慢性肾脏病患者治疗前后血清miR-30a-5p和miR-196a水平变化及价值

目的检测并分析慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者治疗前、连续治疗不同随访时间点血清miR-30a-5p和miR-196a-5p水平动态变化,探讨其作为CKD患者辅助诊断及疗效监测分子标志物的价值。方法收集江苏省中医院肾内科2015年4月至2016年2月就诊的20例CKD患者治疗前以及连续治疗并随访3~6个月的血清标本,记录患者血生化及尿液指标,同时收集23例体检健康者血清标本作为对照。采用实时荧光定量PCR检测各组血清miR-30a-5p和miR-196a-5p水平。采用非参数检验、Spearman秩相关分析血清miR-30a-5p和miR-196a-5p的水平变化及临床应用价值。结果与健康人对照相比,CKD患者治疗前血清miR-30a-5p[0.563(0.324,1.737)vs 0.270(0.127,0.435),U=100.5,P=0.004]和miR-196a-5p[0.423(0.154,1.270)vs 0.121(0.056,0.168),U=74,P=0.0003]水平显著升高。与CKD患者治疗前相比,CKD患者血清miR-30a-5p和miR-196a-5p水平从治疗后第3个月开始呈持续降低趋势,至第6个月,其miR-30a-5p[0.344(0.128,0.672)vs 0.563(0.324,1.737),P=0.020],miR-196a-5p[0.227(0.079,0.474)vs 0.423(0.154,1.270),P=0.030]水平与治疗前比较差异有统计学意义。Spearman相关性分析显示,血清miR-30a-5p和miR-196a-5p水平与估算的肾小球滤过率(eGFR)呈显著负相关(r=-0.223,P=0.013;r=-0.191,P=0.035)。结论CKD患者血清miR-30a-5p和miR-196a-5p水平检测有助于反映肾脏功能,具备成为CKD患者辅助诊断及疗效监测分子标志物的潜能。

miR-196a在剑白香猪不同颜色皮肤组织中的表达及靶基因预测

为探究miR-196a在剑白香猪不同颜色皮肤组织中的表达及其靶基因的富集情况,试验采集剑白香猪的白色和黑色皮肤组织,采用qRT-PCR技术检测2种颜色皮肤组织中miR-196a的表达水平,运用MEGA11软件比对分析miR-196a与其他物种间的保守性,通过在线软件PicTar、TargetScan预测其靶基因,利用DAVID数据库对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析。结果:miR-196a在剑白香猪白色皮肤组织中的表达量极显著高于黑色皮肤组织(P<0.01);GO功能分析表明,生物过程、细胞定位、分子功能分别富集于38、13、27个条目;KEGG通路富集分析表明,miR-196a靶基因主要富集于蛋白质消化吸收、癌症miRNAs、黑色素生成等通路,其中黑色素生成通路包括NRAS、ADCY9、CALM3基因。结论:推测miR-196a与剑白香猪皮肤颜色遗传相关。

miR-196a通过PI3K/AKT信号通路促进口腔鳞状细胞癌增殖、侵袭

目的通过实验分析正常人口腔角质形成细胞(HOK)和口腔鳞状细胞癌细胞系(SCC)9细胞中miR-196a表达的差异性,并对miR-196a在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信号通路促进肿瘤发生进行研究。方法通过qRT-聚合酶链反应(PCR)法分析HOK、SCC9细胞中miR-196a的相对表达量;对SCC9转染miR-196a inhibitor,MTT、Transwell侵袭实验分为空白对照(control)组、阴性对照(inbibitor-NC)组、miR-196a inhibitor组,检测转染后细胞增殖、侵袭能力的改变,通过Western印迹研究经转染后PI3K/AKT信号通路相关蛋白的变化;采用生物信息学、Western印迹方法预测分析靶标蛋白叉头盒蛋白(FOXO)1。结果SCC9细胞中miR-196a的表达量显著高于HOK(P<0.05);转染miR-196a inhibitor后,SCC9细胞增殖、侵袭能力均显著下降(P<0.05);Western印迹检测发现,与inhibitor-NC组相比,miR-196a inhibitor组p-AKT、p-PI3K明显下降(P<0.05);在FOXO13′UTR处存在与miR-196a相结合的位点,与inhibitor-NC组相比,miR-196a inhibitor组FOXO1值显著升高,p-FOXO1值显著下降(P<0.05)。结论miR-196a在SCC9细胞中呈现高表达,抑制其表达能显著降低SCC9细胞的增殖、侵袭能力,在OSCC起促癌作用,且miR-196a可能借助PI3K/AKT信号通路发挥作用,并与FOXO1蛋白存在靶向关系。

尼妥珠单抗联合同步放疗在宫颈癌治疗中对miR-196a、miR-130a表达的影响研究

目的探讨尼妥珠单抗联合同步放疗在宫颈癌治疗中的疗效分析及对miR-196a、miR-130a表达的影响。方法选取2015年1月至2016年6月本院收治的106例宫颈癌患者作为研究对象,随机分为对照组与研究组,每组53例。对照组给予常规化疗及三维后装腔内放射治疗,研究组在对照组治疗基础上给予尼妥珠单抗治疗。比较两组肿瘤控制率、不良反应发生情况及治疗前后miR-196a、miR-130a表达水平、免疫功能(CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+))、肿瘤标志物[癌抗原153(CA153)、糖类抗原199(CA199)、癌胚抗原(CEA)]、生存情况[中位总生存期(OS)、中位无进展生存期(PFS)]。结果研究组肿瘤控制率为90.57%,高于对照组的75.47%,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前,两组miR-196a、miR-130a表达水平比较差异无统计学意义;治疗后,两组miR-196a、miR-130a表达水平均低于治疗前,且研究组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,两组CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)均低于治疗前,CD8^(+)高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前后,两组CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)比较差异无统计学意义。治疗前,两组血清CA153、CA199、CEA水平比较差异无统计学意义;治疗后,两组血清CA153、CA199、CEA水平均低于治疗前,且研究组低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。两组血小板减少、血红蛋白减少、消化道损伤、呕吐恶心Ⅰ~Ⅱ、Ⅲ~Ⅳ发生率比较差异无统计学意义。研究组中位PFS、中位OS均长于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论尼妥珠单抗联合同步放疗治疗宫颈癌患者,有利于下调miR-196a、miR-130a表达,提高肿瘤控制率,延长患者生存期,且安全性较高。

HOXA5和miR-196a-5p基因环路在卵巢癌诊断及治疗中的价值

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,其死亡率占妇科肿瘤首位。因此,找到更准确的卵巢癌诊断及治疗方法对提高卵巢癌患者的生存率有重要意义。随着人们对卵巢癌发病机制的深入研究,同源异形盒基因A5和非编码小分子RNA-196a-5p引起了临床工作者的广泛关注,同源异形盒基因A5是同源盒基因家族中的一员,在胚胎发育及细胞分化中发挥重要的作用;非编码小分子RNA-196a-5p在癌症演变中也发挥着重要作用,这为卵巢癌今后的诊断和治疗提供了新思路。因此,本综述主要阐述同源异形盒基因A5和非编码小分子RNA-196a-5p基因环路与卵巢癌发生发展的关系,并为卵巢癌的早期诊治及判断预后提供依据。

miR-196a2成熟区单核苷酸多态性对靶基因LSP1表达的影响

目的:研究miR-196a2成熟区单核苷酸多态性rs11614913(T/C)对预测靶基因LSP1表达的影响。方法:构建含有不同基因型miR-196a2的真核表达载体pCDNA3.1-miR196a2-C和pCDNA3.1-miR196a2-T;同时利用化学合成含有不同基因型的成熟miR-196a2探针miR-196a2-C和miR-196a2-U。将靶基因LSP1的3’UTR序列克隆至pMIR-REPORTTM Luciferase载体中而获得LSP1报告基因载体pMIR-LSP1。采用所构建的miR-196a2真核表达载体以及化学合成的成熟miR-196a2探针分别与靶基因LSP1报告基因载体组建两套转染体系,分别共转染于HEK293、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析。结果:miR-196a2真核表达载体与靶基因LSP1报告基因表达载体共转染于HEK293、A549和CHO三种细胞后进行荧光素酶活性分析,pCDNA3.1-miR196a2-C等位基因荧光素酶相对活性与pCDNA3.1-miR196a2-T等位基因相比均有显著降低(P<0.05);含不同基因型的化学合成的成熟miR-196a2探针与靶基因LSP1报告质粒共转染HEK293、A549和CHO三种细胞,miR-196a2-C等位基因荧光素酶活性与miR196a2-T等位基因相比也有显著降低(P<0.05)。结论:荧光素酶活性强弱间接反映了miR-196a2与靶基因LSP1结合能力的大小,当miR-196a2成熟区rs11614913位点为C时,miR-196a2可能更为有效地与预测靶基因LSP1结合,从而在转录后水平调控靶基因表达。

miR-196a调控p27^kip1促进非小细胞肺癌细胞增殖的机制研究

目的探讨miR-196a在非小细胞肺癌(NSCLC)组织及细胞系中的表达,以及抑制或过表达miR-196a对NSCLC细胞增殖能力的影响及其作用的靶基因。方法实时定量PCR(QPCR)技术检测NSCLC组织及细胞系中miR-196a的表达水平,通过转染miR-196a inhibitors及miR-196a mimics抑制或上调miR-196a的表达水平,并通过QPCR检测转染效率。用MTT和克隆形成实验检测上调或下调miR-196a对SPC-A1或A549细胞增殖能力的影响;生物信息学及Western blotting方法分析验证miR-196a对靶基因p27kip1的调控作用。结果与正常肺组织及细胞相比,在NSCLC组织和细胞中miR-196a的表达出现显著上调,SPC-A1细胞和A549细胞中转染miR-196a inhibitors或miR-196a mimics能显著抑制或上调miR-196a的表达;抑制miR-196a的表达能降低SPC-A1细胞增殖能力,而上调miR-196a的表达则能促进A549细胞增殖。miR-196a能够负性调控p27kip1的表达。结论 NSCLC组织及细胞中miR-196a的表达上调能够抑制p27kip1的表达,并显著促进NSCLC细胞增殖,影响NSCLC的发生与发展。

葛根素通过下调miR-196a-3p促进大鼠成骨细胞增殖和分化的机制

目的研究葛根素是否通过下调miR-196a-3p促进大鼠成骨细胞增殖和分化及其潜在作用机制。方法将大鼠成骨细胞CP-R091分为:对照组、葛根素组、转染组和葛根素+转染组,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,RT-qPCR检测细胞中miR-196a-3p表达,Western印迹检测细胞中Runx2蛋白及细胞分化相关蛋白骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)表达。结果与对照组比较,葛根素处理后CP-R091细胞增殖活性增强(P<0.05),细胞中miR-196a-3p表达水平降低(P<0.05),OPN和ALP蛋白表达水平升高(P<0.05);与anti-miR-NC组比较,抑制miR-196a-3p表达后CP-R091细胞增殖活性增强(P<0.05),细胞中OPN和ALP蛋白表达水平升高(P<0.05);与葛根素+miR-NC组比较,葛根素+miR-196a-3p组CP-R091细胞增殖活性降低(P<0.05),细胞中OPN、ALP蛋白表达降低(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-196a-3p靶向负调控Runx2的表达;与pcDNA3.1组比较,过表达Runx2后CP-R091细胞增殖活性增强(P<0.05),细胞中OPN和ALP蛋白表达升高(P<0.05);与葛根素+si-NC组比较,葛根素+si-Runx2组CP-R091细胞增殖活性降低(P<0.05),细胞中OPN、ALP蛋白表达降低(P<0.05)。结论葛根素下调miR-196a-3p并通过靶向Runx2促进大鼠成骨细胞增殖和分化。

miR-196a高表达在肾脏损伤中作用的分子生物学机制

目的探讨高表达的miR-196a在肾脏损伤中作用的分子生物学机制。方法通过抑制miR-196a表达,观察其表达水平对人肾小管上皮细胞(HKC)转分化的影响,验证miR-196a与其预测靶基因蛋白二硫化物异构酶(PDI)A3的配对关系。建立小鼠单侧输尿管梗阻模型,经尾静脉注射LNA修饰的anti-miR-196a寡核苷酸,观察抑制miR-196a表达后对肾小管间质病变和硫氧还原蛋白(Trx)的影响。结果体外细胞实验显示,转化生长因子(TGF)-β1能够上调miR-196a表达,诱导肾小管上皮细胞发生上皮间充质转分化,阻断miR-196a可部分逆转上皮间充质转分化,而PDIA3为miR-196a对应的直接靶基因。体内动物实验显示,模型组出现明显肾小管间质纤维化病变,5、10 mg/kg anti-miR-196a干预组肾小管间质损伤评分明显低于模型组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05),其中以5 mg/kg干预组逆转肾小管间质纤维化作用更明显。模型组小鼠梗阻侧肾组织miR-196a相对表达量明显高于假手术组,5、10 mg/kg干预组小鼠miR-196a相对表达量明显低于模型组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。5、10 mg/kg干预组α-血管平滑肌肌动蛋白(SMA)、波形蛋白(Vimentin)相对表达量明显低于模型组、阴性对照组;PDIA3蛋白表达明显高于模型组、阴性对照组;差异均有统计学意义(均P<0.05)。以Trx为抗氧化应激标志物,模型组小鼠肾组Trx表达量明显低于假手术组和空白对照组;5、10 mg/kg干预组Trx表达量明显高于模型组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 miR-196a在小鼠肾小管间质纤维化过程中发挥重要作用,PDIA3是其直接靶基因;PDIA3表达下调减弱相应的抗氧化应激能力是miR-196a参与肾脏损伤的机制之一。

miR-196a2单核苷酸多态与乳腺癌易感性关系

miRNA是一类长约21-24bp、内源性、非编码、单链RNAs,进化上高度保守,广泛存在于动、植物细胞中。可以调节基因表达[1]。miRNAs可以与靶mRNAs互补序列配对结合,有效并且稳定地降低mRNAs的翻译活性。哺乳动物成熟miRNAs大多通过不完全互补配对与靶mRNA 3′-UTRs结合,调节靶基因的表达,有时也可以直接将靶mRNAs切断。生物信息学数据表明一条单链miRNA可以[2]

miR-196a2基因多态性在广西人群中的分布

目的探讨广西人群miR-196a2 T>C(rs11614913)等位基因及基因型频率分布情况,分析其与不同民族种族之间的差异性。方法利用单碱基延伸PCR技术(polymerase chain reactionsingle base extension,PCR-SBE)和DNA测序技术,检测303例广西人群中miR-196a2 T>C的基因型,并比较其与人类基因组计划(human genome project,Hapmap)数据库中公布的非洲人、欧洲人、日本人和中国北京人群的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)数据,揭示这5个不同民族种族人群的等位基因及基因型频率分布规律。结果 miR-196a2T>C等位基因和基因型频率在广西男女间分布无差异性(P>0.05)。广西人群miR-196a2 T>C多态性基因型及等位基因频率与非洲人、欧洲人、日本人比较有统计学差异意义(P<0.05),但与北京人群无差异性(P均>0.05)。结论广西人群miR-196a2T>C存在基因多态性,与别的民族种族人群比较有明显的差异性,这种差异性对于基因组水平上疾病的研究可能会起到积极重要作用。

miR-196a在肝癌细胞中的表达及其促增殖作用

目的:探讨miR-196a在肝癌组织的表达水平和对肝癌Hep3B细胞增殖的影响,阐明其促进肝癌细胞增殖的可能机制。方法:收集20例肝癌组织及对应癌旁组织,培养人正常肝细胞株L02及肝癌细胞株SMMC-7721、HepG2和Hep3B,采用qRT-PCR法检测miR-196amRNA在肝癌组织和对应癌旁组织及肝癌细胞株中的表达水平。取处于对数生长期人肝癌Hep3B细胞随机分为对照组、miR-196a mimics转染组和miR-196a inhibitors转染组,MTT法检测各组Hep3B细胞增殖活力,qRT-PCR法检测各组Hep3B细胞miR-196a的表达,流式细胞术检测各组Hep3B细胞周期变化,qRT-PCR和Western blotting法检测各组Hep3B细胞miR-196a潜在靶点叉头转录因子(FOXO1)的表达水平。结果:肝癌组织中miR-196amRNA表达水平明显高于相应癌旁组织(P<0.05);miR-196amRNA在人肝癌SMMC-7721、HepG2和Hep3B细胞中的表达水平明显高于人正常肝L02细胞(P<0.05)。与对照组比较,miR-196amimics转染组Hep3B细胞中miR-196amRNA表达水平明显升高(P<0.05),而miR-196ainhibitors转染组Hep3B细胞中miR-196amRNA的表达水平明显降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-196amimics转染组Hep3B细胞增殖率明显升高(P<0.05),miR-196ainhibitors转染组Hep3B细胞增殖率明显降低(P<0.05),且呈时间依赖性。与对照组比较,转染24h时,miR-196ainhibitors转染组Hep3B细胞G0/G1期细胞百分率明显升高(P<0.05),S期细胞百分率明显降低(P<0.05)。与对照组比较,miR-196amimics转染组FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:miR-196a可能通过FOXO1促进肝癌细胞的增殖,提示miR-196a可能成为肝癌诊断和治疗的新靶点。

miR-196a在肿瘤研究中的进展

最近研究表明,miR-196a在多种肿瘤的发生、发展中发挥类似癌基因的生物学功能,降低miR-196a的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移,促进肿瘤细胞凋亡,逆转肿瘤耐药。miR-196a有望成为肿瘤早期诊断、预后预测及逆转耐药的重要新靶标。本文结合国内外最新报道对miR-196a与肿瘤相关性研究进展作一综述。

晚期胃癌患者miR-196a表达与以氟尿嘧啶为基础的化疗疗效及预后的相关性

目的探讨晚期胃癌患者石蜡组织中miR-196a表达水平与以氟尿嘧啶为基础的化疗疗效及预后的相关性。方法收集我院肿瘤内科治疗的61例一线接受氟尿嘧啶类药物为基础化疗的晚期胃癌患者化疗前的石蜡组织标本，运用高通量芯片筛选5对胃癌和癌旁配对组织中异常表达的miRNA，运用荧光定量PCR方法检测石蜡组织中miR-196a表达水平，分析miR-196a表达水平与化疗疗效及患者预后的相关性。结果与正常胃组织相比，胃癌组织中miR-196a显著过表达（P=0．0006），且miR-196a的表达水平与肿瘤细胞的分化程度和性别相关。以氟尿嘧啶为基础的方案治疗Ⅲ期和Ⅳ期胃癌患者临床获益率（CBR）为42．6％。miR-196a高表达患者CBR低于低表达患者（31．25％VS．46．70％，P=0．029）。应用Cox回归模型进行的Kaplan—Meier生存分析发现，miR-196a高表达（log rank检验，HR=2．18，95％CI=1．061—4．012，P=0．036）与接受以氟尿嘧啶为基础方案的胃癌患者总生存时间缩短相关。结论miR-196a高表达与晚期胃癌不良预后显著相关，是具有潜力的晚期胃癌预后生物学标志物。

miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表达及其诊断价值研究

目的研究miR-196a及miR-1285在上皮性卵巢癌中的表达及其诊断价值。方法选取安康市妇幼保健院于2019年7月至2021年4月收治的95例拟行手术治疗的上皮性卵巢癌患者作为研究组,选取同期本院收治的上皮性卵巢良性肿瘤患者110例作为良性组,选取同期在本院体检的正常健康女性110例作为对照组。采用RT-PCR法测定各组受检者血浆中miR-196a及miR-1285表达水平。分析miR-196a及miR-1285表达水平与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系,采用受检者工作特征曲线(ROC)分析miR-196a及miR-1285表达水平对上皮性卵巢癌的诊断价值,采用多元Logistic回归模型分析miR-196a及miR-1285表达水平与上皮性卵巢癌的关系,采用Pearson相关分析法分析上皮性卵巢癌患者血浆中miR-196a表达水平与miR-1285表达水平的相关性。结果对照组、良性组和研究组受检者血浆miR-196a及miR-1285表达水平组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05);研究组患者血浆miR-196a表达水平明显高于对照组和良性组,血浆miR-1285表达水平明显低于对照组和良性组,差异均有统计学意义(P<0.05);对照组和良性组患者血浆miR-196a和miR-1285表达水平组间比较差异均无统计学意义(P>0.05);上皮性卵巢癌患者的血浆miR-196a及miR-1285表达水平与病理分期均有关(P<0.05),而与患者年龄、病理类型、病理分级、术后是否有肿瘤残余等因素均无关(P>0.05);上皮性卵巢癌患者血浆miR-196a的曲线下面积(AUC)及95%CI分别为0.839(0.785~0.894,P<0.001),miR-1285的AUC及95%CI分别为0.858(0.810~0.905,P<0.001);多元Logistic回归模型分析结果显示,血浆miR-196a表达水平升高是上皮性卵巢癌的独立危险因素(P<0.05),miR-1285表达水平降低是上皮性卵巢癌的独立保护因素(P<0.05);经Pearson相关性分析结果显示,血浆miR-196a与miR-1285呈负相关(r=-0.658,P<0.05)。结论上皮性卵巢癌患者血浆中miR-196a表达水平升高,miR-1285表达水平降低,两者对上皮性卵巢癌均具有一定的诊断价值。

乳腺癌患者miR-196a2基因rs11614913位点的多态性及其与癌基因表达变化的相关性

目的探讨乳腺癌患者miR-196a2基因rs11614913位点的多态性及其与癌基因表达变化的相关性。方法回顾性选择新疆医科大学附属肿瘤医院2017年3月至2019年12月期间进行乳腺癌根治术的64例患者作为乳腺癌组,同期在新疆医科大学附属肿瘤医院体检的80例健康志愿者作为对照组。测定2组受试者外周血中miR-196a2基因rs11614913位点的多态性以及乳腺癌病灶内抑癌基因[程序性细胞死亡因子4(PDCD4)、细胞周期蛋白5(CCN5)、伴有kazal基序富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(RECK)、转录延伸因子A样蛋白7(TCEAL7)]、原癌基因[Livin、生存素(Survivin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基质金属蛋白酶(MMP2)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)]的mRNA表达量。结果乳腺癌组患者miR-196a2基因rs11614913位点C/C基因型的分布频率高于对照组(χ2=11.827,P<0.05),T/T基因型的分布频率低于对照组,差异有统计学意义(χ2=10.474,P<0.05),C/T基因型的分布频率与对照组比较,差异无统计学意义(χ2=0.002,P>0.05);miR-196a2基因rs11614913位点C/C基因型乳腺癌病灶内PDCD4、CCN5、RECK、TCEAL7的mRNA表达量明显低于T/T基因型及T/C基因型的乳腺癌病灶,Livin、Survivin、Cyclin D1、MMP2、Ncadherin的mRNA表达量明显高于T/T基因型及T/C基因型的乳腺癌病灶,差异有统计学意义(P<0.05)。结论乳腺癌患者存在miR-196a2基因rs11614913位点等位基因T向C的突变并且能够影响原癌基因、抑癌基因的表达。

miR-196a通过靶向NR6A1降低宫颈癌Hela细胞生存和运动能力

目的探究微小型RNA-196a(miR-196a)对宫颈癌Hela细胞生存和运动能力的影响和作用机制。方法RT-PCR检测正常宫颈上皮HcerEpic细胞和宫颈癌Hela细胞、CaSki细胞中miR-196a和核受体NR6A1的mRNA水平;阴性对照miR-NC和miR-196a inhibitor转染Hela细胞,分别记为NC组和miR-196a inhibitor组,免疫印迹检测NR6A1蛋白的表达,生物信息学和荧光素酶报告实验分析和验证miR-196a和NR6A1的靶向调控关系;阴性对照质粒pcDNA和过表达质粒pcDNA-NR6A1转染Hela细胞,分别记为pcDNA组和pcDNA-NR6A1组,免疫印迹检测NR6A1蛋白表达;将miR-196a inhibitor和pcDNA-NR6A1单独或联合转染Hela细胞,分别记为miR-196a inhibitor组、pcDNA-NR6A1组和inhibitor+NR6A1组,CCK8检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力,免疫印迹检测Ki-67、Caspase-3、VEGF和MMP-9的表达。结果与HcerEpic细胞比较,Hela细胞和CaSki细胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表达水平均较高(P<0.01),Hela细胞中miR-196a和NR6A1 mRNA表达变化最为显著(P<0.05);miR-196a inhibitor组Hela细胞中NR6A1蛋白表达显著降低(P<0.01),pcDNA-NR6A1组NR6A1的蛋白表达显著升高(P<0.01);miR-196a inhibitor能显著降低Hela细胞增殖倍数和Ki-67表达水平(P<0.05),同时还能提高Hela细胞凋亡率和Caspase-3表达(P<0.01);此外,miR-196a inhibitor还能减少侵袭细胞数,降低Hela细胞划痕闭合率并抑制VEGF和MMP-9的表达(P<0.01);NR6A1能显著减弱miR-196a inhibitor对Hela细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移及对Ki-67、Casapse-3、VEGF和MMP-9表达的调控作用(P<0.01)。结论miR-196a inhibitor能通过靶向抑制NR6A1表达降低宫颈癌Hela细胞的生存和运动能力。

miR-196a/LRIG3在结直肠癌组织中的表达及对HCT116细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨miR-196a/免疫球蛋白样结构域3(LRIG3)在结直肠癌(CRC)组织中表达及对CRC HCT116细胞增殖、侵袭的影响。方法检测CRC患者癌组织和癌旁正常组织中miR-196a和LRIG3 mRNA的表达,比较不同临床特征患者癌组织中miR-196a和LRIG3 mRNA表达差异,并采用Pearson相关分析探讨其相关性。用Lipofectamine法将miR-196a inhibitor和miR-NC转染到HCT116细胞,48 h后分别采用MTT法和Transwell法检测细胞增殖率及细胞侵袭能力,同时应用Western blot法检测HCT116细胞中LRIG3、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达。结果癌组织miR-196a mRNA相对表达量高于癌旁正常组织(P<0.05);癌组织LRIG3 mRNA相对表达量低于癌旁正常组织(P<0.05);癌组织中miR-196a和LRIG3 mRNA水平与TNM分期、肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度和肿瘤转移相关(P<0.05,P<0.01)。Pearson相关分析显示,miR-196a和LRIG3 mRNA在CRC组织中的表达呈负相关(r=-0.442,P=0.013)。与空白对照组比较,miR-196a inhibitor组HCT116细胞增殖率和侵袭细胞数降低,LRIG3和N-cadherin蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05);与miR-196a inhibitor组比较,miR-NC组HCT116细胞增殖率和侵袭细胞数增加,LRIG3和N-cadherin蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05)。结论CRC组织中miR-196a表达升高,LRIG3表达降低,二者在CRC组织中的表达呈负相关,miR-196a可通过靶向作用上调LRIG3表达从而抑制HCT116细胞增殖和侵袭。

斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19~23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。

miR-196a与ZEB2在结直肠癌中的表达及临床意义

目的探究miR-196a和E盒结合锌指蛋白2(ZEB2)在结直肠癌(CRC)中的表达及临床意义。方法收集30例CRC患者的癌组织及对应癌旁正常组织(距离肿瘤边缘>5 cm),分别采用实时定量聚合酶链式反应法和蛋白质印迹法检测组织中miR-196a和ZEB2蛋白的表达水平,分析CRC组织中miR-196a和ZEB2的表达水平与其临床病理特征之间的关系。结果CRC肿瘤组织中miR-196a和ZEB2的表达水平分别为(1.60±0.27)、(1.40±0.26),均显著高于癌旁组组织的(1.09±0.24)、(0.89±0.29)(均P<0.001)。miR-196a与ZEB2的表达呈显著正相关(r=0.789,P<0.001);miR-196a和ZEB2的表达水平与CRC淋巴结转移、远处转移、肿瘤TNM分期显著相关(均P<0.001),与肿瘤分化程度、肿瘤大小、肿瘤所在部位无关(均P>0.05)。结论miR-196a和ZEB2在CRC组织中均呈高表达状态,且两者的表达呈正相关;其表达水平与CRC的临床病理分期紧密相关,提示miR-196a和ZEB2可能共同参与了结直肠癌的发生发展和侵袭转移过程。