血清miR-200a-3p与miR-30a-5p表达在心力衰竭诊断及预后评估中的价值

目的分析血清中微小核糖核酸200a-3p(miR-200a-3p)和微小核糖核酸30a-5p(miR-30a-5p)表达在心力衰竭(HF)诊断以及HF患者预后评估中的价值。方法前瞻性选取内蒙古医科大学附属医院2018年4月~2020年4月期间收治的HF患者131例为研究对象(HF组),同时期健康体检志愿者131例为对照组;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平;采用Spearman相关分析血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p水平与HF患者病情严重程度的相关性;采用ROC曲线分析血清miR-200a-3p和miR-30a-5p对HF的诊断价值;采用Logistic回归分析HF患者预后的影响因素;采用Kaplan-Meier生存分析血清miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平与HF患者预后的关系。结果与对照组相比,HF组血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05);轻度HF、中度HF和重度HF患者血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平依次升高,差异具有统计学意义(P<0.05);Spearman相关分析显示,血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平与HF患者病情严重程度呈正相关(r_(s)=0.442,r_(s)=0.564,均P<0.05);ROC曲线分析结果显示,miR-200a-3p和miR-30a-5p联合诊断HF较miR-200a-3p和miR-30a-5p单一指标诊断效果更好(P<0.05);Logistic回归分析结果发现,NT-proBNP、LVEF、LVEDD、miR-200a-3p和miR-30a-5p是HF患者预后的影响因素(Waldχ^(2)=4.321~128.193,P<0.05);Kaplan-Meier生存分析结果显示,血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p高表达患者3年生存率低于miR-200a-3p和miR-30a-5p低表达患者(均P<0.05)。结论HF患者血清中miR-200a-3p和miR-30a-5p表达水平显著升高,二者与HF的发生及患者预后相关。

探寻miR-200a-3p作为结直肠癌的诊断及预后生物标志物的潜在价值

目的:阐明miR-200a-3p及下游靶基因程序性细胞死亡4(programmed cell death 4,PDCD4)在结直肠癌(colorectal cancer,CRC)诊断及预后的潜在价值。方法:从2017年1月至2019年9月在长沙市第一医院接受根治性切除术或姑息性切除术的CRC患者中收集包含120对CRC组织和相应的癌旁正常组织的队列。另1个队列包括50例诊断为CRC的患者;2019年1月至2020年1月从这些患者手术前后收集术前和术后血清样本。RT-qPCR检测CRC组织和细胞系中miR-200a-3p的表达。将靶向miR-200a-3p(si-miR-200a-3p)和siRNAs阴性对照(si-NC),以及miR-200a-3p过表达(miR-200a-3p-OE)和PDCD4过表达(PDCD4)质粒转染CRC细胞。通过CCK-8测定、集落形成和Transwell细胞侵袭测定来确定miR-200a-3p对CRC细胞生长的影响。雌性BALB/c裸鼠随机分为3组:载体组(Vector组)、miR-200a-3p过表达组(miR-200a-3p-OE组)和miR-200a-3p过表达+PDCD4过表达组(miR-200a-3p-OE+PDCD4组)。构建小鼠远处转移模型,监测肺转移的荧光强度,计数肺转移结节的数量。结果:miR-200a-3p在CRC组织和细胞系中上调。miR-200a-3p高表达与肿瘤大小、肿瘤转移和TNM分期显著相关。miR-200a-3p表达可以作为总生存率(overall survival,OS)(HR=2.077,95%CI=1.079~3.998,P=0.029)和无病生存率(disease free survival,DFS)(HR=2.927,95%CI=1.179~7.270,P=0.021)的独立预后生物标志物。功能研究发现miR-200a-3p结合PDCD4的3'-UTR区,并降低PDCD4在CRC细胞中的表达。PDCD4过表达抑制miR-200a-3p过表达对CRC细胞增殖、集落形成、迁移和侵袭的促进作用。与体外结果一致,在转移的小鼠尾静脉注射模型中,miR-200a-3p-OE+PDCD4组SW480细胞的肺定植、肺转移灶较miR-200a-3p-OE组明显减少(P<0.05)。结论:miR-200a-3p在CRC细胞、组织和血清中表达显著增加,并可以作为诊断和预后的生物标志物。miR-200a-3p过表达通过抑制PDCD4表达促进CRC进展。

转化生长因子β调控miR-200b-200a-429启动子活性

目的探讨转化生长因子β(TGF-β)对miR-200b-200a-429簇表达的影响,对其调控机制作初步研究。方法使用RT-PCR方法检测TGF-β对人肾小管上皮细胞HK-2miR-200a、miR-200b和miR-429表达的影响。PCR方法扩增出miR-200b-200a-429簇启动子序列,构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶报告基因表达载体,转染至HK-2细胞,检测其荧光素酶活性。观察TGF-β对miR-200b-200a-429转录的表达调控。结果实时定量PCR检测结果显示TGF-β作用细胞24h后下调了miR-200a、miR-200b和miR-429的表达。成功构建miR-200b-200a-429启动子荧光素酶表达载体,测序正确,然后利用双荧光素酶报告基因系统证实构建的报告基因载体启动子具有活性,发现TGF-β可以抑制miR-200b-200a-429启动子活性(P<0.05)。结论 TGF-β可以调控miR-200b-200a-429启动子的活性。

变应性鼻炎患者血清miR-95、血清miR-200a-3p表达水平及临床意义

目的 研究血清miR-95、血清miR-200a-3p在变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)患者中的表达及其与病情严重程度相关性分析。方法 选取2019年3月至2021年5月温州市中西医结合医院收治的AR患者90例作为研究组,另收集90例同期在温州市中西医结合医院体检的健康受试者作为对照组。采用鼻部症状总评分(total nasal symptom score,TNSS)和单个鼻部症状评分(individual nasal symptom score,INSS)对AR的严重程度进行评估。对比两组肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、IL-17、miR-95、miR-200a-3p水平。结果 研究组血清miR-95水平高于对照组,血清miR-200a-3p水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。受试者操作特征曲线分析结果显示,血清miR-95的曲线下面积(area under curve,AUC)为0.857,95%置信区间(confidence interval,CI):0.821~0.911,血清miR-200a-3p的AUC为0.861,95%CI:0.809~0.908。血清miR-95的截断值为1.25,对AR患病风险预测的特异性为69.3%,敏感度为75.4%。血清miR-200a-3p的截断值为1.02,对AR患病风险预测的特异性为71.2%,敏感度为77.9%。两组血清miR-95均与miR-200a-3p呈负相关(P<0.05)。AR患者血清中miR-95m水平与患者鼻塞、鼻痒、TNSS评分均呈正相关(P<0.05);AR患者血清中miR-200a-3p水平与患者鼻塞、鼻痒、TNSS评分均呈负相关(P<0.05);血清miR-95、miR-200a-3p水平与AR患者的喷嚏和流涕评分不具有明显的相关性(P>0.05)。研究组患者血清miR-95水平与TNF-α、IL-4、IL-6、IL-13、IL-17水平呈正相关(P<0.05),与IL-10水平呈负相关(P<0.05)。研究组患者血清miR-200a-3p水平与TNF-α、IL-6、IL-8、IL-13、IL-17水平呈负相关(P<0.05),与IL-10呈正相关(P<0.05)。结论 变应性鼻炎患者血清中miR-95呈现高表达,miR-200a-3p呈现低表达,miR-95水平与患者病情严重程度呈正相关,miR-200a-3p水平与患者病情严重程度呈负相关。

胃癌组织中miR-200a、miR-200b和miR-429的表达及临床意义

0 引言 胃癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，2006年中国肿瘤发病和死亡资料分析显示，无论城市还是农村，胃癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤第二位，已成为我国今后恶性肿瘤防控的重点[1]。目前，胃癌的病因尚不明确，加之滞后的临床表现和诊断，以手术为主、放化疗为辅的综合治疗手段亦未能显著提高患者的5年生存率[2]。所以，探寻胃癌新特异性的分子标志物，为其早期诊断开辟新途径具有重要意义。

miR-200c和miR-429靶向调节绵羊皮下脂肪细胞中SCD1表达的研究

旨在预测并验证调节绵羊皮下脂肪细胞中SCD1基因表达的关键miRNAs。本研究利用4个生物信息学软件TargetScan、mirDB、StarBase和miRanda预测与该基因具有靶标关系的关键miRNAs;利用双荧光素酶报告系统验证SCD1基因与miRNAs的靶标关系;利用荧光定量PCR和Western-blotting技术,分别在mRNA和蛋白水平上检测miRNAs对SCD1 mRNA和蛋白质表达的影响。预测结果表明,miR-200c和miR-429是调控SCD1基因表达的关键miRNAs;双荧光素酶报告系统检测证明,2个miRNAs与SCD1基因都具有靶标关系;荧光定量PCR显示,miR-200c和miR-429显著抑制SCD1 mRNA的表达(P<0.05),且miR-200c作用更大;Western-blotting显示,miR-200c和miR-429极显著抑制SCD1蛋白质的表达(P<0.01);显微镜观察发现,miR-200c和miR-429抑制绵羊皮下脂肪细胞脂滴生成。由此证明,miR-200c和miR-429均靶向抑制SCD1基因的表达,进而抑制绵羊脂肪生成。

miR-200a-3p对胰腺癌细胞PDL1表达及其增殖、迁移的影响

目的:探讨miR-200a-3p对胰腺癌细胞中PDL1表达的调节作用及其对胰腺癌细胞系增殖、迁移的影响。方法:于StarBase数据库中查询数据并将PDL1与miR-200a-3p表达情况进行相关性分析。用miR-NC mimics和miR-200a-3p mimics分别转染Panc1和SW1990细胞系,采用RT-qPCR及Western blot检测PDL1表达情况,CCK8检测细胞增殖情况,另外采取划痕实验检测细胞迁移变化。结果:于StarBase数据库中可发现miR-200a-3p表达与PDL1表达负相关,另外,miR-200a-3p mimics组中,PDL1 mRNA及其蛋白的表达均显著低于NC mimics组及空白组。此外,与NC mimics组比较,CCK8细胞活力测定显示miR-200a-3p mimics组中细胞增殖显著减少,而观察细胞划痕及其愈合则表明细胞迁移能力明显降低。结论:miR-200a-3p可能通过降低胰腺癌PDL1表达抑制其细胞的增殖、迁移。

lncRNA FLJ26245通过miR-200a-3p/PTPRG轴调控前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移

目的:探讨lncRNA FLJ26245在前列腺癌组织和细胞中的表达及其对PC-3细胞增殖与迁移能力的影响及其分子机制。方法:选用2017年3月至2019年5月在洛阳中心医院手术切除的52例前列腺癌及相应的癌旁组织标本,以及前列腺细胞系LNCaP、C4-2B、PC-3、DU-145和正常前列腺上皮细胞RWPE-1,用qPCR法检测前列腺癌组织和细胞中FLJ26245的表达水平。分别将FLJ26245 mimic和阴性对照质粒(lncR-NC)转染到PC-3细胞中,用MTT法、细胞划痕愈合实验分别检测细胞的增殖和迁移能力。生物信息学技术预测和双荧光素酶基因报告实验验证FLJ26245与miR-200a-3p、酪氨酸磷酸酶受体G(PTPRG)三者之间的靶向关系。用qPCR和WB法分别检测FLJ26245下游基因及增殖与迁移相关蛋白的表达。结果:FLJ26245在前列腺癌组织和细胞中的表达水平分别显著低于癌旁组织(P<0.01)和RWPE-1细胞(P<0.01或P<0.05),以PC-3细胞中的表达水平为最低(P<0.01)。FLJ26245过表达可明显抑制PC-3细胞的增殖和迁移能力(P<0.05或P<0.01)。FLJ26245可与miR-200a-3p靶向结合,miR-200a-3p可与PTPRG靶向结合(均P<0.01)。FLJ26245过表达的PC-3细胞中miR-200a-3p表达水平显著降低(P<0.01)、PTPRG mRNA和蛋白表达水平均明显升高(均P<0.01),细胞中增殖和迁移相关蛋白cyclin A、CDK2和Twist、N-cadherin均显著降低(均P<0.01)。结论:FLJ26245在前列腺癌组织及细胞中均低表达,其可能通过miR-200a-3p/PTPRG轴调控前列腺癌PC-3细胞的增殖与迁移能力。

胃腺癌患者血浆中miR-199a-5p和miR-200c-3p的表达及其诊断和预后判断的价值

目的探讨胃腺癌病人血浆中miR-199a-5p、miR-200c-3p的表达及其诊断和预后判断的价值。方法选取2014年5月至2015年4月胃腺癌病人50例为观察组,同期入选体检健康者50例为研究对照,应用实时荧光定量PCR技术检测两组研究对照血浆中的miR-199a-5p和miR-200c-3p的表达水平情况;比较不同分化程度、淋巴结转移情况的胃腺癌病人的血浆中miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平。结果观察组的miR-199a-5p表达水平显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);观察组的miR-200c-3p表达水平显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同分化程度、淋巴结转移情况的胃腺癌病人的血浆miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论胃腺癌病人血浆miR-199a-5p、miR-200c-3p表达水平与肿瘤分化程度、淋巴结转移情况密切相关,可用于评估胃腺癌的病情严重程度及预后。

LncRNA DLX6-AS1和miR-200a-3p在肝细胞肝癌中的表达及预后研究

探讨长链非编码RNA(Long Non-coding RNA,lncRNA),生长停滞蛋特异性蛋白6-反义RNA1(DLX6-AS1)和微小RNA-200a-3p(miR-200a-3p)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织及血清中的表达及其诊断和预后价值。方法 通过TCGA、miRDB、miRTarBase等数据库,筛选及预测DLX6-AS1和miR-200a-3p功能和潜在关系。选取2018年6月至2019年12月本院收治HCC患者42例为实验组,另外选择选42例体检健康者为对照组。检测实验受试者标本中DLX6-AS1和miR-200a-3p表达水平,并对HCC患者进行3年内随访;分析DLX6-AS1和miR-200a-3p与HCC患者预后及病理参数的关系以及和甲胎蛋白(AFP)对HCC的诊断效能。结果:DLX6-AS1和miR-200a-3p可能参与了溴结构域蛋白4(bromodomain protein 4,BRD4) 基因的ceRNA调控网络。基于对照组,HCC患者肝组织与血清中DLX6-AS1高表达(P<0.05),miR-200a-3p异常低表达(P<0.05),HCC患者DLX6-AS1和miR-200a-3p表达与组织分级、淋巴结侵犯及TNM分期相关。生存分析提示,DLX6-AS1高表达HCC患者3年生存率(28.5%)少于低表达组(55.4%),miR-200a-3p低表达组HCC患者3年生存率(30.4%)低于高表达组(45.5%)。结论 DLX6-AS1和miR-200a-3p可能参与HCC患者的预后,可能成为HCC早期诊断的血清学标志物。

鼻咽癌患者miR-429、miR-200C表达与预后关系分析

目的探讨鼻咽癌患者miR-429、miR-200C表达与预后关系。方法选择2016年1月至2017年5月接受治疗的初治鼻咽癌患者80例,对病理穿刺组织样本行qRT-PCR检测对miR-429、miR-200C相抵表达量进行分析,治疗3个月后进行疗效评价。出院后以电话及门诊复诊的方式进行随访,记录患者生存时间。结果不同病理分期、T分期、N分期及临床分期患者miR-429及miR-200C相对表达量差异均具有统计学意义,且均随严重程度的增加表达量下降(P<0.05)。治疗3个月后80例患者总体有效率为100%,其中CR 71例(88.75%),PR 9例(11.25%)。死亡及复发或转移的55例为预后不良组,无瘤生存的18例为预后良好组,预后良好组患者miR-429及miR-200C相对表达量均高于预后不良组(P<0.05)。miR-429相对表达量对鼻咽癌预后不良预测cut-off值为1.36,AUC为0.723,95%CI为0.547~0.898,灵敏度为82.15%,特异度为81.72%;miR-200C相对表达量对鼻咽癌预后不良预测cut-off值为0.53,AUC为0.713,95%CI为0.562~0.865,灵敏度为82.01%,特异度为79.61%。miR-429高表达组(miR-429相对表达量≥1.36)平均生存时间为(39.07±1.59)个月,95%CI:35.95~42.19;miR-429低表达组(miR-429相对表达量<1.36)平均生存时间为(23.57±1.02)个月,95%CI:21.57~25.58(P<0.05)。miR-200C高表达组(miR-200C相对表达量≥0.53)平均生存时间为(38.28±1.71)个月,95%CI:34.94~41.63;miR-200C低表达组(miR-200C相对表达量<0.53)平均生存时间为(23.52±1.07)个月,95%CI:21.42~25.62(P<0.05)。结论不同病理分期、T分期、N分期及临床分期鼻咽癌患者miR-429、miR-200C相对表达量有差异,且随着病情严重程度的升高miR-429、miR-200C表达量下降,miR-429相对表达量<1.36、miR-200C相对表达量<0.53时鼻咽癌患者生存时间下降。

过表达miR-200a-3p对老年糖尿病合并冠心病大鼠心肌纤维化、心脏功能和免疫炎症反应的影响

目的 探讨过表达miR-200a-3p对老年DM合并冠心病(CAD)大鼠心肌纤维化、心脏功能和免疫炎症反应的影响。方法 48只老年SD大鼠随机分为正常对照组(Con,n=8),余40只采用高糖高脂饲料联合腹腔注射STZ制备DM模型,腹腔注射10 U/kg垂体后叶素制备DM合并CAD模型。造模成功30只随机分为模型组(Mod)、阴性对照组(Neg-Con)和miR-200a-3p激动剂组(miR-200a-3p),每组各10只。RT-PCR检测miR-200a-3p,血糖仪检测FBG,HE染色检测心肌组织病理损伤程度,Masson染色检测心肌组织胶原纤维化程度,Western blot法检测TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达水平,超声心动图检测左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期内径(LVESd),ELISA法检测IL-12、γ-干扰素(IFN-γ)、IL-4、IL-13。结果 与Con组比较,Mod组miR-200a-3p、LVEF、LVFS降低(P<0.05),FBG、TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达、LVEDd、LVESd、IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-13升高(P<0.05)。与Mod组比较,miR-200a-3p组miR-200a-3p、LVEF、LVFS、IL-4、IL-13升高(P<0.05),FBG、TGF-β1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达、LVEDd、LVESd、IL-12、IFN-γ降低(P<0.05),心肌组织损伤情况改善,心肌组织胶原纤维化程度降低。结论 过表达miR-200a-3p可改善老年DM合并CAD大鼠心肌纤维化、心脏功能和免疫炎症反应。

miR-200a-3p通过靶向MMP-1抑制膀胱癌T24细胞侵袭及转移

探讨miR-200a-3p靶向调控MMP-1对膀胱癌T24细胞迁移和侵袭能力的影响。运用Target Scan Human 7.2生物信息学软件预测miR-200a-3p的下游靶基因,采用双荧光素酶报告实验验证MMP-1为miR-200a-3p的下游靶基因。在T24细胞中转染miR-200a-3p mimics或miR-200a-3p inhibitor后,采用实时荧光定量PCR技术检测MMP-1 mRNA的表达量、Western blotting检测MMP-1蛋白的表达量。通过Transwell小室法检测T24细胞的迁移和侵袭能力。miR-200a-3p靶向调控MMP-1的3’-UTR,降低了荧光素酶的表达活性。与对照组比,miR-200a-3p mimics组MMP-1 mRNA和蛋白表达水平明显降低,且miR-miR-200a-3p mimics组细胞的迁移、侵袭能力也均降低。与对照组比,miR-200a-3p inhibitor组MMP-1 mRNA和蛋白表达水平明显升高,且miR-200a-3p inhibitor组细胞的迁移、侵袭能力也均升高。miR-200a-3p通过靶向调控MMP-1抑制膀胱癌T24细胞侵袭及转移。

基于TGF-β2/Smad2信号通路探讨长链非编码RNA NEAT1对膀胱癌T24细胞生物学行为的影响

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)NEAT1调控TGF-β2/Smad2信号通路对膀胱癌(BC)T24细胞上皮间质转化(EMT)和生物学行为的影响及潜在分子机制。方法:收集2015年3月~2018年5月于我院接受手术治疗的128例BC患者癌组织及距离癌组织超过2cm处的正常组织,qRT-PCR检测lncRNA NEAT1在BC及相应的正常组织、不同BC细胞系中的表达情况;以T24为空白对照,构建lncRNA NEAT1沉默细胞系T24-siNEAT1及阴性对照T24-NC,分别采用MTT、平板克隆实验及Transwell实验检测lncRNA NEAT1对T24细胞增殖和侵袭能力;免疫荧光实验检测E-cadherin、Vimentin表达;生物信息学网站starBase预测可与lncRNA NEAT1互补结合的miRNA,根据Targetscan网站预测相应miRNA可靶向结合的基因;Western blot检测TGF-β2/Smad2信号通路蛋白和E-cadherin、Vimentin表达情况。结果:qRT-PCR结果显示,BC组织和癌细胞中lncRNA NEAT1表达水平明显高于正常组织和正常细胞(P<0.05);与空白对照组和T24-NC组相比,T24-siNEAT1组细胞OD 492值明显下降,细胞克隆数、通过matrigel基质胶的数量明显减少,E-cadherin表达明显升高、Vimentin明显降低(P<0.05);starBase网站预测结果显示,lncRNA NEAT1可与miR-200a-3p互补结合,Targetscan网站预测分析显示,miR-200a-3p与TGF-β2存在靶向结合位点;qRT-PCR和Western blot结果显示T24-siNEAT1组中miR-200a-3p、TGF-β2及p-Smad2表达明显低于空白对照组与T24-NC阴性对照组(P<0.05);空白对照组和T24-NC组中上述指标的表达量无统计学意义(P>0.05)。结论:lncRNA NEAT1在BC组织及细胞中高表达,高表达lncRNA NEAT1可能通过上调miR-200a-3p水平强化TGF-β2/Smad2信号通路,促进EMT过程,影响BC进展。

敲低EZH2表达抑制人舌鳞状细胞癌侵袭迁移能力的研究

目的:探究Zeste同源增强子(enhancer of zeste homolog2,EZH2)能否调控miR-200b/a/429的表达,进而影响人舌鳞状细胞癌的侵袭和转移。方法:利用小干扰RNA(siRNAs)敲低舌鳞状细胞癌SCC15和UM-1细胞系中EZH2的表达。Western blot法检测EZH2和上皮-间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平。q-PCR检测敲低EZH2后miR-200b/a/429的表达水平。Transwell实验和划痕实验检测舌鳞癌细胞的侵袭和迁移能力。最后通过免疫荧光实验观测细胞骨架的改变。免疫组织化学法和q-PCR检测人舌鳞状细胞癌标本中EZH2的表达。结果:siRNAs能够显著地敲低EZH2表达,进而使miR-200b/a/429表达水平升高;E-cadherin表达水平升高,而N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平下降;si-EZH2组肿瘤细胞的侵袭和迁移能力明显降低。淋巴结转移阳性的人舌鳞状细胞癌标本中EZH2表达水平高于淋巴结转移阴性(P<0.01)。结论:EZH2通过抑制miR-200b/a/429的表达水平,进而促进了人舌鳞状细胞癌的侵袭和迁移。