柚皮苷中药单体调节miR-216a基因对结直肠癌细胞增殖和凋亡的影响研究

目的探讨柚皮苷中药单体靶向调节miR-216a基因对结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法qRT-PCR检测三株结直肠癌细胞(SW620、LOVO和HCT116)miR-216a和KIAA1199基因mRNA表达,Western blotting检测KIAA1199蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验检测KIAA1199-WT/MUT与miR-216a mimics共转染后的荧光素酶活性,qRT-PCR及Western blotting检测miR-216a mimics/inhibitor转染SW620细胞后KIAA1199基因mRNA及蛋白表达。MTT、流式细胞术分别检测miR-216a、靶向KIAA1199及柚皮苷(0.4 mmol/L、0.8 mmol/L和1.6 mmol/L)对SW620细胞活力、凋亡的影响。qRT-PCR检测柚皮苷对miR-216a基因和KIAA1199基因表达的影响,Western blotting检测柚皮苷对KIAA1199蛋白表达的影响。结果三株结直肠癌细胞miR-216a基因表达明显降低,KIAA1199基因mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.05)。选择SW620细胞作为研究对象。过表达miR-216a可明显抑制SW620细胞活力,促进细胞凋亡(P<0.05),同时过表达miR-216a和KIAA1199可减弱过表达miR-216a对SW620细胞活力和凋亡的影响。不同浓度柚皮苷均可抑制SW620细胞活力,促进细胞凋亡,上调miR-216a基因表达,下调KIAA1199基因表达,呈剂量依赖性(P<0.05)。结论柚皮苷中药单体可引起miR-216a表达水平改变进而调控KIAA1199表达,从而影响结直肠癌细胞增殖和凋亡。

miR-370-3p在绵羊中的表达、生物信息学分析与靶基因预测

本研究以新吉细毛羊和小尾寒羊为实验动物,用实时荧光定量PCR检测miR-370-3p在绵羊不同组织中的表达变化;利用Mega11.0对miR-370-3p进行序列分析,并构建进化树;利用miRBase对脊椎动物的miR-370-3p序列进行检索,使用Ensembl数据库对miR-370-3p进行定位;利用在线网站预测miR-370-3p的靶基因,并进行GO、KEGG分析。组织表达结果显示,miR-370-3p在2种绵羊1月份和10月份的皮肤组织中均存在显著差异;在2种绵羊同组织间均存在显著差异。miR-370-3p序列主要存在于哺乳动物,且在不同物种间高度保守;miR-370-3p共有315个靶基因;GO分析结果显示靶基因主要富集在蛋白质的自磷酸化、细胞核与细胞质的运输、神经元凋亡过程等方面;KEGG通路分析表明靶基因主要富集到MAPK信号通路、寿命调节通路和细胞内吞作用等,其中多个与毛囊生长发育相关的基因富集到相关通路之上。绵羊miR-370-3p在皮肤组织存在时空表达差异,在各组织间广泛表达,可能通过靶向MAPK信号通路及寿命调节等通路参与调控毛囊的生长发育。

CREM基因在miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中的表达研究

目的:探讨miR-199b-5p基因敲除对雄性小鼠精液和睾丸中CREM表达水平的影响。方法:选miR-199b-5p基因敲除(KO)雄性小鼠和野生型(WT)雄性C57BL/6小鼠。观察2组小鼠体重和睾丸指数。HE染色观察睾丸结构变化。显微镜下观察精子形态及计数精子浓度。数据库预测CREM与miR-199b-5p的靶向关系。RT-qPCR和Western印迹法分别检测2组小鼠睾丸中CREM mRNA和蛋白表达水平变化。结果:两组之间小鼠体重和睾丸指数无明显变化;与WT组比较,KO组小鼠精液精子计数稍下降,但无统计学差异(P>0.05);精液涂片示KO组精子浓度较WT组稀疏,但无统计学差异(P>0.05);睾丸病理示:与WT组比较,KO组睾丸体积较小,睾丸组织正常,生精小管可见各级生精细胞和支持细胞,生精小管界膜、管径无明显异常;数据库预测CREM基因是miR-199b-5p的靶基因;RT-qPCR结果示:与WT组比较,KO组雄鼠精液和睾丸组织中CREM mRNA表达水平均明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。Western印迹结果显示:与WT组比较,KO组雄鼠睾丸组织中CREM蛋白表达水平明显下降(P<0.05),差异有统计学意义。随访半年,统计两组雄性小鼠出生数,发现KO组雄鼠的出生数较WT组明显下降(P<0.05)。结论:miR-199b-5p敲除小鼠精液和睾丸中CREM基因表达下调,推测miR-199b-5p可能靶向作用于CREM基因进而影响雄性小鼠的生育功能。

利多卡因通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在带状疱疹后遗神经痛中的作用机制

目的研究带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)感染神经后,利多卡因通过FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在后遗神经痛中的作用机制。方法构建VZV感染的大鼠带状疱疹后遗神经痛(post herpetic neuralgia,PHN)动物模型,造模成功后,检测SD大鼠背跟神经节在感染VZV后的差异基因表达水平,结合生物信息学分析与疼痛相关的基因FOXO1(保护性)、Cacna1f(钙离子通道蛋白)和miRNA(Targetscan数据库分析并进行Realtime PCR验证),并利用双荧光素酶报告基因验证上、下游调控靶点。同时检测利多卡因组FOXO1、Cacna1f和miRNA的表达情况。结果SD大鼠PHN造模成功,且共鉴定出差异表达基因89个。生物信息分析结果显示,VZV感染后,FOXO1的表达下调,Cacna1f的表达上调;而利多卡因治疗组与VZV感染组比较,FOXO1的表达上调,Cacna1f的表达下调。Targetscan数据库分析结果显示,Cacna1f基因具有6个miRNA的结合位点,且仅有miR-203b的表达水平显著下降。通过双荧光素酶报告基因发现,在PHN中FOXO1对miR-203b具有转录调控作用,同时miR-203b可靶向于Cacna1f分子。结论FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴在PHN中起重要的疼痛信号传递作用,利多卡因可通过作用于该轴减弱疼痛信号的转导,FOXO1/miR-203b/Cacna1f信号轴可以作为治疗PHN的靶点通路。

过表达miR-124-1基因的骨髓间充质干细胞外泌体调控小胶质细胞M2型极化对脑卒中的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)外泌体(exosomes,Exo)过表达miR-124-1基因(Exo/124-1)调控小胶质细胞(microglia,MG)的M2型极化对脑卒中的影响。方法分离培养大鼠BMMSCs,收集其Exo(BMMSCs-Exo),采用流式细胞术、Western blot与透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)分别对其进行检测鉴定。30只大鼠简单随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、Exo移植组(Exo组)、空病毒(Empty lentivirus,Elv)转染Exo移植组(Exo-Elv组)及Exo/124-1移植组(Exo/124-1组),每组6只。Sham组仅行假手术,其余各组均复制大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion and reperfusion,MCAO/R)模型。模型复制1 d与14 d后,各移植组动物于右侧脑室植入相应移植物,Sham组、模型组注入相同剂量生理盐水作对照。术后2 h及1、3、7、14、21、28 d,分别对各组动物行改良神经系统严重程度评分(modified neurological severity scores,mNSS)。三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色检测其梗死体积。在基因与蛋白水平分别检测各组28 d脑组织MG的M1型分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)]、M2型分子(CD206)的表达情况。结果成功获取并鉴定了BMMSCs及其Exo。Exo/124-1显著表达miR-124-1。所有动物(假手术组除外)术后出现神经功能缺损。术后7~28 d,Exo/124-1组的mNSS明显低于MCAO/R组(P<0.05)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01);术后28 d,Exo/124-1组的脑梗死体积、TNF-α的表达明显小于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01),CD206的表达显著高于MCAO/R组(P<0.01)与Exo组、Exo-Elv组(P<0.01)。结论BMMSCs-Exo携带miR-124-1基因可能调控MG的M2型极化,抑制M1型介导的炎症反应,促进脑卒中大鼠神经功能的恢复。

前癃通胶囊介导miR-216a-5p/TPT1/mTORC1通路调控良性前列腺增生的实验研究

目的通过细胞实验探讨前癃通胶囊(qian long tong capsule,QLTC)能否通过调控miR-216a-5p/肿瘤蛋白翻译控制1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1,miR-216a-5p/TPT1/mTORC1)信号通路抑制良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)。方法将25只大鼠随机分为对照组(等体积生理盐水),QLTC低(56.25 mg/mL)、中(112.50 mg/mL)、高(225.00 mg/mL)剂量组,LBSC组(168.75 mg/mL),每组5只。每组灌胃1 mL/次,2次/d,连续5 d。各组大鼠麻醉后制备含药血清。根据实验目的不同,将CP-H022细胞分5步做实验处理,每部分实验进行独立分组。将miR-216a-5p过表达和沉默表达,及TPT1过表达进行对照研究;RT-qPCR法检测正常和BPH模型CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量,并观察不同浓度QLTC处理的BPH细胞中miR-216a-5p表达量的差异;细胞集落形成实验检测细胞增殖能力;CCK-8法检测BPH模型细胞增殖;RT-qPCR法检测miR-216a-5p、TPT1 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;生信分析、双荧光素酶实验验证miR-216a-5p与TPT1的靶向关系;过表达TPT1后,Western blot法检测BPH细胞中TPT1/mTORC1信号通路相关分子表达情况。结果与对照组1比较,模型组1的CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量下调(P<0.05);不同浓度的QLTC均能上调miR-216a-5p表达量(P<0.05);根据本实验结果,本研究将选用QLTC(高剂量)组CP-H022细胞进行后续实验。与模型组2比较,QLTC组2细胞增殖减少、凋亡增加(P<0.05),B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达降低(P<0.05),Bcl-2关联X蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein,Bax)、cleaved Caspase-3表达升高(P<0.05)。敲低miR-216a-5p后,与模型组4比较,QLTC组4细胞增殖增强、凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达降低(P<0.05)。与mimic-NC组比较,miR-216a-5p mimic组TPT1表达量降低(P<0.05);QLTC处理后,细胞TPT1、p-mTORC1表达均降低(P<0.05);过表达TPT1后BPH细胞增殖功能增强(P<0.05),凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达下降(P<0.05)。结论QLTC可通过介导miR-216a-5p下调TPT1/mTORC1通路,进而抑制BPH。

miR-208b-3p通过抑制线粒体基因表达加重心力衰竭小鼠能量代谢障碍

目的探究miR-208b-3p对主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction,TAC)诱导的心力衰竭小鼠能量代谢的作用及机制。方法将24只小鼠按照随机数字表法分为假手术组(Sham组,n=6)和手术组(n=18)。手术组采用TAC建立心力衰竭模型;假手术组采用TAC相同手术方式,但不结扎主动脉弓。于TAC术后第2周再随机分为Antagomir组(n=6)、Antagomir-NC组(n=6)及TAC组(n=6),Antagomir组、Antagomir-NC组尾静脉分别注射miR-208b-3p antagomir(800μg)及miR-208b-3p antagomir阴性对照(800μg)试剂,每周2次,连续4周。术后第6周行超声心动图评估各组小鼠心功能。HE染色及天狼星红染色观察小鼠心肌组织病理学形态。ATP检测试剂盒检测各组小鼠心肌组织ATP水平。RT-qPCR检测小鼠心肌组织miR-208b-3p、线粒体基因(ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6、CO1、CO2、CO3、CYTB、ATP6、ATP8)及POLRMT、12SrRNA的表达。双荧光素酶报告基因实验检测miR-208b-3p与潜在靶基因POLRMT的相互结合作用。Western blot检测心肌组织POLRMT及ND1、CO2、CYTB、ATP8蛋白表达水平。结果与Sham组相比,TAC组小鼠心肌miR-208b-3p表达显著增加(P<0.05)。超声检测结果显示,Antagomir组小鼠心脏的射血分数、收缩与舒张功能较TAC组明显改善(P<0.05)。组织切片染色提示,Antagomir组小鼠的心肌细胞肥大、排列紊乱、心肌间质炎细胞浸润等有明显改善(P<0.05)。与TAC组相比,Antagomir组ATP水平明显升高(P<0.05);POLRMT及线粒体基因转录产物(12SrRNA和13个线粒体基因编码多肽)表达量均显著升高(P<0.05),但SDHA、SDHB无变化。双荧光素酶报告基因实验显示miR-208b-3p与POLRMT的CDS区有结合作用。Antagomir组小鼠心肌组织POLRMT、ND1、CO2、CYTB、ATP8蛋白水平表达较TAC组显著增加(P<0.05)。结论miR-208b-3p可通过靶向POLRMT抑制线粒体基因的表达,加剧线粒体能量代谢障碍,并加重心力衰竭小鼠心功能不全及心室重塑。

miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

猪miR-192靶向调控Wnt7a基因表达的研究

【目的】鉴定猪miR-192与Wnt家族成员7A(Wnt7a)基因之间的靶向关系,为进一步构建miR-192介导的胚胎通讯提供依据。【方法】使用miRNA pull-down鉴定miR-192和Wnt7a基因间的互作关系;利用生物信息学软件RNAhybrid 2.2预测miR-192和Wnt7a基因3′-UTR的结合位点,构建含有miR-192结合位点的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型基因片段,克隆至双荧光素酶报告基因质粒,通过NotⅠ、XhoⅠ酶切和测序进行鉴定;鉴定成功的质粒分别与miR-192 mimics和mimics NC共转染猪子宫内膜上皮细胞,检测双荧光素酶活性;将miR-192 mimics、mimics NC、miR-192 inhibitor、inhibitor NC分别与构建的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒共转染至猪子宫内膜上皮细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测Wnt7a基因mRNA和蛋白的表达水平。【结果】pull-down结果显示,miR-192 mimics组与其阴性对照组相比,Wnt7a基因相对表达量极显著升高(P<0.01),miR-192 input组相对于其阴性对照组极显著降低(P<0.01);RNAhybrid 2.2软件预测到miR-192种子区与Wnt7a基因3′-UTR存在结合位点(UGACCUA);转染Wnt7a野生型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组相比双荧光素酶活性显著降低(P<0.05),转染Wnt7a突变型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组之间双荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,miR-192 mimics组Wnt7a基因mRNA相对表达量显著低于其阴性对照组(P<0.05),miR-192 inhibitor组显著高于其阴性对照组(P<0.05)。Western blotting结果表明,过表达miR-192极显著抑制了Wnt7a蛋白的表达(P<0.01),抑制miR-192后Wnt7a蛋白的表达量极显著上升(P<0.01)。【结论】miR-192能够与Wnt7a基因3′-UTR发生靶向作用并抑制其表达。研究结果可为今后深入研究miR-192在妊娠着床过程中的调控机制提供理论依据。

牛miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达及其生物学功能分析

牛miR-17~92基因簇由6个不同的功能miRNAs组成,参与牛睾丸发育与精子发生。本研究从牛基因组中获得miR-17~92基因簇序列信息进行物种保守性分析,再采用半定量PCR的方法检测miR-17~92基因簇前体miRNA在睾丸、附睾头、附睾体、附睾尾及不同活力精子中的表达水平,利用miWalk、TargetScan 7.2及miRTarBase 8.0等在线网站预测成熟miRNA的靶基因,并利用KOBAS3.0对预测靶基因进行GO和KEGG通路分析。结果表明,牛miR-17~92基因簇在哺乳动物进化中具有保守性,该基因簇的6个miRNA前体在睾丸组织中呈现高表达,均显著高于附睾组织;而这6个miRNA前体在附睾的不同位置也具有表达差异,其中pre-miR-19a在附睾尾中表达显著高于附睾体和附睾头,pre-miR17和pre-miR20a在附睾中未检测到表达;在不同活力精子中,高活力精子的bta-miR-17-5p、bta-miR-18、bta-miR-20a的表达水平显著高于低活力精子;生物信息学分析结果表明,6个miRNA一共预测到2 940个靶基因,这些靶基因主要通过MAPK信号通路、PI3K-AKT信号通路、FoxO信号通路等参与调控牛睾丸功能。本研究分析了miR-17~92基因簇在牛睾丸中的表达分布,为miR-17~92基因簇对牛睾丸发育和调控精子活力的作用机制研究提供参考依据。

山羊miR-141靶基因预测及生物信息学分析

【目的】探究miR-141在动物机体糖脂代谢和骨代谢中的调控机制,为糖尿病合并骨质疏松症动物模型构建及相关基因表达调控机制研究提供依据。【方法】利用miRbase数据库获取不同物种miR-141成熟序列,通过BioEdit及WebLogo软件进行序列比对及保守性分析;利用PROMO及JASPAR在线软件对山羊miR-141启动子区转录因子结合位点进行预测;利用TargetScan和miRwalk数据平台对miR-141靶基因进行预测;利用DAVID和KOBAS在线软件对靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析;利用Networkanalyst数据库建立miRNA靶基因蛋白互作网络并绘制网络调控图;通过YM500V2在线数据库分析miR-141在山羊不同组织中的表达情况。【结果】miR-141成熟序列在不同物种间高度保守;山羊miR-141启动子区分布有转录因子C/EBPα、MyoD、YY1和Sp1等结合位点;选用不同数据库预测到Nfatc2、Egr2和Fasl等89个靶基因。GO功能富集分析发现,靶基因主要富集在RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控与转录DNA模板等生物过程、细胞核与细胞质等细胞组分、蛋白结合与DNA结合等分子功能。KEGG通路富集显示,靶基因主要富集在肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞紧密连接、轴突引导、Hedgehog信号通路、cGMP-PKG信号通路与癌症中的microRNA等。miR-141靶基因蛋白互作分析显示,Nfatc2和Egr2基因由Fasl基因连接,构成与其他蛋白相对复杂的靶向关系,这些关键基因参与了与机体糖脂代谢及骨代谢相关的TGF-β、Hedgehog及Wnt/β-catenin等多条信号通路。miR-141在山羊多种组织中均有表达,其表达水平具有组织差异性。【结论】miR-141可通过靶向Nfatc2、Egr2和Fasl基因参与调节Hedgehog及Wnt/β-catenin等多条信号通路,并进一步调控山羊糖脂代谢、肌肉骨骼系统生理生化反应。

静原鸡miR-2954的靶基因预测及生物信息学分析

为了预测静原鸡miR-2954的靶基因,并分析miR-2954在静原鸡不同组织的表达差异,探索其在静原鸡肌肉组织生长发育中的调控机制,试验采用生物信息学方法对比miR-2954成熟序列,并分析其保守性,使用TargetScan、miRDB、miRmap在线工具预测其靶基因,对靶基因集合进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,并采用实时荧光定量PCR方法对miR-2954的组织表达水平进行研究。结果表明:miR-2954序列在鸟类间高度保守,靶基因GO功能条目主要集中在RNA聚合酶Ⅱ对转录的正向调节、信号转导、RNA聚合酶Ⅱ对转录的负向调节、氧化-还原过程、免疫反应和G-蛋白偶联受体信号转导途径等,存在于细胞核、胞浆、外泌体等多个组分中,在ATP结合、锌离子结合、金属离子结合、蛋白质结合等分子功能中也发挥作用。靶基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体的相互作用、肌动蛋白细胞骨架的调节、细胞黏附分子、AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症中的作用、胰岛素信号传递途径与脂肪细胞因子信号传递途径等信号通路。miR-2954在静原鸡公鸡肺脏、肝脏中的相对表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在静原鸡母鸡肺脏、肾脏、胸肌、腿肌中的相对表达量极显著高于其他器官(P<0.01)。说明miR-2954可通过调节其靶向基因影响静原鸡的生长发育。

miR-145基因多态性与脑梗死的关系及对miR-145水平的影响

目的探讨miR-145基因rs41291957、rs353291位点多态性与脑梗死(IS)的关系及对miR-145水平的影响。方法收集2021年1-12月百色市人民医院收治的253例IS患者(IS组)及同期在该院体检中心体检的275例健康者(对照组)血液标本,采用TaqMan探针法SNP分型技术检测rs41291957、rs353291多态性,采用SYBR Green实时荧光定量PCR检测miR-145水平。比较两组miR-145水平,以及rs41291957、rs353291多态性分布情况,分析rs41291957、rs353291位点不同基因型患者miR-145水平差异。结果miR-145基因rs41291957、rs353291位点在IS组和对照组中均存在AA、AG、GG 3种基因型,且这两个位点在IS组和对照组中的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(均P>0.05),具有群体代表性。miR-145基因rs41291957、rs353291位点的基因型和等位基因在IS组与对照组中的分布频率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。IS组患者外周血单个核细胞中miR-145水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。但无论是IS组或对照组,组内rs41291957、rs353291位点不同基因型之间的miR-145水平比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论miR-145基因的rs41291957、rs353291位点多态性与IS易感性无关。虽然IS患者的外周血单个核细胞中miR-145水平明显升高,但是rs41291957、rs353291位点多态性对miR-145水平不具有调节性。

CYP2C19基因多态性、miR-374b-5p与ACI患者神经功能缺损和近期预后的关系

目的探讨细胞色素P4502C19(CYP2C19)基因多态性、血清miR-374b-5p水平与急性脑梗死(ACI)患者神经功能缺损和近期预后的关系。方法选取2019年1月—2022年12月郑州市第七人民医院ACI患者164例,收集所有患者的一般资料,并检测CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p相对表达量。采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估ACI患者神经功能缺损程度。根据治疗15 d后的NIHSS评分将ACI患者分为预后良好组和预后不良组。采用Spearman相关分析评估miR-374b-5p与入院时NIHSS评分的相关性。采用多因素Logistic回归分析评估ACI患者近期预后不良的危险因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估CYP2C19基因型和血清miR-374b-5p判断ACI患者近期预后的效能。结果164例ACI患者CYP2C19基因型中,GG型(野生纯合子)26例(15.86%)、GA型(突变杂合子)66例(40.24%)、AA型(突变纯合子)72例(43.90%)。A等位基因频率为64.02%,G等位基因频率为35.98%。基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ^(2)=2.620,P=0.106)。GG基因型、GA基因型、AA基因型的ACI患者入院时NIHSS评分依次升高(P<0.001)。血清miR-374b-5p相对表达量与入院时NIHSS评分呈负相关(r_(s)=-0.510,P<0.001)。ACI患者预后不良发生率为19.51%(32/164)。预后不良组与预后良好组之间年龄、梗死体积、发病至就诊时间、白细胞(WBC)计数、CYP2C19基因型为AA型所占比例和血清miR-374b-5p相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05)。梗死体积、发病至就诊时间、WBC计数、CYP2C19基因型为AA型均是ACI患者预后不良的危险因素(P<0.05),miR-374b-5p相对表达量为保护因素(P=0.007)。AA基因型和血清miR-374b-5p单项检测和联合检测判断ACI患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.631、0.730、0.802。结论CYP2C19基因多态性、血清mi R-374b-5p相对表达量均与ACI患者神经功能缺损有关,或可作为ACI患者近期预后的评估指标。

miR-216a-5p靶向RAB1A基因调控食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制

目的研究miR-216a-5p对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响和潜在的分子机制。方法以正常食管上皮细胞Het-1A为对照,qRT-PCR和Western印迹检测食管癌细胞Eca109、EC9706和KYSE450中RAB1A和miR-216a-5p的表达,CCK8法和Transwell实验检测Eca109细胞增殖、迁移和侵袭能力,Western印迹检测细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、人表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白激酶B(AKT)、mTOR、p-EGFR、p-AKT和p-mTOR表达水平,双荧光素酶报告系统验证miR-216a-5p与RAB1A的调控关系。结果与正常食管上皮细胞Het-1A相比,在食管癌细胞Eca109、EC9706和KYSE450组中RAB1A mRNA和蛋白表达量均显著升高(P<0.05),miR-216a-5p表达量显著降低(P<0.05);过表达miR-216a-5p可抑制Eca109细胞增殖、迁移和侵袭,抑制EGFR/AKT/mTOR通路;miR-216a-5p靶向调控RAB1A的表达(P<0.05);过表达RAB1A可减弱miR-216a-5p过表达对Eca109细胞生物学行为的作用(P<0.05)。结论miR-216a-5p靶向RAB1A基因可能通过EGFR/AKT/mTOR通路抑制Eca109细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-216a-5p是食管癌的潜在分子靶点。

LncRNA DANCR调控食管癌细胞增殖、转移及其miR-216a表达的研究

目的探讨长链非编码RNA分化拮抗非蛋白编码(long non-coding RNA differentiation antagonizing nonprotein coding RNA,lncRNA DANCR)调控食管癌细胞增殖、转移及miR-216a表达的影响。方法本研究通过慢病毒转染技术构建了过表达及敲低lncRNADANCR的食管癌细胞株,随后通过CCK-8实验、划痕实验和Transwell实验来验证lncRNADANCR对食管癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。荧光素酶报告基因实验检测食管癌细胞中lncRNADANCR对miR-216a表达的抑制作用。结果LncRNADANCR过表达促进了食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用,而敲低则削弱了其增殖和转移作用。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)实验结果显示lncRNA DANCR抑制了miR-216a的表达,荧光素酶报告基因实验的结果也证实了这一结果。结论LncRNA DANCR能够正向调控食管癌细胞增殖、迁移和侵袭,但与miR-216a表达呈负相关性。

骨关节炎中miR-520a-5p的作用及靶基因预测分析

目的探讨miR-520a-5p在骨关节炎(OA)中的表达及利用生物信息学方法进行miRNA-mRNA的网络构建,分析潜在的分子机制及临床意义。方法通过RT-qPCR验证miR-520a-5p在骨关节炎软骨和正常软骨的表达差异。利用RNA22、ENCORI、miWalk、TargetMiner、RNAInter 5个生物信息学数据库,预测miRNA的靶基因。然后对靶基因进行KEGG以及GO富集分析,分析调控靶基因中的关键基因。利用STRING工具对所预测的靶基因进行构建蛋白与蛋白分子互作网络,利用Cytoscape分析STRING获取的信息,利用cytoHubba插件中的MCC方法筛选枢纽基因。结果骨关节炎软骨的miR-520a-5p表达明显降低于正常软骨。miRNA潜在靶基因有217个。KEGG通路富集结果显示,靶基因主要富集在“Renal cell carcinoma”“FoxO signaling pathway”“Axon guidance”等10个通路。靶基因GO富集分析主要包括分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞组成(CC)等6个富集结果。217个靶基因构建蛋白与蛋白网络分析筛选出10个枢纽基因(PIK3R1、NUP98、IGF1R、FOXO1、PIK3R3、ABL1、YWHAZ、G3BP1、TMPO、TNPO1)。结论低表达miR-520a-5p可能通过SIRT-FOXO1和AMPK等通路参与OA的发生发展进程。

德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p基因及其脂类代谢靶基因表达研究

试验旨在探究德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p基因及其靶基因的表达规律。选取饲养条件相同、同一胎次、年龄相近、处于泌乳中期的健康德宏奶水牛,分为高乳脂率组(H组)、中乳脂率组(M组)和低乳脂率组(L组)。每组选取3头奶水牛,屠宰后采集乳腺组织,提取总RNA。采用生物信息学方法预测miR-21-5p的靶基因。利用荧光定量PCR技术检测miR-21-5p及其靶基因的表达水平,并与课题组前期测定的乳脂率进行相关性分析。结果显示,miR-21-5p的靶基因可能为AGPAT6和GPAM。L组德宏奶水牛乳腺组织中miR-21-5p的表达水平高于M组和H组(P<0.01)。相关性分析结果显示,miR-21-5p与靶基因AGPAT6的表达水平呈极显著负相关(P<0.01),与靶基因GPAM的表达水平呈显著负相关(P<0.05),德宏奶水牛乳腺组织miR-21-5p表达量与乳脂率呈显著负相关(P<0.05),靶基因AGPAT6和GPAM与乳脂率呈极显著正相关(P<0.01)。蛋白互作网络结果显示,AGPAT6和GPAM互作关系最强。研究表明,miR-21-5p可能通过负调控靶基因AGPAT6和GPAM的表达影响乳脂合成,进而影响乳脂率。

大果木姜子油调控miR-328基因抗心律失常H9c2细胞的机制研究

目的:探讨大果木姜子油通过调控miR-328基因抗心律失常H9c2细胞的可能机制。方法:慢病毒转染构建miR-328过表达H9c2细胞株,再运用生物机能实验系统构建H9c2细胞和miR-328过表达H9c2细胞心律失常模型。将H9c2细胞分为正常对照组、模型组、大果木姜子油组、miR-328过表达组和miR-328过表达+大果木姜子油组。根据分组条件培养结束后,qPCR检测H9c2细胞中miR-328相对表达量;ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-6、TGF-β含量;比色法检测SOD活性和MDA浓度;DCFH荧光探针检测ROS水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot检测H9c2细胞L型钙通道相关蛋白表达。结果:成功构建H9c2细胞和miR-328过表达H9c2细胞心律失常模型。与正常对照组比较,模型组和miR-328过表达组细胞TGF-β、SOD活性及CaM、CaMKⅡ、p-CaMKⅡ蛋白表达显著降低,细胞凋亡率、miR-328及CaV1.2蛋白表达和IL-1β、IL-6、MDA、ROS水平显著升高(P<0.01)。经大果木姜子油干预后,心律失常模型细胞形态改善,上述指标均被显著逆转(P<0.01)。结论:大果木姜子油可改善心律失常H9c2细胞,其作用机制可能与调控miR-328基因降低炎症因子水平、调节氧化应激、抑制细胞凋亡及调节L型钙通道相关蛋白表达有关。

鸡miR-133a-3p的表达、生物信息学分析及其靶基因初筛

为了研究鸡不同组织中miR-133a-3p的表达情况并预测其靶基因,进行GO、KEGG富集分析,对关键靶基因进行初筛,阐明其在机体中的作用。通过miRBase检索15个物种的miR-133a-3p序列,采用MEGA 7.0进行多物种序列比对及系统进化树构建;使用TargetScan、miRDB预测鸡miR-133a-3p的靶基因,再取交集,对其进行GO、KEGG富集分析;通过qPCR检测miR-133a-3p在罗斯308肉鸡各组织中的表达量,并检测其靶基因在不同生长周龄(W0~W6)胸肌中的表达规律。结果表明,不同物种miR-133a-3p的成熟序列同源性极高,物种间保守,系统进化树分析发现,鸡miR-133a-3p与原鸽聚为一支;预测获得145个靶基因,GO富集分析显示,靶基因富集到酶活性调控、分子功能负调控、内质网系统形成、肌球蛋白结合等条目,KEGG结果显示,靶基因富集到p53、mTOR、FoxO、肌动蛋白细胞骨架调控等多条与肌肉生长发育相关的信号通路;对肌肉生长发育相关通路进行分析,挖掘到PIK3CB、NRAS、EGFR、PRKAA1、IGF1R这5个显著富集基因;miR-133a-3p仅在胸肌、腿肌、心脏中表达,且在胸肌中的表达量显著高于心脏、腿肌(P<0.01);随着生长周龄的增长,miR-133a-3p在胸肌中的表达量先升后降,而靶基因IGF1R的表达量呈先降后升的规律,它们的拐点均在第3周龄,二者负相关。综上说明,鸡miR-133a-3p在肌肉组织中特异性表达,很可能通过靶基因IGF1R调控肌肉生长发育。