斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系的构建

microRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为19~23个核苷酸的非编码RNA,通过影响mRNA的稳定性和翻译,来参与基因表达的转录后调控。生物信息学分析表明该基因在各个物种中高度保守。为了阐明该基因在肠道发育中的作用,本文利用Cloning free CRISPR/Cas9基因编辑技术构建miR-196a-1基因敲除的斑马鱼品系。首先通过分析软件筛选出斑马鱼miR-196a-1基因的两个敲除位点,两个敲除位点相隔132 bp,利用PCR技术扩增miR-196a-1的向导DNA,再以向导DNA为模板转录得到miR-196a-1的sgRNA,将miR-196a-1基因的sgRNA和Cas9蛋白共同注射到斑马鱼胚胎1细胞期胚胎中。斑马鱼胚胎发育到36 hpf后进行基因编辑的有效性检测,研究结果显示,miR-196a-1基因出现102 bp碱基的缺失,表明CRISPR/Cas9系统对miR-196a-1基因的敲除有效。对其F0代、F1代、F2代进行筛选,成功获得斑马鱼miR-196a-1基因敲除品系,为研究miR-196a-1在肠道发育中的作用奠定了基础。

小鼠CCL1基因双荧光素酶报告质粒构建及其与miR-21a-5p靶向关系验证

为了验证miR-21a-5p与CCL1基因的靶向关系,试验利用生物信息学软件预测miR-21a-5p和CCL1基因的结合位点,设计引物合成CCL1基因3′非翻译区(UTR)野生型及突变型目的片段,并将其克隆到psiCHECK2质粒上构建CCL1野生型(CCL1-WT)和突变型(CCL1-MUT)双荧光素酶报告质粒。将构建好的CCL1-WT和CCL1-MUT分别与miR-21a-5p模拟物(miR-21a-5p mimic)和阴性对照(miR-NC)共同转染到293T细胞中,检测CCL1-WT+miR-NC组、CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组、CCL1-MUT+miR-NC组、CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组的荧光素酶活性。结果表明:CCL1基因是miR-21a-5p的潜在靶基因;CCL1野生型和突变型双荧光素酶报告质粒测序结果与预期结果一致;与CCL1-WT+miR-NC组相比,CCL1-WT+miR-21a-5p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而CCL1-MUT+miR-NC组与CCL1-MUT+miR-21a-5p mimic组之间差异不显著(P>0.05)。说明CCL1基因野生型及突变型双荧光素酶报告质粒构建成功,且miR-21a-5p与CCL1基因存在靶向关系。

CCND1基因3'-UTR区miR-15a-5p和miR-16-5p结合位点的荧光素酶报告载体构建及分析

目的:构建miR-15a-5p和miR-16-5p的荧光素酶报告载体,利用此载体分析并验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因3'-UTR区域的确切结合位点,探讨miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的相互作用关系。方法:通过Pubmed和miRBase数据库分别寻找到CCND1基因3'-UTR区域碱基序列和miR-15a-5p、miR-16-5p的碱基序列。找出理论结合位点后,构建荧光素酶报告载体,并用荧光素酶报告基因方法验证miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因之间的作用关系。结果:通过基因测序表明,本实验成功构建了CCND1a/Ma和CCND1b/Mb荧光素酶报告基因表达载体。将上述载体应用于荧光素酶报告基因实验,结果发现CCND1 b组的荧光素酶表达强度显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-15a-5p和miR-16-5p与CCND1基因的3'-UTR区域存在结合位点,其具体结合位置在CCND1b区。这在理论上意味着miR-15a-5p和miR-16-5p可以抑制CCND1基因的表达。

circTLK1通过miR-26a-5p/YES1轴减轻小鼠心肌缺血/再灌注损伤

目的探讨环状RNA凌乱样激酶1(circTLK1)在心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中的作用和潜在机制。方法48只C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham组)、MIRI组、sh-NC组、sh-circTLK1组、sh-circTLK1+antagomir-NC组、sh-circTLK1+antagomir-miR-26a-5p组,每组8只;采用结扎左冠状动脉前降支(LAD)建立MIRI小鼠模型。超声心动图检测小鼠左心室射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)、左心室舒张末期内径(LVEDD)和收缩末期内径(LVESD)以评估心脏功能,ELISA检测血清乳酸脱氢酶(LDH)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CKMB)水平,苏木精-伊红(HE)染色检测心肌组织病理学变化,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测心肌组织中circTLK1、miR-26a-5p、YES1 mRNA和蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验、RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)验证circTLK1/YES1和miR-26a-5p之间的相互作用。结果与Sham组相比,MIRI组小鼠EF、FS、心肌组织miR-26a-5p水平显著降低,LVEDD、LVESD、血清LDH、CK-MB活性和cTnI水平、心肌细胞凋亡率、心肌组织circTLK1、YES1 mRNA和蛋白水平显著升高(均P<0.05),心肌细胞排列紊乱,细胞间质有炎性细胞浸润;circTLK1敲低可显著上调miR-26a-5p,抑制YES1表达,改善上述指标变化(均P<0.05),减轻心肌损伤;抑制miR-26a-5p可通过上调YES1,显著减弱circTLK1敲低对MIRI的保护作用。双荧光素酶报告基因实验和RIP证实了circTLK1和miR-26a-5p之间的直接相互作用,YES1是miR-26a-5p的靶标。结论敲低circTLK1可能通过调节miR-26a-5p/YES1轴在MIRI中发挥保护作用,circTLK1可能是MIRI的潜在治疗靶点。

miR-34a-5p及AKT1基因在子宫内膜异位症子宫内膜组织中的表达及其对子宫内膜基质细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨miR-34a-5p及AKT1基因在子宫内膜异位症(EM)患者子宫内膜组织中的表达及其对子宫内膜基质细胞(ESC)迁移和侵袭的影响。方法收集2018年1月-2019年6月因良性妇科疾病在南方医科大学珠江医院妇产科行子宫切除术的患者91例,分为EM组(n=68)与非EM组(n=23),获取其子宫内膜组织,采用原位杂交及免疫组化法检测miR-34a-5p及AKT1基因在子宫内膜组织中的表达情况;使用脂质体-3000将miR-34a-5p mimic和阴性对照RNA(miR-NC)对ESC细胞进行转染,构建miR-34a-5p mimic组及miR-NC组细胞模型,培养12、24、48 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖率,采用细胞迁移、侵袭、凋亡及自噬能力实验检测miR-34a-5p对ESC增殖、迁移、侵袭、凋亡及自噬的影响。结果EM组子宫内膜组织中的miR-34a-5p阳性表达率低于非EM组(16.2%vs.82.6%,χ~2=34.323,P<0.001),AKT1阳性表达率高于非EM组(72.1%vs.30.4%,χ~2=12.581,P<0.001)。miR-NC组培养12、24、48 h后的细胞增殖率均高于miR-34a-5p mimic组,差异有统计学意义(P<0.05);miR-NC组细胞迁移能力(65.00%±5.00%)高于miR-34a-5p mimic组(30.67%±4.04%),差异有统计学意义(t=9.25,P<0.05);miR-NC组的侵袭能力较miR-34a-5p mimic组明显增强[(88.0±8.5)个vs.(32.3±6.1)个,t=9.179,P<0.05];miR-NC组的细胞凋亡率(9.33%±3.51%)明显低于miR-34a-5p mimic组(18.00%±2.00%);miR-NC组中LC3基因的表达水平明显低于miR-34a-5p mimic组[(0.19±0.04)vs.(0.39±0.03),t=8.02,P<0.05]。结论miR-34a-5p可能通过靶向AKT1基因来影响ESC的增殖、迁移、侵袭、凋亡及自噬功能,从而参与EM的发病。

斑马鱼和鲤miR-1-2/133a-1基因间序列活性和调控研究

分别以斑马鱼(Danio rerio)和鲤(Cyprinus carpio L.)为研究材料,通过克隆斑马鱼和鲤miR-1-2和133a-1的基因间增强子序列,利用活体和离体实验探讨其是否具有肌肉特异性;并通过荧光素酶报告系统等研究转录因子MyoD是否调控该序列。研究结果显示:在活体实验中,无论斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列均有肌肉特异性,且保留有保守区域(cr,含有E-box)的序列,注射72h后GFP表达量明显高于其他突变体。体外细胞实验也显示,转染含有cr序列的实验组,分化后的荧光素酶活性明显高于分化前。进一步探讨MyoD对miR-1-2/133a-1基因间序列的调控作用结果显示:无论是斑马鱼还是鲤, miR-1-2/133a-1基因间序列活性均受MyoD调控。结果为完善鱼类肌肉发育机理,及未来的鱼类分子育种奠定基础。

MiR-30a-3p靶基因的预测与验证

目的:预测和验证miR-30a-3p的靶基因。方法:利用生物信息学方法预测miR-30a-3p的靶基因;扩增靶基因3'UTR区,与pmirGLO质粒连接构建靶基因融合表达载体后与miR-30a-3p mimics共同转染到人正常滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞中,利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-3p与靶基因的靶向关系;在HTR-8/SVneo细胞中转染miR-30a-3p mimics,利用Western Blot实验检测靶蛋白表达水平。结果:生物信息学方法预测结果显示胰岛素样生长因子-1(IGF-1)为miR-30a-3p靶基因之一;双荧光素酶报告基因实验显示,IGF-1基因3'UTR区中含有明确的miR-30a-3p结合位点;Western Blot实验结果显示HTR-8/SVneo细胞转染miR-30a-3p mimics后,IGF-1蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。结论:miR-30a-3p与IGF-1有确切的靶向关系,miR-30a-3p能够负性调控IGF-1蛋白水平的表达。

长链非编码RNA TUG1靶向miR-29a-3p调控高糖诱导的人足细胞损伤

目的探讨长链非编码RNA牛磺酸上调基因(TUG1)对高糖诱导的人足细胞损伤的影响及其机制。方法用终浓度为30 mmol/L的高糖溶液刺激HPCs作为高糖(HG)组,同时以终浓度为5 mmol/L的糖溶液处理HPCs作为对照组(Control);将pCDH-NC、pCDH-TUG1、si-NC、si-TUG1分别转染至正常HPCs中,记为pCDH-NC组、pCDH-TUG1组、si-NC组、si-TUG1组。将pCDH-NC、pCDH-TUG1、anti-NC、anti-miR-29a-3p转染至高糖处理的HPCs中,记为HG+pCDH-NC组、HG+pCDH-TUG1组、HG+anti-NC组和HG+anti-miR-29a-3p组。将pCDH-TUG1与miR-NC、miR-29a-3p分别共同转染至高糖处理的HPCs中,记为HG+pCDH-TUG1+miR-NC组、HG+pCDH-TUG1+miR-29a-3p组。qRT-PCR检测miR-29a-3p和TUG1 mRNA的表达水平;Western印迹检测蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果高糖处理的HPCs中podocin、nephrin、Bcl-2、TUG1表达水平降低;Bax、miR-29a-3p表达水平升高,细胞凋亡率升高。过表达TUG1和抑制miR-29a-3p表达可降低细胞凋亡率,保护高糖诱导的足细胞损伤。TUG1靶向调控miR-29a-3p,过表达miR-29a-3p能逆转TUG1过表达对高糖诱导足细胞损伤的保护作用。结论TUG1对高糖诱导的人足细胞损伤有保护作用,其机制可能与miR-29a-3p表达相关。

miR-411a-3p抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成

microRNA-411a-3p(miR-411a-3p)在不同毛色羊驼皮肤中差异表达,提示其可能在毛色形成中起调控作用。为证明miR-411a-3p在羊驼皮毛黑色素形成中的作用,本研究通过生物信息学预测及靶基因搜索,发现胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)是miR-411a-3p的靶基因,继而构建了含Igf1r mRNA 3'-UTR的荧光素酶报告基因载体。报告基因转染结合报告酶活性测定证明,Igf1r是miR-411a-3p的靶基因。原位杂交显示,miR-411a-3p主要在羊驼黑色素细胞胞质中表达,提示其可能在黑色素细胞中具有重要作用。qRT-PCR揭示,棕色和黑色羊驼皮肤中miR-411a-3p表达量明显低于白色羊驼。qRT-PCR联合蛋白质印迹分析显示,在羊驼黑色素细胞过表达miR-411a-3p,伴随Igf1r下调,小眼畸形相关转录因子(Mitf)依赖的毛色基因酪氨酸酶(Tyr)、酪氨酸酶相关蛋白-2(Tyrp2)及黑色素表达水平明显下调。上述结果提示,miR-411a-3p可通过靶向抑制Igf1r负调控羊驼黑色素黑色素合成。该结果将加深我们对羊驼毛色形成机制的认识。

miR-203a-3p.1调控VCAN作为胃癌潜在治疗靶点的生物信息学研究

目的采用生物信息学技术探讨胃癌发生及进展的机制。方法采用GEO分析数据集GSE54129中胃癌组织标本与正常胃黏膜组织标本的差异表达基因(DEGs),然后用DAVID数据库对DEGs进行富集分析,STRING构建蛋白质相互作用(PPI)网络,Cytoscape软件可视化,MCODE和cytoHubba筛选关键基因,并在GEPIA数据库及胃癌组织标本中验证关键基因,之后用Target Scan7.2数据库预测调控靶基因的miRNAs。结果共筛选出630个DEGs(305个上调基因及325个下调基因),富集分析结果提示DEGs主要参与细胞外基质组织形成、蛋白质细胞外基质、肝素结合、化学致癌信号通路。进一步构建PPI网络,利用Cytoscape7.2数据库进行可视化分析,最终确定3个关键DEGs,包括VCAN、IGFBP7、FSTL1。利用GEPIA数据库验证关键DEGs,结果证实VCAN在胃癌组织中高表达(P<0.05),并与胃癌患者的不良预后有关。Target Scan7.2数据库预测结果提示has-miR-203a-3p.1可与VCAN mRNA的3′UTR结合。结论has-miR-203a-3p.1调控的VCAN是胃癌潜在治疗靶点。

miRNA-196a-2 rs11614913单核苷酸多态性与中国人群中原发性肝细胞肝癌发病风险的Meta分析

目的系统评价miRNA-196a-2 rs11614913单核苷酸多态性(SNP)与中国人群原发性肝细胞肝癌(HCC)发病风险的关系。方法计算机检索中国知网(CNKI)、维普(VIP)、万方、PubMed、EMBASE、Elsevier数据库,检索时间为从建库到2017年12月,收集miRNA-196a-2 rs11614913 SNP与中国人群原发性HCC发病风险的病例对照研究。采用RevMan 5.3和Stata 11.0软件进行Meta分析。结果共纳入9篇文献,包括3634例原发性HCC患者和5003例对照者。Meta分析结果显示,在显性模型、隐性模型、共显性模型TT/CC基因型中,整体效应差异均有统计学意义(显性模型:OR=0.79,95%CI:0.63~0.99;隐性模型:OR=1.26,95%CI:1.01~1.58;共显性模型TT/CC基因型:OR=0.65,95%CI:0.50~0.83,P﹤0.05);而在共显性模型TT/TC基因型中,整体效应差异无统计学意义(OR=0.92,95%CI:0.83~1.02,P=0.13)。性别、吸烟、饮酒、乙型肝炎病毒(HBV)感染对罹患HCC风险的Meta分析结果显示:男性罹患HCC的风险高于女性(OR=1.43,95%CI:1.15~1.78,P﹤0.01),吸烟、饮酒及HBV感染均能增加罹患HCC的风险(吸烟:OR=1.28,95%CI:1.16~1.42;饮酒:OR=1.36,95%CI:1.13~1.65;HBV感染:OR=11.12,95%CI:7.82~15.90,P﹤0.01)。结论miRNA-196a-2 rs11614913基因多态性与中国人群HCC发病风险有关,携带CC基因型能够增加罹患HCC的风险,此外,男性罹患HCC的风险高于女性,吸烟、饮酒、HBV感染也能增加HCC的发病风险。

miR-20a-5p在结核分枝杆菌感染的人巨噬细胞中负向调控Jnk2基因的表达

目的分析结核分枝杆菌(Mtb)感染的人巨噬细胞中miR-20a-5p对Jnk2基因表达的影响,探究miR-20a-5p基因调控细胞内信号通路的潜在机制。方法用miR-20a-5p、miR-20a-5p抑制剂(miR-20a-5p inhibitor,简写为miR-20a-inh)以及阴性对照(negative control,NC)慢病毒(慢病毒携带绿色荧光蛋白GFP标记)分别转染人巨噬细胞THP-1,流式细胞仪分选出GFP阳性THP-1细胞并用H37Ra感染,实时定量PCR技术(qPCR)检测AKT/JNK信号通路基因Akt1、Akt2、Jnk1、Jnk2的表达。蛋白质印迹法检测H37Ra感染的GFP+THP-1细胞中总Jnk2和p-JNK的蛋白表达水平。结果在miR-20a-5p过表达的THP-1细胞中,Jnk2基因表达水平降低,当miR-20a-5p被抑制时,Jnk2基因表达水平升高。蛋白质印迹法检测蛋白质水平上的p-JNK2(p54)表达趋势与qPCR结果相一致,即与miR-20a-5p表达呈负相关。结论在基因和蛋白表达层面证实结核分枝杆菌感染人巨噬细胞后miR-20a-5p负向调控Jnk2表达。

环状RNA FBXO11靶向miR-376a-3p/SNRPB轴调控胃癌SNU-1细胞的增殖与凋亡

目的:探讨环状RNA FBXO11(circFBXO11)调控miR-376a-3p/小核糖核蛋白多肽B基因(SNRPB)轴对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。方法:选取2018年1月至2019年1月华北理工大学附属医院肿瘤外科30例手术切除的胃癌患者的癌和癌旁组织标本,免疫组化染色法检测胃癌组织中SNRPB蛋白阳性表达率,qPCR法检测胃癌组织、胃癌细胞系SNU-1、AGS及HS-746T和胃黏膜细胞GES1中circFBXO11、miR-376a-3p和SNRPB mRNA的表达水平。用双荧光素酶报告基因实验验证circFBXO11与miR-376a-3p、miR-376a-3p与SNRPB之间的靶向关系。将si-NC、si-circFBXO11、miR-NC、miR-376a-3p、si-SNRPB、si-circFBXO11+anti-miR-NC、si-circFBXO11+anti-miR-376a-3p、si-circFBXO11+pcDNA-NC、si-circFBXO11+pcDNA-SNRPB等分别转染进SNU-1细胞,用CCK-8法、流式细胞术以及WB法分别检测细胞的增殖活力、凋亡率以及SNRPB、cyclin D1和C-caspase-3蛋白的表达水平。结果:与癌旁组织比较,胃癌组织中circFBXO11表达水平显著升高、SNRPB蛋白阳性率升高、miR-376a-3p表达显著降低(均P<0.01);与GES1细胞比较,胃癌细胞中circFBXO11和SNRPB表达水平显著升高、miR-376a-3p表达水平显著降低(均P<0.01)。circFBXO11靶向负调控miR-376a-3p表达,miR-376a-3p靶向负调控SNRPB表达。抑制circFBXO11表达或过表达miR-376a-3p或抑制SNRPB表达后,SNU-1细胞的增殖活力降低、凋亡率升高(均P<0.01)。抑制miR-376a-3p表达可部分逆转抑制circFBXO11对SNU-1细胞增殖和凋亡的作用(均P<0.01)。过表达SNRPB可部分逆转抑制circFBXO11对SNU-1细胞增殖和凋亡的影响(均P<0.01)。结论:胃癌组织中circFBXO11呈高表达,抑制circFBXO11表达可抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡,其机制与调控miR-376a-3p/SNRPB通路相关。

微小RNA-193a-3p和生长基因1抑制剂在食管癌中的表达和临床意义

目的检测微小RNA-193a-3p(miR-193a-3p)、生长基因1抑制剂(ING1)在食管癌组织中的表达水平,探讨两者的相关性及其与临床病理参数和预后的关系。方法 2013年1月~2014年6月于我院诊治的食管癌病人食管癌组织以及配对的癌旁组织标本90例,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测食管癌和癌旁组织中miR-193a-3p的表达情况;免疫组化(IHC)检测食管癌和癌旁组织中ING1的表达情况;Target Scan7.1预测分析miR-193a-3p与ING1的靶向关系;采用Spearman秩相关分析检测miR-193a-3p与ING1在食管癌组织中表达的相关性;并分析miR-193a-3p、ING1的表达与食管癌病人临床病理参数及预后的关系。结果 miR-193a-3p在食管癌组织中的表达水平高于癌旁组织(P<0.05),ING1在食管癌组织中的阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05)。Target Scan7.1预测ING1的3’UTR区存在miR-193a-3p的结合位点;食管癌组织中miR-193a-3p与ING1的表达呈负相关(P<0.05)。食管癌组织中miR-193a-3p、ING1的表达与淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲线显示,miR-193a-3p高表达组食管癌病人生存率低于miR-193a-3p低表达组食管癌病人(P<0.05),ING1阴性表达的食管癌病人生存率低于ING1阳性表达组食管癌病人(P<0.05)。结论 miR-193a-3p、ING1在食管癌组织中均呈异常表达,且二者表达与食管癌病人的不良病理参数和预后相关,miR-193a-3p可能通过调控ING1促进食管癌的进展。

miR-15a-5p和MDR1在大肠癌组织中的表达及临床意义

目的:研究miR-15a-5p和多药耐药基因1(MDR1)mRNA在大肠癌组织中的表达及意义.方法:采用实时荧光定量PCR法检测44例大肠癌组织及对应的癌旁正常肠黏膜组织中miR-15a-5p、MDR1 mRNA的表达情况,分析miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达与大肠癌临床病理特征的关系,以及大肠癌组织中miR-15a-5p与MDR1 mRNA表达的相关性.结果:大肠癌组织miR-15a-5p的相对表达量明显低于癌旁正常组织,MDR1 mRNA的相对表达量明显高于癌旁正常组织(P<0.05).大肠癌组织miR-15a-5p、MDR1 mRNA表达均与TNM分期和淋巴结转移有关(P<0.05).Spearman相关分析显示,大肠癌组织miR-15a-5p表达与MDR1 mRNA表达呈负相关关系(r=-0.343,P<0.05).结论:大肠癌组织中miR-15a-5p呈低表达、MDR1呈高表达,二者可能在大肠癌的发生发展过程中发挥重要作用.

小鼠节律基因clock,bmal1 3'UTR重组质粒构建与应用

为探讨miRNA与节律基因的相互作用,首先通过NCBI查找小鼠节律基因clock,bmal1 3'UTR序列,PCR扩增节律基因clock,bmal1 3'UTR全长后将目的片段定向克隆到PGL3-promoter质粒上并测序验证,构建节律基因clock,bmal1 3'UTR重组质粒。然后通过Target Scan软件预测可能与clock,bmal1 3'UTR相互作用的miRNAs,利用脂质体将miRNA模拟物与重组质粒共转293T细胞进行荧光活性检测,初步分析可能调控clock,bmal1表达的miRNAs。结果显示,采用RVP4引物进行的重组质粒反向测序结果与NCBI上查找的序列反向互补,成功构建小鼠节律基因clock,bmal1 3'UTR重组质粒,为进一步研究节律基因转录后调控机制奠定基础。miR-199a-5p(P<0.05)与miR-142-3p(P<0.01)下调重组质粒活性约33%和45%,初步证实miR-199a-5p能够与clock 3'UTR,miR-142-3p能够与bmal1 3'UTR作用调控基因转录活性。

宫颈HPV持续感染临床特征及宫颈脱落细胞中miR-148a-3p、Pax 1、LMX 1A表达的诊断价值

目的探究宫颈人乳头瘤病毒(HPV)持续感染临床特征及脱落细胞中微小RNA-148a-3p(miR-148a-3p)、配对盒基因1(Pax1)、LIM同源盒转录因子1α(LMX 1A)表达的诊断价值.方法选取中卫市中医医院2019年12月-2022年12月收治的289例宫颈HPV阳性患者,随访6个月,根据是否发生HPV持续感染分为HPV持续感染组107例和HPV非持续感染组182例.分析宫颈HPV阳性患者HPV持续感染发生的临床特征,比较两组脱落细胞中miR-148a-3p、Pax1、LMX 1A表达水平,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析其对宫颈HPV持续感染的诊断价值.结果289例宫颈HPV阳性患者HPV持续感染发生107例,HPV持续感染发生率为37.02%.两组生殖道炎症、人流次数比较差异有统计学意义(P<0.05);HPV持续感染组脱落细胞中miR-148a-3p、Pax 1、LMX 1A表达水平低于HPV非持续感染组(P<0.05).脱落细胞中miR-148a-3p、Pax 1、LMX 1A联合检测诊断宫颈HPV阳性患者HPV持续感染的曲线下面积(AUC)高于各指标单一检测(P<0.05),且联合检测敏感度、特异度为88.79%、80.22%.结论宫颈HPV阳性患者HPV持续感染发生率高,其脱落细胞中miR-148a-3p、Pax1、LMX1A水平呈低表达,且三者联合检测可提高宫颈HPV阳性患者HPV持续感染的诊断价值.

COL4A1促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化

目的探讨Ⅳ型胶原蛋白1(COL4A1)对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的作用,及其上游调控机制。方法将COL4A1过表达载体、人着色性干皮病基因(XPD)过表达载体、miR-29a-3p模拟物、miR-29a-3p抑制物、Si-COL4A1、Si-XPD按实验目的转染各组细胞,以空载质粒、NC-模拟物、NC-抑制物、NC-SiRNA作为相应的对照组;qRT-PCR检测COL4A1和XPD mRNA水平;蛋白质印迹法检测COL4A1、XPD和EMT相关蛋白质水平;MTT检测细胞活力;Transwell实验检测各组细胞的迁移、侵袭能力;萤光素酶报告基因实验验证miR-29a-3p和COL4A1的靶向关系。结果肝癌组织中COL4A1 mRNA[(3.25±1.10)vs(0.88±0.45),P<0.01]和蛋白质[(2.58±0.50)vs(1.00±0.14),P<0.01]水平均高于癌旁组织。SMMC-7721、HepG2(P<0.01)和Hep3B(P<0.05)细胞株的COL4A1 mRNA和蛋白质水平均高于L02细胞。与Hep3B+空载质粒相比,过表达COL4A1促进了Hep3B细胞增殖[(0.48±0.06)vs(0.76±0.09),P<0.01]、迁移[(109.00±9.17)个vs(199.33±15.04)个,P<0.01]、侵袭[(84.67±8.02)个vs(133.00±11.53)个,P<0.01]和EMT(P<0.05)。与HepG2+NC-SiRNA相比,沉默COL4A1抑制了HepG2细胞增殖[(0.62±0.09)vs(0.42±0.03),P<0.01]、迁移[(173.00±12.00)个vs(75.00±7.94)个,P<0.01]、侵袭[(105.33±7.51)个vs(47.00±5.57)个,P<0.01]和EMT(P<0.05)。过表达XPD后,HepG2细胞的COL4A1 mRNA[(1.00±0.09)vs(0.55±0.06),P<0.01]和蛋白质[(1.00±0.09)vs(0.33±0.04),P<0.01]水平较HepG2+空载质粒组下降,沉默XPD在Hep3B细胞中出现了相反的结果[与Hep3B+NC-SiRNA相比:mRNA,(1.00±0.08)vs(2.52±0.25);蛋白质,(1.00±0.09)vs(2.56±0.36),P<0.01]。转染miR-29a-3p模拟物后,HepG2细胞中COL4A1 mRNA[(1.00±0.13)vs(0.47±0.07),P<0.01]和蛋白质[(1.00±0.15)vs(0.36±0.09),P<0.01]水平较NC-模拟物+HepG2下降;而miR-29a-3p抑制物在Hep3B细胞中出现了相反的结果[与NC-抑制剂+Hep3B相比:mRNA,(1.00±0.13)vs(3.30±0.41),P<0.01;蛋白质,(1.00±0.14)vs(2.91±0.30),P<0.01]。miR-29a-3p模拟物逆转了沉默XPD介导的Hep3B细胞COL4A1上调(P<0.01)。结论COL4A1促进肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT,并受XPD-miR-29a-3p轴的负性调控。

miR-196a-2基因多态位点rs11614913与乳腺癌易感性关系的Meta分析

[目的]分析mi R-196a-2基因多态位点rs11614913与乳腺癌易感性的关系。[方法]检索外文数据库Pubmed、Science Direct和中文数据库CNKI、万方,收集截止到2016年5月31日发表的关于mi R-196a-2基因多态位点rs11614913与乳腺癌易感关系的病例对照研究,按纳入与排除标准筛选文献,利用Meta分析的方法对各研究数据进行统计学处理及异质性检验,评估发表偏倚并进行敏感性分析。[结果]共纳入15篇研究mi R-196a-2基因多态位点rs11614913与乳腺癌易感关系的文献,包括6362例病例和7392例对照,结果显示：等位基因模型（T vs C）、隐形模型（TT vs CC＋CT）和相加模型（TT vs CC）与降低乳腺癌发病风险相关,差异均有统计学意义（OR=0.89,95%CI：0.81~0.99;OR=0.83,95%CI：0.72~0.96;OR=0.79,95%CI：0.65~0.97）。按种族进行亚组分析后发现,在亚洲人群中,等位基因模型（T vs C）、显性模型（TT＋CT vs CC）、隐形模型（TT vs CC＋CT）和相加模型（TT vs CC）也与降低乳腺癌发病风险相关（OR=0.85,95%CI：0.75~0.95;OR=0.83,95%CI：0.70~0.99;OR=0.78,95%CI：0.67~0.91;OR=0.72,95%CI：0.57~0.91）,其余模型均不能认为与乳腺癌的易感性相关。高加索人群的各遗传模型均与乳腺癌的发病风险无显著相关性。[结论]mi R-196a-2基因多态位点rs11614913的T等位基因和TT基因型可能与降低乳腺癌的发病风险相关。

miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响效应

目的:探究miR-196a-5p对小鼠前体脂肪细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制。方法:(1)构建小鼠肥胖模型,RT-PCR检测脂肪组织中miR-196a-5p表达量;(2)鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,RT-PCR检测分化过程中miR-196a-5p的表达变化;(3)合成miR-196a-5p mimics和inhibitors转染3T3-L1细胞,以CCK8、EdU试剂盒检测miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响作用;(4)运用油红O染色、甘油三酯测定评估miR-196a-5p对3T3-L1细胞分化的影响;(5) RT-PCR检测miR-196a-5p对前脂肪细胞增殖、分化相关基因的影响;(6)结合前人文献,运用生物信息软件、萤光素酶报告系统对miR-196a-5p调控脂肪细胞分化的靶基因进行筛选和验证。结果:(1) miR-196a-5p在肥胖小鼠脂肪组织中高表达,在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中先升高后下降;(2)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了3T3-L1细胞增殖,inhibitors转染促进了3T3-L1细胞增殖;(3)与阴性对照组相比,mimics组积累了大量油红着色的脂滴,甘油三酯含量增多,而inhibitors组的脂滴少而小,甘油三酯含量相对降低;(4)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了增殖标志基因Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4表达,促进了分化标志基因PPARγ、C/EBPα、LPL、aP2等的表达,inhibitors转染则表现出与mimics转染相反的作用;(5) miR-196a-5p可显著抑制野生型MAP4K3和MAPK1 3’UTR萤光素酶活性,而突变绑定位点可废除该抑制效应。结论:miR-196a-5p不仅可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,还可促进其诱导分化、沉积脂滴;miR-196a-5p可能通过靶向调节MAP4K3和MAPK1来介导3T3-L1前脂肪细胞分化。