H12、RS13和RL6在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表达研究

目的探讨组蛋白H1变体(H12)、核糖体蛋白S13(RS13)和核糖体蛋白L6(RL6)在miR-199b-5p敲除小鼠卵巢中的表达变化。方法(1)自行繁育miR-199b-5p敲除(Knockout,KO)和野生型(Wild-type,WT)C57BL/6小鼠,分别记录两组雌鼠产仔情况(2)基因型鉴定验证分组,取性成熟期小鼠(鼠周龄为11~13周)卵巢用于验证实验。(3)用实时荧光定量PCR(qPCR)检测每组小鼠(n=10)卵巢组织中H12、RS13和RL6的mRNA表达水平变化。(4)用蛋白免疫印迹法(WB)检测每组小鼠(n=3)卵巢组织中H12、RS13和RL6的蛋白表达水平变化。结果(1)共统计半年内两组雌鼠产仔情况:WT组生产27窝,平均每窝产仔数为(8.15±0.41)只;KO组生产28窝,平均每窝产仔数为6.43±0.32只,与WT组比较,KO组雌鼠产仔数显著下降(P=0.004),差异有统计学意义。(2)qPCR结果示:与WT组比较,KO组卵巢组织中H12(P=0.038)、RS13(P=0.011)和RL6(P=0.009)的mRNA表达水平显著升高,差异均有统计学意义。(3)WB结果示:与WT组比较,KO组小鼠卵巢组织中H12(P=0.014)蛋白表达水平显著升高,而RS13(P=0.005)和RL6(P=0.009)蛋白表达水平显著下降,差异均有统计学意义。结论敲除miR-199b-5p可能影响H12、RL6和RS13基因的表达使小鼠卵巢储备能力下降。

肿瘤标志物血清miR-429、CEA、AFF3、CA199联合诊断胰腺癌的价值

目的探讨与分析肿瘤标志物血清miR-429、癌胚抗原(CEA)、AFF3、糖类抗原199(CA199)联合诊断胰腺癌的价值。方法选取2018年8月—2022年12月在内蒙古自治区精神卫生中心接受检验的105例胰腺癌患者作为胰腺癌组,同期选取在内蒙古自治区精神卫生中心接受检验的105例胰腺良性结节作为良性组。检测胰腺癌组与良性组的血清miR-429、CEA、AFF3、CA199水平,判断阳性率与诊断价值。结果胰腺癌组的血清CEA、AFF3、CA199含量显著高于良性组(P<0.05),血清miR-429相对表达水平与良性组相比也显著增加(P<0.05)。胰腺癌组的血清miR-429、CEA、AFF3、CA199表达阳性率为74.29%、80.00%、84.76%、90.48%,显著高于良性组的4.76%、5.71%、3.81%、6.67%(P<0.05)。在胰腺癌210例患者中,Pearson相关分析显示血清miR-429、CEA、AFF3、CA199表达水平与组织学分化、临床分期、淋巴结转移等存在相关性(P<0.05)。肿瘤标志物血清miR-429、CEA、AFF3、CA199判断为胰腺癌104例,肿瘤标志物血清miR-429、CEA、AFF3、CA199鉴别诊断胰腺癌的敏感性与特异性分别为98.10%(103/105)、99.05%(104/105),阳性预测值为99.04%(103/104),阴性预测值为98.11%(104/106)。受试者操作特征(ROC)曲线分析显示肿瘤标志物血清miR-429、CEA、AFF3、CA199联合诊断胰腺癌的最大曲线下面积为0.920,Kappa检验分析联合诊断的一致性为0.874。结论胰腺癌多伴随有血清miR-429、CEA、AFF3、CA199的高表达,与患者的病理特征存在相关性,肿瘤标志物血清miR-429、CEA、AFF3、CA199联合诊断胰腺癌具有很高的敏感度与特异度。

miR-199a-5p通过靶向TGF-β2参与调节肝纤维化进程

目的:探讨miR-199a-5p在肝硬化发生中的作用机制。方法:通过设计合成miR-199a-5p mimics和miR-199a-5p inhibitor序列,对miR-199a-5p进行过表达和抑制研究,利用CCK8、5EdU、Western blotting等方法检测过表达miR-199a-5p对Lx-2细胞增殖活性的影响。以Lx-2细胞cDNA为模板,分别利用TGF-β23′UTR的野生型引物序列与miR-199a-5p潜在结合位点突变引物序列进行PCR扩增,获得野生型TGF-β23′UTR序列和突变型TGF-β23′UTR序列,并通过双荧光报告基因实验揭示TGF-β表达的调控过程。结果:体外实验结果显示,Lx-2细胞转染miR-199a-5p mimics后8、12、24 h,细胞活性均较对照组增加(P<0.05~P<0.01),α-SMA蛋白表达水平较对照组提高(P<0.05);Lx-2细胞转染miR-199a-5p inhibitor后8、12、24 h,细胞活性均较对照组降低(P<0.05~P<0.01),α-SMA表达水平亦较对照组下降(P<0.05)。双荧光素酶试验显示,与对照组相比,转染miR-199a-5p mimics后,包含野生型TGF-β23′UTR序列(WT)的荧光素酶质粒表达明显降低(P<0.01),而包含miR-199a-5p结合位点突变序列(MUT)的荧光素酶质粒表达无明显变化(P>0.05)。结论:上调miR-199a-5p表达可促进Lx-2细胞系增殖,同时,miR-199a过表达可促进细胞基质蛋白α-SMA表达,激活Lx-2向纤维化方向发展。miR-199a-5p在肝硬化进程中起促进肝纤维化和肝硬化作用,TGF-β2作为肝纤维化的主要调控因子之一,miR-199a-5p通过调控下游TGF-β2的表达,实现对肝纤维化和肝硬化的促进作用。

乳腺癌组织中miR-199b-5p和MTA1表达水平与临床病理特征和预后的关系

目的 检测乳腺癌组织中miR-199b-5p与MTA1表达情况,并分析其表达水平与临床病理特征和预后关系。方法 选取2017年10月至2018年10月期间河南大学第一附属医院收治的行乳腺切除手术的乳腺癌患者135例作为研究对象,取其癌组织与癌旁组织分别作为癌旁组织组与乳腺癌组,qRT-PCR法测定癌组织与癌旁组织miR-199b-5p、MTA1 mRNA水平,免疫组化法分析组织MTA1阴阳性,分析miR-199b-5p、MTA1表达与乳腺癌患者年龄、绝经情况(是、否)、肿瘤直径(<2 cm、≥2 cm)、临床分期(Ⅰ~Ⅱ期、Ⅲ期)、分子分型(Lumina A/B型、HER-2阳性型、三阴性型)、淋巴结转移(是、否)关系。结果 与癌旁组织组相比,乳腺癌组癌组织miR-199b-5p水平降低,MTA1 mRNA水平升高(P<0.05);与癌旁组织组相比,乳腺癌组MTA1阳性率升高(P<0.05);乳腺癌患者癌组织miR-199b-5p表达与临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05);MTA1表达与临床分期、淋巴结转移、分子分型有关(P<0.05);乳腺癌患者治疗后进行5年随访,miR-199b-5p低表达患者5年内累积生存率(71.8%)低于miR-199b-5p高表达患者(89.1%)(log Rankχ^(2)=6.661,P=0.010);MTA1阳性患者5年内累积生存率(71.6%)低于MTA1阴性患者(90.2%)(log Rankχ^(2)=7.590,P=0.006);单因素COX分析表明,肿瘤直径、临床分期、分子分型、淋巴结转移、miR-199b-5p、MTA1是影响乳腺癌预后不良的危险因素(P<0.05);多因素COX回归分析显示,临床分期、淋巴结转移、miR-199b-5p、MTA1水平是影响乳腺癌预后的危险因素(P<0.05)。结论 乳腺癌患者miR-199b-5p低表达,MTA1 mRNA与阳性率高于癌旁组织,miR-199b-5p低水平、MTA1阳性表达与乳腺癌患者临床病理特征淋巴结转移、肿瘤分期以及患者预后密切相关,两者可能是乳腺癌患者预后不良的预测靶基因。

LINC00662通过调控miR-199a-5p/MAP3K1通路对胃癌侵袭、转移的影响

目的探讨LINC00662通过调控miR-199a-5p/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶1(MAP3K1)通路对胃癌侵袭、转移的影响。方法收集2018年6月至2020年6月期间我院胃癌患者癌组织及癌旁组织,实时定量PCR检测胃癌组织及癌旁组织中LINC00662、miR-199a-5p、MAP3K1 mRNA表达。取对数生长期的SGC-7901细胞,利用LipofectamineTM2000转染试剂盒进行转染,并分为si-NC组、si-LINC00662组、si-LINC00662+anti-miR-NC组、si-LINC00662+anti-miR-199a-5p组、si-LINC00662+miR-NC组、si-LINC00662+miR-199a-5p组、miR-NC组、miR-199a-5p组、空载体组、LINC00662过表达组、anti-miR-NC组、anti-miR-199a-5p组,另取未转染的SGC-7901细胞作为空白组。Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;划痕实验检测各组细胞迁移能力;Western blotting检测各组细胞中MAP3K1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)表达;双荧光素酶报告基因实验验证LINC00662与miR-199a-5p、miR-199a-5p与MAP3K1的靶向关系。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中LINC00662、MAP3K1 mRNA表达水平显著升高,miR-199a-5p表达水平显著降低(均P<0.05)。与空白组和si-NC组比较,si-LINC00662组SGC-7901细胞中LINC00662表达水平显著降低,侵袭、迁移细胞数目显著减少,划痕愈合率显著降低,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著降低,miR-199a-5p表达水平显著升高(均P<0.05)。与si-LINC00662组和si-LINC00662+anti-miR-NC组比较,si-LINC00662+anti-miR-199a-5p组SGC-7901细胞中miR-199a-5p表达水平显著降低,侵袭、迁移细胞数目显著升高,划痕愈合率显著升高,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著升高(均P<0.05)。与si-LINC00662组和si-LINC00662+miR-NC组比较,si-LINC00662+miR-199a-5p组SGC-7901细胞中miR-199a-5p表达水平显著升高,侵袭、迁移细胞数目显著降低,划痕愈合率显著降低,MAP3K1、MMP-2、MMP-9、N-cadherin相对表达量显著降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验证实LINC00662靶向负调控miR-199a-5p表达,miR-199a-5p靶向负调控MAP3K1表达。结论胃癌组织中LINC00662高表达,si-LINC00662通过调控miR-199a-5p/MAP3K1通路抑制胃癌细胞侵袭、转移。

阿替普酶联合抗血小板聚集治疗可影响急性缺血性脑卒中患者miR-150-5p及miR-199a表达水平

目的:观察阿替普酶联合抗血小板聚集治疗对急性缺血性脑卒中(AIS)患者miR-150-5p及miR-199a表达的影响。方法:选取150例AIS患者,随机分为对照组和观察组,每组75例。对照组予阿替普酶溶栓治疗,观察组在对照组的基础上联合抗血小板聚集治疗。比较2组美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)、改良Rankin评分量表(mRS)、Barthel指数、miR-150-5p及miR-199a表达变化情况。比较2组患者早期神经功能恶化的发生率。结果:2组患者治疗14 d后Barthel指数较治疗前升高,NIHSS、mRS评分较治疗前降低(P均<0.05)。与对照组比较,观察组治疗14 d后的临床总有效率、Barthel指数、血清miR-150-5p及miR-199a表达更高,而NIHSS、mRS评分更低(P均<0.05)。2组患者早期(1周内)神经功能恶化总发生率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:阿替普酶联合抗血小板聚集治疗AIS患者,可减轻神经功能损害,提高患者生活自理能力,还可上调miR-150-5p及miR-199a表达。

miR-199a-3p通过靶向CABLES-1调控流体剪切力介导的成骨细胞增殖

目的探讨miR-199a-3p在流体剪切力(fluid shear stress,FSS)诱导成骨细胞增殖中的作用及其可能的分子机制。方法对成骨细胞MC3T3-E1加载1.2 Pa FSS,时间分别为0、15、30、45、60、75、90 min。使用miR-199a-3p模拟物或miR-199a-3p抑制物转染MC3T3-E1细胞。使用将过表达的miR-199a-3p以及其阴性对照分别转染MC3T3-E1细胞,并以1.2 Pa FSS处理45 min。将pcDNA NC、pcDNA-CABLES-1、si RNA NC、si RNA CABLES-1转染至MC3T3-E1细胞中。分别共转染pc DNA-CABLES-1与miR-199a-3p mimic以及si RNA-CABLES-1与miR-199a-3p inhibitor。CCK-8实验检测细胞活性;RT-qPCR检测CABLES-1、miR-199a-3p、CDK 6、Cyclin D1、PCNA表达水平;荧光素酶报告实验检测CABLES-1和miR-199a-3p的靶向关系。免疫荧光检测CABLES-1蛋白表达。Western blot检测CABLES-1、CDK 6、PCNA、Cyclin D1的蛋白表达。结果FSS作用下MC3T3-E1细胞中的miR-199a-3p出现显著下调。过表达的miR-199a-3p抑制成骨细胞增殖,下调miR-199a-3p表达促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p可以逆转FSS诱导的成骨细胞增殖。双荧光素酶实验表明,miR-199a-3p靶向作用于CABLES-1,过表达的miR-199a-3p可抑制CBALES-1蛋白表达。CABLES-1能够促进成骨细胞增殖。miR-199a-3p通过CABLES-1抑制FSS诱导的成骨细胞增殖。结论FSS诱导的成骨细胞增殖通过下调miR-199a-3p并通过靶向作用于CABLES-1实现。研究结果为FSS诱导成骨细胞增殖机制的研究提供新方向,也为未来机械刺激在骨关节疾病治疗中的临床应用研究提供新思路。

痛泻要方通过miR-199/TRPV1信号通路改善腹泻型肠易激综合征大鼠内脏高敏感

目的 探究痛泻药方对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)内脏高敏感大鼠miR-199a/TRPV1通路的改善作用。方法 将40只SD大鼠束缚1 h+1 ml 4%乙酸灌肠建立IBS-D模型,随机分为模型组、中药组、西药组,未造模SD大鼠6只作为空白组,中药组予痛泻药方,西药组予匹维溴铵,其余组予等量蒸馏水灌胃。给药2周后,检测各组大鼠粪便含水量和腹壁回撤反射评分(AWR),处死大鼠后取远端结肠组织,用实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-qPCR)检测远端结肠miR-199a-3p和miR-199-5p表达水平,用蛋白质印迹(Western Blot)、免疫组化(Immunohistochemistry)检测大鼠结肠TRPV1、p-PKC、p-CaMKII表达水平。结果 与正常组比较,模型组大鼠粪便含水量、AWR评分明显升高(P<0.05,P<0.01),miR-199a-3p和miR-199a-5p相对含量升高(P<0.05),TRPV1、p-PKC、p-CaMKII蛋白水平降低(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,中药组miR-199a-3p和miR-199a-5p相对含量降低(P<0.05),TRPV1、p-PKC、p-CaMKII蛋白水平降低(P<0.05,P<0.01)。结论 痛泻药方可能通过抑制miR-199a/TRPV1信号通路改善IBS-D内脏高敏感。

miR-199a-3p靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响

目的探究miR-199a-3p过表达靶向CD151对甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡、侵袭和上皮间质转化的影响。方法通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-3p和CD151的靶向关系。构建CD151pcDNA载体过表达CD151,将miR-199a-3p mimic与pcDNA-CD151单独或联合转染至B-CPAP细胞,将细胞随机分为4组:Control组、miR-199a-3p mimic组、pcDNA-CD151组和miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组。BrdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;流式分选检测细胞周期分布;Transwell检测细胞侵袭能力;Western blot检测MMP-2、Ki-67、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。结果CD151与miR-199a-3p存在靶向作用关系。与Control组比较,miR-199a-3p mimic组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低;pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数升高,细胞凋亡率降低,G2/M、G1期比例升高,S期比例降低,侵袭细胞数升高,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高。与pcDNACD151组比较,miR-199a-3p mimic+pcDNA-CD151组BrdU阳性细胞数降低,细胞凋亡率升高,G2/M、G1期比例降低,S期比例升高,侵袭细胞数降低,MMP-2、Ki-67、Cyclin D1蛋白表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(均P<0.01)。结论miR-199a-3p过表达靶向CD151抑制甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、侵袭和上皮间质转化,并诱导细胞凋亡。

LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控ZNF217对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响

背景与目的针对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的治疗和诊断仍然是医学界的难题,而探究NSCLC发生发展的分子机制是当前研究的热点。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)NORAD在多种癌细胞中高表达,可能是促进NSCLC发生的分子靶点。探讨LncRNA NORAD通过miR-199a-3p调控锌指蛋白217(zinc finger protein 217,ZNF217)对NSCLC细胞增殖、凋亡及化疗敏感性的影响。方法实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测正常肺上皮细胞BEAS-2B、肺癌H460细胞和顺铂(Cisplatin,DDP)耐药细胞株H460/DDP细胞中NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达;将H460/DDP细胞分为control组、si-NC组、si-NORAD组、miR-NC组、miR-199a-3p mimic组、si-NORAD+inhibitor NC组、si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组。检测细胞增殖、细胞凋亡情况,各组细胞NORAD、miR-199a-3p、ZNF217基因表达,Ki-67、caspase-9、ZNF217蛋白表达量;验证miR-199a-3p与NORAD和ZNF217的关系。结果与BEAS-2B细胞相比,H460和H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与H460细胞相比,H460/DDP细胞中NORAD、ZNF217 mRNA表达显著升高(P<0.05),miR-199a-3p表达显著降低(P<0.05)。与control组和si-NC组相比,si-NORAD组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-199a-3p mimic组H460/DDP细胞增殖率、NORAD、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著降低(P<0.05),凋亡率、miR-199a-3p、caspase-9表达显著升高(P<0.05)。与si-NORAD+inhibitor NC组相比,si-NORAD+miR-199a-3p inhibitor组H460/DDP细胞增殖率、ZNF217 mRNA表达、Ki-67、ZNF217蛋白表达显著升高,凋亡率、miR-199a-3p表达、caspase-9表达显著降低(P<0.05)。结论下调NORAD表达可增强miR-199a-3p表达并抑制ZNF217表达,进而抑制H460/DDP细胞增殖,促进其凋亡,增强其DDP化疗敏感性。

血清miR-199、miR-448表达与慢性乙型肝炎组织学特征以及进展为肝硬化的相关性分析

目的:探讨血清miR-199、miR-448表达与慢性乙型肝炎组织学特征以及进展为肝硬化的相关性。方法:选择2009年2月至2021年3月收治的慢性乙型肝炎患者269例,根据METAVIR炎症活动分级将患者分为G_(0~1)组(68例)、G_(2)组(104例)、G_(3~4)组(97例);根据纤维化分期将患者分为S_(0~1)组(71例)、S_(2)组(110例)、S_(3)组(88例)。所有患者均定期随访至2021年10月,统计随访期间乙型肝炎进展为肝硬化的发生情况。检测患者入组时(T_(0))、入组1个月(T_(1))、入组3个月(T_(2))和末次随访时(T_(3))血清miR-199、miR-448表达,比较不同炎症活动分级和纤维化分期的慢性乙型肝炎患者T_(0)血清miR-199、miR-448表达差异。多因素Logistic回归分析慢性乙型肝炎进展为肝硬化的因素。受试者工作特征曲线(ROC)分析miR-199、miR-448诊断慢性乙型肝炎进展为肝硬化的价值。结果:慢性乙型肝炎患者G_(3~4)、S_(3)组T_(0)血清miR-199表达高于G_(2)和G_(0~1)组、S_(2)和S_(0~1)组(P<0.05),miR-448表达低于G_(2)和G_(0~1)组、S_(2)和S_(0~1)组(P<0.05)。中位随访51(7~152)个月,失访14例,121例发生乙型肝炎肝硬化(肝硬化组),134例未发生乙型肝炎肝硬化(肝炎组)。肝炎组、肝硬化组T_(0)、T_(1)、T_(2)、T_(3)血清miR-199表达呈持续增高趋势,miR-448表达呈持续降低趋势(P<0.05),肝硬化组T_(0)、T_(1)、T_(2)、T_(3)血清miR-199表达高于肝炎组(P<0.05),miR-448表达低于肝炎组(P<0.05)。ALT、HBV DNA载量、T_(3)血清miR-199、T_(3)血清miR-448与慢性乙型肝炎进展为肝硬化有关(P<0.05)。T_(3)血清miR-199、miR-448诊断慢性乙型肝炎进展为肝硬化的曲线下面积为0.742、0.765,联合T_(3)血清miR-199、miR-448的曲线下面积为0.924,高于单独T_(3)血清miR-199、miR-448(P<0.05)。结论:miR-199高表达、miR-448低表达与慢性乙型肝炎患者炎症分级、肝硬化分期以及进展为肝硬化有关。

miR-199a-3p通过靶向VEGFA缓解H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤

目的观察miR-199a-3p、血管内皮生长因子(VEGF)A对过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导泪腺上皮细胞氧化应激、凋亡的作用并探究二者之间的关系。方法通过H_(2)O_(2)诱导泪腺上皮细胞损伤模型。将泪腺上皮细胞随机分为对照组(不做任何处理)、H_(2)O_(2)组(200μmol/L)H_(2)O_(2)+anti-miR-con组(转染anti-miR-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p组(转染anti-miR-199a-3p)、H_(2)O_(2)+pcDNA组(转染pcDNA)、H_(2)O_(2)+pcDNA-VEGFA组(转染pcDNA-VEGFA)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-con组(共转染anti-miR-199a-3p和si-con)、H_(2)O_(2)+anti-miR-199a-3p+si-VEGFA组(共转染anti-miR-199a-3p和si-VEGFA),除对照组及H_(2)O_(2)组外,剩余组转染泪腺上皮细胞,再用H_(2)O_(2)处理2 h。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测细胞miR-199a-3p、VEGFA表达;Western印迹法检测细胞VEGFA、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达;免疫荧光法检测细胞活性氧(ROS)含量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞的荧光活性。结果在H_(2)O_(2)的诱导下,泪腺上皮细胞中miR-199a-3p表达显著升高,而VEGFA表达显著下降(均P<0.05)。敲除miR-199a-3p表达可以降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。Starbase预测miR-199a-3p与VEGFA的3′非翻译区(UTR)端存在6个连续的结合位点,且miR-199a-3p明显抑制野生型VEGFA的荧光活性,并负向调控VEGFA蛋白表达(均P<0.05)。过表达VEGFA蛋白可降低H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达,促进GSH、Bcl-2表达,降低细胞的凋亡水平,差异显著(均P<0.05)。同时敲低miR-199a-3p和VEGFA,H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞中ROS、MDA、Bax表达显著增加,GSH、Bcl-2表达显著降低,且凋亡水平显著增加(均P<0.05)结论miR-199a-3p促进H_(2)O_(2)诱导的泪腺上皮细胞氧化应激和凋亡,其机制与靶向调控VEGFA有关。

miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12在老年慢性HBV感染患者不同免疫状态下的评估价值

目的分析老年慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染患者不同免疫状态下血清miR-199a-5p、干扰素(IFN)-γ、白细胞介素(IL)-12表达及其对不同免疫状态下老年慢性HBV感染的评估价值。方法106例老年慢性HBV感染患者依据免疫状态的不同分为再活动期49例,免疫控制期57例。另选取同期接受检查的健康志愿者55例为对照组。以实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)测定所有研究对象血清中miR-199a-5p水平,采用酶联免疫吸附试验测定血清IFN-γ、IL-12水平。以Spearman相关性分析血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平与老年慢性HBV感染患者免疫状态的相关性,以受试者工作特征(ROC)曲线分析患者血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平对老年慢性HBV感染患者不同免疫状态的评估价值。结果研究组血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平显著高于对照组(P<0.05);再活动期患者血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平显著高于免疫控制期患者(P<0.05)。Spearman相关性分析显示,血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平与老年慢性HBV感染患者免疫状态呈正相关(r=0.468、0.496、0.435,均P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平单独及联合评估老年慢性HBV感染患者免疫状态的曲线下面积(AUC)分别为0.669、0.802、0.646、0.841,检测灵敏度分别为50.00%、90.48%、38.10%、69.05%,特异性分别为77.55%、59.18%、91.84%、87.76%,联合评估效能显著优于各指标单独评估。结论老年慢性HBV感染患者不同免疫状态下血清中miR-199a-5p、IFN-γ、IL-12水平表达不同,检测其水平可评估患者免疫状态,且三者联合评估的效能更佳,可为临床治疗提供一定的参考依据。

舒芬太尼通过miR-199a-5p减轻缺氧复氧H9C2细胞凋亡自噬的机制研究

目的:观察舒芬太尼对缺氧复氧(H/R)心肌细胞H9C2凋亡、自噬的影响,并探究其作用机制。方法:建立H/R H9C2细胞损伤模型,用10μmol/L舒芬太尼处理H9C2细胞再行H/R。采用脂质体法将H/R+SUF+antagomiRNA组(转染antagomiRNA,用10μmol/L舒芬太尼处理)、H/R+SUF+antagomiR-199a-5p组(转染antagomiR-199a-5p,用10μmol/L舒芬太尼处理)转染H9C2细胞并行H/R处理。采用细胞计数试剂盒(CCK8)检测培养12、24和48 h的细胞活力。采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染法、蛋白质印迹法检测细胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、波形蛋白(survivin)、线粒体自噬相关蛋白(PINK1)、自噬标记物(LC3-Ⅱ/Ⅰ)和细胞色素C(Cyt C)的蛋白表达。结果:与H9C2组相比,H/R组细胞在48、72 h的活力均显著降低;与H/R+ddH_(2)O组相比,H/R+SUF组细胞在48、72 h的细胞活力显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05),因此选用培养48 h的细胞用于后续研究。与H9C2组相比,H/R组H9C2细胞凋亡率显著升高,Caspase-3、PINK1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和细胞质Cyt C蛋白表达水平显著升高,survivin、线粒体Cyt C蛋白表达水平显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与H/R+ddH_(2)O组相比,H/R+SUF组H9C2细胞凋亡率显著降低,Caspase-3、PINK1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和细胞质Cyt C蛋白表达水平显著降低,survivin、线粒体Cyt C蛋白表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。H/R组miR-199a-5p的表达水平显著高于H9C2组,H/R+SUF组miR-199a-5p的表达水平则显著低于H/R+ddH_(2)O组,差异均有统计学意义(P<0.05);特异性抑制miR-199a-5p的表达明显增强了舒芬太尼对H/R H9C2细胞的凋亡自噬抑制作用。结论:舒芬太尼可抑制H/R心肌细胞的凋亡和自噬,其作用机制与调控miR-199a-5p的表达水平有关。

过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3、Panc-1铁死亡的作用机制

目的 探讨过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和Panc-1铁死亡的作用机制。方法 瞬时转染miR-199-3p/5p模拟物和抑制物至BxPC-3、Panc-1细胞中。qRT-PCR检测细胞中miR-199-3p/5p表达水平;Western blotting检测SCL7A11、BTRC、TFRC蛋白水平。谷胱甘肽(GSH)、Fe^(2+)、脂质过氧化物(LPO)试剂盒检测细胞GSH、Fe^(2+)、LPO水平。免疫共沉淀检测BTRC、TFRC泛素化水平。双荧光素酶报告实验检测miR-199与靶基因的相互作用。结果 转染miR-199-3p/5p模拟物后,胰腺癌BxPC-3、Panc-1细胞株中miR-199-3p/5p、TFRC蛋白水平显著上调;SLC7A11、BTRC蛋白水平显著降低;LPO、Fe^(2+)含量升高,GSH含量降低。过表达BTRC能够显著降低TFRC蛋白水平。miR-199-3p靶向结合SLC7A11,miR-199-5p靶向结合BTRC。结论 过表达miR-199-3p/5p诱导胰腺癌细胞BxPC-3和PANC-1铁死亡,可能与靶向抑制BTRC、SLC7A11促进LPO累积有关。

环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)通过调控miR-181d-5p/miR-199a-5p促进口腔鳞状细胞癌进展

目的:探讨环状RNA FAT1(hsa_circ_0001461)-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞生物学功能中的作用及机制。方法:收集30例OSCC患者的临床组织,采用实时定量PCR检测circFAT1、miR-181d-5p及miR-199a-5p在OSCC组织和细胞中的表达。通过StarBase和双荧光素酶报告基因实验验证miR-181d-5p/miR-199a-5p与circFAT1的靶向关系。利用CCK-8、Transwell、流式细胞术检测circFAT1-miR-181d-5p/miR-199a-5p轴对于OSCC细胞活力、迁移、侵袭、凋亡和周期的影响。采用免疫印迹法结合LY294002处理检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达。结果:在OSCC中circFAT1表达升高,miR-181d-5p、miR-199a-5p表达下降(P<0.001)。circFAT1可以同时靶向miR-181d-5p和miR-199a-5p(P<0.01)。沉默circFAT1、过表达miR-181d及miR-199a-5p抑制了OSCC细胞活力、迁移、侵袭和周期进展、诱导凋亡,同时抑制PI3K/Akt/mTOR通路的激活;过表达circFAT1、抑制miR-181d-5p及miR-199a-5p则发挥相反作用(P<0.05)。miR-181d-5p、miR-199a-5p可部分逆转circFAT1对OSCC细胞生物学功能的影响(P<0.05)。LY294002预处理逆转了过表达circFAT1对PI3K/Akt/mTOR通路和细胞活力的影响(P<0.05)。结论:circFAT1通过调控miR-181d-5p和miR-199a-5p促进OSCC细胞恶性进展。

马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和胶原合成的影响

目的探讨马齿苋提取物调控miR-199a-5p对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(HKF)生长和胶原合成的影响。方法将HKF细胞分为对照组、马齿苋提取物(50、100、200μg/mL)组、miR-NC组、miR-199a-5p组、anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组、anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组。CCK-8法检测HKF细胞活力,流式细胞术检测细胞周期分布,RT-qPCR法检测细胞miR-199a-5p表达,Western blot法检测细胞Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白表达。结果与对照组比较,马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),miR-199a-5p表达、G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-199a-5p组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达降低(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例升高(P<0.05)。与anti-miR-NC+200μg/mL马齿苋提取物组比较,anti-miR-199a-5p+200μg/mL马齿苋提取物组细胞活力、S期细胞比例、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表达升高(P<0.05),G_(0)/G_(1)期细胞比例降低(P<0.05)。结论马齿苋提取物可能通过上调miR-199a-5p表达抑制HKF细胞生长和胶原合成。

罗汉果皂苷提取物通过调控miR-199a-3p对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探究罗汉果皂苷提取物对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响及潜在分子机制。方法体外培养人肾小管上皮细胞HK-2,采用高糖和罗汉果皂苷提取物干预HK-2细胞,细胞计数试剂盒(CCK-8)检测细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡率,Western印迹分析B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测miR-199a-3p的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6和IL-8的表达。结果高糖能够抑制HK-2细胞活力,促进细胞凋亡和Bax的表达,抑制Bcl-2的表达,提高TNF-α、IL-6和IL-8的含量;罗汉果皂苷提取物能够抑制高糖诱导的HK-2细胞凋亡,提高细胞活力,促进miR-199a-3p的表达,降低TNF-α、IL-6和IL-8的含量;过表达miR-199a-3p能够抑制高糖诱导的HK-2细胞损伤,下调miR-199a-3p能够逆转罗汉果皂苷提取物对高糖诱导的HK-2细胞损伤保护作用。结论罗汉果皂苷提取物能够通过上调miR-199a-3p的表达对高糖诱导的HK-2细胞损伤起保护作用。

miR-199-3p通过靶向VegfA抑制大鼠糖尿病视网膜病变

目的探究miR-199-3p在糖尿病视网膜病变(DR)中的作用及其机制。方法单次注射链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型,RT-qPCR检测大鼠视网膜组织miR-199-3p、血管内皮生长因子A(VEGFA)表达;双荧光素实验验证miR-199-3p和VegfA的靶向关系;TUNEL染色检测视网膜细胞凋亡;Western blot检测VEGFA、转化生长因子-β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)蛋白。结果成功建立糖尿病模型大鼠,且模型大鼠视网膜组织miR-199-3p显著下降,VEGFA显著升高(P<0.001);miR-199-3p靶向VegfA。miR-199-3p抑制显著降低视网膜神经节细胞数目,增强视网膜细胞凋亡,而抑制VegfA可显著减轻miR-199-3p抑制对视网膜细胞的损伤(P<0.01)。miR-199-3p过表达后TGF-β1、HGF显著降低,PEDF升高(P<0.001),而过表达miR-199-3p联合VEGFA可显著改变这种作用。结论miR-199-3p通过靶向VegfA抑制糖尿病大鼠视网膜病变。

miR-199a-5p通过靶向JunB介导心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的作用机制

目的:观察miR-199a-5p对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:将120只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、Antagomir对照组、Antagomir组、Agomir对照组及Agomir组。除假手术组(18只)外,其余组大鼠采用持续14 d结扎左冠状动脉前降支诱导构建心肌梗死后心力衰竭大鼠模型,成功诱导94只心力衰竭大鼠,剔除4只,随机分组,每组大鼠18只。分别给予Antagomir对照组、Antagomir组、Agomir对照组及Agomir组大鼠心肌内注射2×1010PFU/mL miR-199a-5p Antagomir对照液、Antagomir液、Agomir对照液及Agomir稀释液各100μL,假手术组与模型组大鼠均等量注射生理盐水。2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测心肌梗死面积;苏木精-伊红(HE)染色法检测心肌组织病理损伤情况;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)染色法检测心脏缺血部位细胞凋亡水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组大鼠心肌组织中miR-199a-5p、转录因子活化蛋白激酶B(JunB)基因相对表达水平;双荧光素酶试验验证miR-199a-5p与JunB的靶向关系;免疫印迹法(Western Blot)检测各组大鼠心肌组织内活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved-Caspase 3)、JunB、淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达情况。结果:与假手术组比较,模型组大鼠心肌梗死面积增加,组织结构不完整,心肌细胞排列错乱不规则,炎性细胞浸润,细胞间有明显凋亡,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平升高,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,Antagomir对照组及Agomir对照组大鼠心肌病理组织学变化、相关基因和蛋白相对表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Antagomir组大鼠心肌组织病理情况显著改善,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平降低,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05);Agomir组大鼠心肌组织病理损伤加重,miR-199a-5p基因及Cleaved-Caspase 3、Bax蛋白表达水平升高,JunB mRNA及JunB、Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。JunB为miR-199a-5p的靶基因。结论:miR-199a-5p可诱导心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡,可能与靶向抑制JunB表达有关。