评价癫痫大鼠的神经功能;Morris水迷宫实验评价癫痫大鼠的认知功能;免疫染色观察海马CA1和CA3区域神经元凋亡;ELISA检测海马组织炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18)水平;Western blot检测海马组织中STAT3蛋白表达;双荧光素酶实验验证miR-125a-5p和STAT3的关系。结果:在PTZ诱导的癫痫大鼠中,miR-125a-5p表达上调,STAT3表达下调,且miR-125a-5p靶向抑制STAT3表达。与PTZ组相比,PTZ+miR-125a-5p agomir组癫痫大鼠的潜伏期缩短,癫痫评分降低,癫痫发作时间和次数减少,mNSS降低,掉落潜伏期及外围区域的移动距离、开放区域的总距离延长,逃避潜伏期显著降低,穿越平台次数及停留在目标象限的时间和游泳距离均增加,海马组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18表达降低,CA3和CA1区的NenN+细胞增多(P<0.05);STAT3过表达可逆转miR-125a-5p agomir对癫痫大鼠神经功能障碍及炎症反应的缓解作用(P<0.05)。结论:miR-125a-5p通过靶向下调STAT3,减轻PTZ诱导的癫痫大鼠神经功能障碍和炎症反应。