小鼠microRNA-21慢病毒抑制载体的构建及鉴定

目的构建microRNA-21(miR-21)慢病毒抑制载体,为研究miR-21在小鼠体内的功能及作用机制打下基础。方法利用miR-21前体并将其克隆入LV3pGLV-H1-GFP质粒中,经酶切及测序鉴定,利用脂质体将鉴定的阳性重组LV3pGLV-H1-GFP-miR-21抑制载体、PG-P1-VSVG和pCMV-dR3个质粒转染到HEK-293T细胞,将所得病毒感染293T细胞,检测病毒滴度,并将制备的病毒颗粒感染乳鼠心肌细胞和尾静脉注射小鼠,检测miR-21在小鼠体内的表达。结果酶切及测序结果证明成功构建了LV3pGLV-H1-GFP-miR-21重组质粒,并成功包装成慢病毒,病毒滴度为2.4×109TU/ml,重组病毒成功感染心肌细胞,同时在Balb/c小鼠心脏有表达。结论成功构建miR-21慢病毒抑制载体,获得高效表达miR-21的慢病毒颗粒,为miR-21的进一步研究奠定了基础。

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的构建携带人miR-221基因的miRNA干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法。方法合成含干扰序列的双链DNA oligo直接连入酶切后的RNA干扰载体上。将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR鉴定,阳性克隆即为目的基因RNA干扰慢病毒载体质粒。再将目的基因与目的载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T细胞,用western bolt法检测其有效敲减靶序列。结果重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscS1576的靶点干扰效果最好。结论本实验成功构建了人miR-221基因的RNA干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列。

大鼠miR-21慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的采用分子生物学方法构建miR-21慢病毒载体,并感染骨髓间充质干细胞（MSCs）,建立稳定表达miR-21的MSCs细胞系。方法合成大鼠miR-21基因序列,进行PCR扩增后,连接到慢病毒表达质粒p LVX-shRNA2中。对其进行双酶切及基因测序鉴定,证实载体p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p的成功构建。对载体进行包装、测定病毒滴度。分4组：MSCs组不转染病毒液,空载组转染空载病毒液,miR-21组1用miR-21慢病毒载体以MOI 20转染MSCs,miR-21组2用miR-21慢病毒载体以MOI 40转染MSCs。将慢病毒颗粒以不同感染复数（MOI）感染MSCs,检测感染效率,使用实时定量PCR法检测MSCs中miR-21的表达。结果目的基因与慢病毒载体成功连接。病毒滴度约为6×10～8CFU/m L。载体成功感染MSCs,转染效率达90%以上。实时定量PCR检测结果证实miR-21组1（MOI为20）、miR-21组2（MOI为40）miR-21表达量分别为4.05±0.07、4.06±0.04,与MSCs组（1.07±0.05）及空载组（1.12±0.05）相比差异有统计学意义（F=3 014.962,P=0.000）。结论采用分子生物学方法成功构建了大鼠miR-21慢病毒载体系统p LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p,并成功转染MSCs,得到稳定表达miR-21的MSCs细胞系,从而为进一步研究miR-21的生物学特性提供实验基础。

miR-21慢病毒载体构建及对骨髓间充质干细胞凋亡的影响

背景:骨髓间充质干细胞移植后凋亡成为治疗化疗性卵巢早衰效果欠佳的主要原因。miR-21参与细胞增殖与凋亡的调控,有重要的抗凋亡作用。目的:构建miR-21慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞,观察其对化疗药物磷酰胺氮芥诱导的骨髓间充质干细胞凋亡的影响。方法:构建携带miR-21基因慢病毒表达载体LVX-shRNA2-rno-miR-21-5p,双酶切及基因测序鉴定证实载体构建成功。对载体进行包装、测定病毒滴度。将慢病毒颗粒以不同感染复数(20和40)感染骨髓间充质干细胞,检测感染效率,使用real-time PCR法检测骨髓间充质干细胞中miR-21的表达。流式细胞仪、Hoechst33342染色检测骨髓间充质干细胞在磷酰胺氮芥模拟的化疗微环境中的凋亡率。结果与结论:(1)成功构建miR-21慢病毒载体,病毒滴度约为6×10^(11) CFU/L;(2)载体转染骨髓间充质干细胞效率达90%以上;(3)miR-21组1(感染复数为20)、miR-21组2(感染复数为40)miR-21表达量明显高于骨髓间充质干细胞组及空载组(P=0.000);(4)转染组骨髓间充质干细胞的凋亡率、凋亡指数均低于空载组及骨髓间充质干细胞组(P=0.001);(5)实验成功构建大鼠miR-21慢病毒载体系统,miR-21上调能抑制骨髓间充质干细胞凋亡,促进细胞增殖。

反义microRNA-21慢病毒表达载体的构建及对喉癌细胞的增殖抑制作用

目的:克隆反义微小RNA hsa-miR-21并构建其慢病毒表达载体,观察反义寡核苷酸重组慢病毒(ASO-miR-21)对喉癌细胞增殖的调控作用。方法:针对hsa-miR-21核苷酸序列,设计并合成mir-21反义寡核苷酸,将pGCSIL-GFP Vector经双酶切后连接产生pGCSIL-GFP-miR-21慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGC-LV-miR-21、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染细胞293T,包装慢病毒。以293T细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达水平测定病毒滴度。采用MTT法及克隆形成实验检测反义miR-21(ASO-miR-21)重组慢病毒对喉癌细胞增殖能力的影响。结果:成功构建反义hsa-miR-21的慢病毒表达载体,采用ASO-miR-21抑制喉癌细胞内高水平表达miR-21的活性后,可显著抑制喉癌细胞增殖。结论:成功构建反义miR-21的慢病毒表达载体,ASO-miR-21可以明显抑制喉癌细胞增殖。

miR-21慢病毒表达载体的构建及稳定转染U266细胞系

目的:构建miR-21慢病毒表达载体,感染多发性骨髓瘤(MM)细胞U266,建立稳定表达miR-21的U266细胞系。方法:以has-miR-21前体序列pre-miR-21为模板,设计并合成引物,进行PCR扩增目的基因,并连接到慢病毒表达质粒LV-anti中。对重组质粒进行双酶切鉴定后,所构建载体命名为LV-anti-miR-21-MOI。再进行miR-21基因慢病毒LV-anti-miR-21的包装及病毒滴度测定,将慢病毒颗粒以最适滴度感染MM细胞株U266,通过Aldefluor流式分选出带有目的基因和空载病毒的细胞,用real-time PCR检测感染效率。结果:目的基因与慢病毒载体连接成功。慢病毒LV-anti-miR-21浓缩后的病毒滴度约为1.0×108TU/ml。慢病毒成功感染目标细胞U266,转染效率达90%以上。real-time PCR检测,U266/LV-anti-miR-21慢病毒MOI 20组和MOI 40组miR-21表达量分别为0.69±0.03和0.51±0.05较U266/un组(1.08±0.05)下降了38.9%和54.9%,差异有显著统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建了miR-21慢病毒表达载体,并建立U266-miR-21稳定转染细胞系。为进一步研究miR-21的功能及作用机制奠定了基础。

hsa-miR-150-5p抑制序列慢病毒载体的构建、转染和表达

目的构建携带抑制表达hsa-miR-150-5p的慢病毒载体,建立稳定表达该载体的HT-29细胞。方法设计并合成hsa-miR-150-5p抑制序列,并克隆到工具载体GV-280(h U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin)构建重组载体,将重组载体与p Helper1.0载体和p Helper2.0载体共转染293T细胞,得到所需的病毒液LV-hsa-miR-150-5p-down,最后感染HT-29细胞,并通过嘌呤霉素筛选出稳定感染的细胞株。荧光显微镜观察HT-29细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR检测hsa-miR-150-5p在HT-29细胞中的表达水平。结果测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组(转染过表达LV-hsa-miR-150-5p-down病毒)病毒滴度为5×10~8TU/ml,阴性对照组(转染阴性LV-NC病毒)病毒滴度为8×10~8TU/ml。所得病毒液感染HT-29细胞并筛选出稳定细胞株HT29-150-5p-down。荧光显微镜观察带有绿色荧光蛋白的目的重组质粒在人结肠癌HT-29细胞中高表达,PCR进一步验证了这一结果。结论 LV-hsa-miR-150-5p-down慢病毒载体构建成功,HT-29细胞稳定表达该载体,为后续miR-150的功能研究奠定基础。

乙肝病毒通过调控miR-21-5p/STAT3通路促进骨髓来源抑制细胞的增殖与活性

目的:探究乙肝病毒(HBV)对骨髓来源抑制细胞(MDSCs)的作用及其机制。方法:C57BL/6小鼠分为正常组和乙肝组,乙肝组建立慢性HBV感染模型,检测小鼠miR-21-5p水平;另将C57BL/6小鼠分为对照组、miR-21-5p阴性对照组、miR-21-5p过表达组和miR-21-5p沉默组,除对照组外其余小鼠注射miR-21-5p干预,除miR-21-5p阴性对照组外,所有小鼠建立慢性HBV感染小鼠模型,检测小鼠miR-21-5p水平及MDSCs数量;将miR-21-5p分别转染小鼠MDSCs,暴露于HBV病毒中,检测p-STAT3(Ser727)、Arginase-1、IL-10及p-STAT3蛋白水平;在培养基中加入Stattic(STAT3抑制剂),检测p-STAT3、Arginase-1以及IL-10蛋白水平。结果:乙肝组miR-21-5p表达水平高于正常组;miR-21-5p阴性对照组相较于对照组miR-21-5p表达水平及MDSCs数量升高,miR-21-5p过表达组相较于miR-21-5p沉默组miR-21-5p表达水平及MDSCs数量升高;小鼠MDSCs感染HBV后p-STAT3(Ser727)、Arginase-1、IL-10及p-STAT3蛋白表达升高,miR-21-5p过表达后p-STAT3(Ser727)、Arginase-1、IL-10及p-STAT3蛋白表达升高;加入Stattic后,p-STAT3、Arginase-1以及IL-10蛋白表达无差异。结论:HBV可能通过调控miR-21-5p/STAT3通路,从而促进MDSCs的增殖与活性。

小鼠miR-214重组慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建携带miR-214的重组慢病毒表达载体，为研究miR-214的功能和作用机制奠定基础。方法从小鼠基因组DNA扩增miR-214基因，测序鉴定后克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒载体上，测序鉴定、病毒包装后转染HEK293细胞，测定病毒滴度。将重组慢病毒载体感染HEK293细胞，应用萤光定量PCR法检测miR-214表达。结果重组慢病毒载体pCDH-CMV-miR-214-EF1-copGFP测序完全正确，pCDH-CMV-miR-214-EF1-copGFP感染的HEK293细胞中miR-214表达显著增强。结论成功构建小鼠miR-214重组慢病毒载体，并可在HEK293细胞中稳定表达出miR-214，为进一步进行miR-214的功能和机制研究奠定了试验基础。

MiR-218慢病毒表达载体的构建及鉴定

构建人m ir-218-2,pre-m iRNA慢病毒表达载体,为研究m iR-218在人体的功能及作用机制打下基础。以人hsa-m ir-218-2前体序列,设计部分互补的正反向引物,进行引物退火,形成引物二聚体。PCR扩增引物二聚体,酶切后插入到线性化pGCSIL-GFP慢病毒表达载体中,对重组质粒进行双酶切鉴定,并进行慢病毒的包装与滴度检测。用构建好的慢病毒表达载体感染人胃癌细胞MKN-28,qPCR检测细胞内m iR-218表达。结果显示,重组质粒经双酶切分析及转化菌液测序,插入序列正确,慢病毒表达载体感染人胃癌细胞后qPCR检测显示能显著增高m iR-218的表达。说明本实验成功构建了hsa-m ir-218-2慢病毒表达载体,感染人胃癌细胞后能有效提高m iR-218的表达。为进一步研究m iR-218在人体的功能及作用机制建立了实验基础。

miR-196b慢病毒表达载体的构建和功能鉴定

目的构建携带miR-196b的慢病毒表达载体,为研究miR-196b在慢性粒细胞白血病中的功能及其对慢粒发生发展的作用奠定基础。方法以人骨髓细胞基因组DNA为模板,PCR法扩增miR-196b的前体序列,慢病毒表达载体plVTHM构建重组载体plVTHM-miR-196b,并包装病毒和进行滴度测定。用病毒液感染K562细胞,通过荧光观察转染效率和报告基因表达效率,用流式细胞仪分选感染后绿色荧光蛋白阳性的K562细胞,再用实时荧光定量PCR测定细胞内miR-196b的表达水平。最后用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况。结果成功构建了plVTHM-miR-196b慢病毒表达载体;载体中绿色荧光蛋白有较好的表达活性;与对照组细胞相比,试验组miR-196b表达水平有显著提升(P<0.05);K562细胞稳定过表达miR-196b后增殖水平显著下降(P<0.05)。结论成功构建了miR-196b过表达载体,并在K562细胞内稳定高表达,miR-196b有抑制K562细胞增殖的作用。

人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析

目的构建由人端粒酶反转录酶(h TERT)启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。方法将h TERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-h TERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的c DNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析。结果经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升(P<0.05);与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调。结论 h TERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果。

miR-424慢病毒表达载体的构建及其对宫颈癌细胞增殖的影响

目的构建hsa-miR-424基因慢病毒表达载体,并鉴定miR-424在细胞内表达水平,研究hsa-miR-424对宫颈癌Hela细胞增殖的影响。方法以人基因组DNA为模板,设计合成miR-424的上下游引物,PCR扩增目的片段,回收产物将其连入pMD18T载体中,进行测序。再以pMD18T-miR424为模板进行PCR扩增,将其中表达pMD18T-miR424的结构经酶切后插入pLentis-CMV-GFP-MCS-PGK-PURO载体,构建成pLentis-CMV-GFP-miR424-PGK-PURO,在293T细胞中与pSPAX2、pMD2.G包装产生所需的慢病毒,再用含慢病毒的上清液感染Hela细胞。结果 miR-424基因与慢病毒载体连接成功,测序结果证明了插入到质粒载体中的miR-424前体序列完全正确,成功构建pLentis-CMV-GFP-miR424重组慢病毒载体,用其感染宫颈癌Hela细胞后上调miR-424的表达近60倍。采用MTT法检测增殖结果提示:感染miR-424慢病毒的宫颈癌Hela细胞株均存在细胞增殖减慢。结论成功的构建了miR-424慢病毒载体,建立了高效稳定表达miR-424的细胞株,并用含慢病毒的上清液感染宫颈癌Hela细胞,成功抑制了Hela细胞的增殖,为后续相关的研究奠定了良好的基础。

miR-455慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建人源microRNA-455(miR-455)慢病毒载体,并鉴定成熟has-miR-455在细胞内的表达水平。方法:提取SiHa细胞中的人基因组DNA,设计并合成人miR-455的上下游引物,PCR扩增目的基因,将其中表达miR-455的结构经酶切后插入慢病毒转移质粒pWPT-GFP,构建成pWPT-GFP-pri-miR-455,在293T细胞中与pMD2G、pSPAX2包装产生慢病毒,并用含慢病毒的上清感染SiHa细胞。结果:测序结果证明插入质粒载体中的miR-455前体序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒;重组慢病毒质粒pWPT-GFP-pri-miR-455感染SiHa细胞后上调miR-455的表达近40倍。结论:构建了miR-455的慢病毒载体,并能在293T细胞中表达,产生的慢病毒能成功感染SiHa细胞。为进一步研究miR-455的功能,以及利用慢病毒进行基因治疗奠定了基础。

hsa-miR-381过表达慢病毒载体的构建、转染和表达

目的构建hsa-miR-381过表达慢病毒载体病毒载体,并对其在食管鳞癌TE10细胞中miR-381表达调节效果进行鉴定。方法利用PCR法扩增miR-381基因序列,将目的基因miR-381克隆到携带Green&Puro的慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定后大量抽提;利用脂质体将含目的基因的重组质粒和包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞;用得到的慢病毒转染TE10细胞,通过荧光显微镜观察转染状况,实时荧光定量PCR分析转染前后miR-381的表达。结果酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为2×108TU/ml,空白阴性对照组病毒滴度为2×108TU/ml。TE10细胞转染过表达慢病毒后miR-381的表达升高,TE10-381组has-miR-381的表达丰度是TE10组的456.05倍。结论 LV3-hsa-miR-381慢病毒载体构建成功,并能明显增加TE10细胞中miR-381的表达量。

神经元抑制性沉默元件双链RNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建神经元抑制性沉默元件(RE-1/NRSE)双链RNA的慢病毒载体。方法根据RE-1/NRSE序列合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pGC-LV载体连接产生L-smRE-1/NRSE慢病毒载体,采用PCR和测序对阳性克隆进行鉴定。用L-smRE-1/NRSE和包装质粒pHelper 1.0、pHelper2.0共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293T细胞中绿色荧光蛋白的表达量,并计算病毒滴度,初步观察其对大鼠间充质干细胞的转染效率。结果PCR和测序证实,构建出了RE-1/NRSE双链RNA的慢病毒载体L-smNRSE/RE-1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为4×108TU/ml。慢病毒颗粒能稳定转染大鼠间充质干细胞,当感染复数为80时,感染效率达100%。结论成功构建了RE-1/NRSE dsRNA的慢病毒表达载体。

大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统。方法采用EcoRⅠ酶双酶切将目的基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定。成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度。重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),观察转染效率及miR-1表达水平。结果测序结果显示目的基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数(MOI)50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达。结论成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体。

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示:miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。

细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景:以往关于细胞因子信号转导抑制因子1的研究多用脂质体或其他载体转染的技术,但存在效率低和安全性差等问题。目的:构建细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体并进行鉴定。方法:实验设计3组针对细胞因子信号转导抑制因子1的短发夹RNA序列,应用基因重组技术插入pPll3.7载体,测序正确的重组病毒质粒与包装质粒通过共转染293T细胞,培养48h后,收集细胞培养上清液,感染A549细胞,westernblot检测目的蛋白细胞因子信号转导抑制因子1在靶细胞中的表达。结果与结论:实验通过对重组载体进行测序分析证实短发夹RNA插入慢病毒载体,慢病毒载体上清成功转染A549细胞后western blot检测结果显示该载体抑制了细胞因子信号转导抑制因子1蛋白在A549细胞有表达。说明实验成功构建了细胞因子信号转导抑制因子1RNA干扰慢病毒载体。

人核糖核酸酶抑制因子siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

本实验旨在构建人核糖核酸酶抑制因子稳定干涉载体pLKO.1-ds RI,为后续观测人核糖核酸酶抑制因子干涉载体的表达对肿瘤细胞的影响奠定基础。用亚克隆法,将针对人核糖核酸酶抑制因子的干涉片段从Simple T-ds RI质粒克隆到pLK-0.1-TRC质粒,用酶切法筛选得到阳性重组质粒pLKO.1-ds RI,用测序法鉴定克隆序列正确。转染时设干扰组、空载体组和空白组三组,每组三次重复。用脂质体Cellfectin^R将pLKO.1-ds RI(干扰组)、pLKO.1-TRC(空载体组)转染进人肝癌细胞HepG2细胞中,未处理的细胞作空白组。转染后72hr用Western blotting检测细胞中核糖核酸酶抑制因子表达的变化。双酶切鉴定及测序鉴定结果均正确;Western blotting结果表明,对比空白组(1.1578±0.015)和空载体组(1.1216±0.027),干扰组RI表达(0.6119±0.048)明显下调(P<0.05)。结果表明人核糖核酸酶抑制因子干涉载体pLKO.1-ds RNH1构建成功。