miR-23a/27a/24基因簇g.65307469G>A突变对大白猪产仔数和启动子活性的影响

[目的]本文旨在研究大白猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点多态性与产仔数性状的关系及潜在机制,为母猪繁殖性状的分子育种提供新的潜在遗传标记。[方法]利用混池测序技术筛选猪miR-23a/27a/24基因簇启动子突变位点,直接测序法对大白猪群体(n=345)miR-23a/27a/24基因簇突变位点进行基因分型,计算遗传多样性;用线性模型对突变位点多态性与产仔数性状进行关联性分析;构建不同等位基因类型启动子载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过检测荧光素酶活性分析突变对启动子活性的影响;用生物信息学方法预测不同等位基因类型启动子潜在结合的差异转录因子,用荧光素酶活性分析差异转录因子对不同等位基因类型启动子活性的影响。[结果]在猪miR-23a/27a/24基因簇启动子-648 nt(Chr.2,65307469 nt)处发现1个新的G/A突变,命名为g.65307469G>A。在大白猪群体中发现3种基因型(GG、GA和AA),其中GG为优势基因型(89.57%),G等位基因为优势等位基因(94.64%)。关联性分析发现,GA基因型母猪的总产仔数(TNB)比GG基因型母猪每胎高0.56头(P<0.05)。荧光素酶活性分析结果显示G等位基因类型启动子活性显著高于A等位基因类型(P<0.05)。在不同等位基因类型启动子间发现1个潜在结合的差异转录因子死亡相关蛋白1(THAP1),成功构建猪THAP1基因过表达载体,共转试验结果显示转录因子THAP1对不同等位基因类型启动子活性均无显著影响(P>0.05)。[结论]miR-23a、miR-27a和miR-24是大白猪产仔数性状的候选基因,g.65307469G>A突变抑制miR-23a/27a/24基因簇的启动子活性,但与转录因子THAP1无关。

猪miR-23a-27a-24簇启动子预测及活性分析

目的 本研究旨在对猪miR-23a-27a-24簇(miR-23a-27a-24 cluster)的潜在启动子区域进行预测和分析,为进一步探索miR-23a-27a-24基因对猪转录调控机制的研究奠定基础。方法 利于生物信息学分析猪miR-23a-27a-24簇的启动子区域、CpG岛及其潜在的转录因子;利用截短突变和PCR技术克隆得到5个逐级缺失的miR-23a-27a-24基因启动子片段,构建双荧光素酶报告载体,通过检测各载体的双荧光素酶活性获得miR-23a-27a-24基因的核心启动子区域。结果 pGL3-cMiR启动子在猪miR-23a-27a-24簇上游341bp至994bp区荧光素酶活性最强,为pGL3-basic空载体活性的5.02倍(P<0.05),视为miR-23a-27a-24簇核心启动区。生物信息学分析表明:猪miR-23a-27a-24簇启动子区不含CpG岛,其核心启动子区可能存在SP1、VDR、MAZ、YY1、E2F1和ELF1六种潜在的转录因子结合位点。结论 本研究构建并确定了猪miR-23a-27a-24簇核心启动子区域,可为今后开展猪miR-23a-27a-24簇的转录调控机制奠定基础。

原发性痛风性关节炎患者miR-23a miR-24-2和miR-27a的表达水平及调节机制

目的:分析原发性痛风性关节炎(PGA)患者microRNA-23a(miR-23a)、microRNA-24-2(miR-24-2)和microRNA-27a(miR-27a)的表达水平及调节机制。方法:将本院50例PGA患者为病例组,30例健康体检人员为对照组。比较两组实验室常规指标,通过实时荧光定量PCR法对miR-23a、miR-24-2和miR-27a的表达水平进行检测,并采用Pearson相关性分析miR-23a、miR-24-2、miR-27a表达间的关系,将所获数据纳入统计学分析。结果:病例组血浆空腹血糖、尿酸、白细胞计数、中性粒细胞、甘油三酯、载脂蛋白B100较对照组均明显升高(均P<0.05),载脂蛋白A1较对照组均明显下降(P<0.01);而两组总胆固醇的比较,并无明显差异(P>0.05)。相比对照组,病例组miR-23a、miR-24-2和miR-27a的表达水平明显下调(P<0.01)。经Pearson相关性分析结果显示,病例组患者外周血单个核细胞中miR-23a、miR-24-2、miR-27a三者之间的表达水平存在正相关关系(P<0.01)。采用尿酸盐(100μg/mL)对健康体检人员中的外周血单个核细胞进行刺激,结果发现在炎性微环境下,刺激组外周血单个核细胞中的miR-23a、miR-24-2和miR-27a的表达水平显著低于无刺激组(P<0.01)。结论:miR-23a、miR-24-2和miR-27a可能作为炎症负性调控因子而在PGA的炎症免疫反应过程中起到重要作用,并且miR-24-2可能具有调节PGA的脂蛋白的作用。

miR-23a-27a-24簇在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用

为了解猪miR-23a-27a-24簇的序列及结构特征,分析其在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用,采用测序技术获得猪miR-23a-27a-24簇前体序列;利用生物信息学方法分析miR-23a-27a-24簇的序列信息、结构和生物学功能;使用双酶切法构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体,转染至体外培养的猪卵巢颗粒细胞中,qRT-PCR检测过表达效果;通过流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:猪miR-23a-27a-24簇前体序列长度为408 bp,核苷酸序列与其他哺乳动物的一致性较高;哺乳动物miR-23a-27a-24簇均位于基因组中ZSWIM和miR-181c基因之间,成员转录顺序相同、间距相近;功能富集分析发现,miR-23a-27a-24簇的靶基因主要富集于RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控的生物学过程和PI3K-Akt信号通路中;成功构建猪miR-23a-27a-24簇的过表达载体,且在猪卵巢颗粒细胞中高效表达;流式细胞术分析发现,转染miR-23a-27a-24簇过表达载体能够显著提高颗粒细胞的凋亡率(P<0.05),极显著提高颗粒细胞早期凋亡率(P<0.01)。结果表明miR-23a-27a-24簇能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡。

微小RNA-23a～27a～24-2簇在原发性痛风性关节炎患者的表达及其临床意义

目的 探讨微小RNA（miR）-23a～27a～24-2簇在原发性痛风性关节炎发病中的可能作用.方法 收集55例急性期痛风患者和35名健康体检者（健康对照组）的临床资料及实验室检查指标;采用实时荧光定量PCR（TaqMan探针法）检测miR-23a、miR-24-2、miR-27a表达.健康对照组的PBMCs经100μg/ml的尿酸盐刺激12h后,检测miR-23a、miR-24-2、miR-27a的变化.采用SPSS 17.0统计软件进行分析,计量资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验,尿酸盐刺激后基因表达水平采用t检验,变量间的相关关系采用Spearman相关分析.结果 ①miR-23a、miR-24-2、miR-27a在急性期痛风组表达[0.006 （0.023）、0.986 （1.313）、0.086 （0.288）]较健康对照组表达[0.180 （0.629）、4.595（4.273）、0.489（2.474）]显著降低,差异有统计学意义（Z=-5.313、-3.108、-3.257,P均＜0.01）.②Spearman相关性分析发现急性期痛风患者PBMCs中miR-23a、miR-24-2、miR-27a的表达水平相互之间均呈正相关（r=0.548、0.690、0.523,P均＜0.01）;miR-24-2在急性期痛风患者PBMCs的表达与TC、载脂蛋白B100浓度均呈正相关（r=0.46、0.44,P均＜0.05）.③炎性微环境下刺激组的PBMCs中miR-23a、miR-24-2、miR-27a的表达（0.002 6±0.0004、1.266 5±0.211 2、0.043 4±0.002 8）较空白对照组的表达（0.016 8±0.005 6、1.625 6±0.263 4、0.164 4±0.031 9）明显降低,差异有统计学意义（t=-5.04,P＜0.01;t=-2.61,P＜0.05;t=-7.55,P＜0.01）.结论 miR-23a～27a～24-2簇可能作为炎症负性调控因子参与痛风的炎症免疫反应,miR-24可能还参与急性期痛风患者脂蛋白调节.