清肾颗粒对大鼠NRK-52E细胞转分化模型miR-23b和PINK1/Parkin通路的影响

目的 探讨TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型中miR-23b对PINK1/Parkin通路的靶向调节机制,并阐明清肾颗粒含药血清对NRK-52E细胞转分化的干预机理。方法 采用超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱法对清肾颗粒进行全指纹图谱分析。构建TGF-β1诱导大鼠NRK-52E细胞转分化模型,转染siRNA后分为模拟物空载对照组、miR-23b-5p模拟物组、抑制剂空载对照组、miR-23b-5p抑制剂组,观察miR-23b-5p对PINK1表达量的影响。再将NRK-52E细胞分组为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组,Western blot法检测NRK-52E细胞中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、Beclin-1、P62、α-SMA蛋白表达,RT-qPCR法检测NRK-52E细胞中miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、α-SMA mRNA的表达,双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与PINK1的靶向关系。结果 UPLC指纹图谱法鉴定出清肾颗粒中11个活性成分。miR-23b-5p过表达后,PINK1 mRNA表达量也显著增加(P<0.05);而miR-23b-5p表达沉默后,PINK1 mRNA表达量也显著减少(P<0.05)。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-PINK1-WT荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-PINK1-mut荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清干预实验发现,TGF-β1组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显低于正常组,P62和α-SMA表达明显高于正常组(P<0.05)。清肾颗粒组和miR-23b-mimic组的miR-23b-5p、Pink1、Parkin、Beclin-1、LC3Ⅱ表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均明显高于TGF-β1组,P62和α-SMA表达明显低于TGF-β1组(P<0.05)。miR-23b-mimic+清肾颗粒组的表现更优于miR-23b-mimic组(P<0.05)。结论 清肾颗粒能够上调NRK-52E细胞内miR-23b-5p表达,并通过增强PINK1/Parkin通路介导的线粒体自噬活性,抑制NRK-52E细胞转分化进程。

胃癌组织miR-23a-3p、miR-361-5p表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路和预后的关系研究

目的探讨胃癌组织微小核糖核酸(miR)-23a-3p、miR-361-5p表达与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路和预后的关系。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应检测120例胃癌患者胃癌组织与癌旁组织中miR-23a-3p、miR-361-5p、PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA表达。Pearson相关分析胃癌组织中miR-23a-3p、miR-361-5p表达与PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA表达的相关性,以及分析miR-23a-3p、miR-361-5p表达与胃癌患者临床病理特征的关系。Kaplan-Meier生存分析胃癌组织中不同miR-23a-3p、miR-361-5p表达与胃癌患者生存预后的关系。单因素及多因素COX回归分析影响胃癌患者生存预后因素。结果相比于癌旁组织,胃癌组织中miR-23a-3p、miR-361-5p表达明显较低,而PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA表达明显较高,差异有统计学意义(均P<0.05)。Pearson相关分析结果显示,胃癌组织中miR-23a-3p、miR-361-5p表达与PI3K mRNA、AKT mRNA、mTOR mRNA表达呈负相关(均P<0.05)。不同肿瘤TNM分期、肿瘤分化程度、术后辅助化疗及淋巴结转移的胃癌患者胃癌组织中miR-23a-3p、miR-361-5p表达比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。miR-23a-3p低表达胃癌患者3年总体生存率为46.77%(29/62),低于miR-23a-3p高表达胃癌患者3年总体生存率[81.03%(47/58)],差异有统计学意义(Log-Rankχ^(2)=30.243,P<0.001)。miR-361-5p低表达胃癌患者3年总体生存率为50.79%(32/63),低于miR-361-5p高表达胃癌患者3年总体生存率[77.19%(44/57)],差异有统计学意义(Log-Rankχ^(2)=24.932,P<0.001)。单因素及多因素Cox回归分析结果显示,TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移、无术后辅助化疗、miR-23a-3p低表达、miR-361-5p低表达是影响胃癌患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。结论胃癌患者胃癌组织中miR-23a-3p、miR-361-5p表达降低,二者表达与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关,是潜在的胃癌预后相关的肿瘤标志物。

基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

METTL3调控miR-126介导TGF-β/Smad信号通路影响糖尿病肾病的机制研究

目的:建立糖尿病肾病(Diabetes Kidney Disease,DKD)大鼠模型,探讨METTL3调控糖尿病肾病的作用机制。方法:将SD大鼠适应性喂养7d后,按照随机数字法分为4组,正常对照组(Control组)、糖尿病肾病模型组(DKD组)、糖尿病肾病模型+METTL3干扰对照组(DKD+NC组)和糖尿病肾病模型+METTL3干扰组(DKD+siMETTL3组),每组8只。造模结束后收集大鼠血液标本及肾脏组织,采用全自动生化分析仪分析空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、24h尿蛋白(Uridine triphosphate,UTP)的表达水平,RT-qPCR法检测miR-126的基因表达,ELISA检测TGF-β1的表达,Western blotting检测METTL3、smad2、smad3、smad7的蛋白水平。结果:与Control组相比,DKD组的FBG、BUN、UTP、TGF-β1、METTL3、smad2、smad3显著升高(P<0.05),体质量、miR-126、smad7显著降低(P<0.05);与DKD组比较,DKD+siMETTL3组的FBG、BUN、UTP、TGF-β1、METTL3、smad2、smad3显著降低(P<0.05),体质量、miR-126、smad7显著升高(P<0.05)。结论:METTL3可以通过调控miR-126及TGF-β/smad通路,介导DKD的进展。

miR-1273g-3p调控TGF-β/Smad4信号通路影响结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨miR-1273g-3p调控转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/mothers against decapentaplegic homolog 4(Smad4)信号通路对结直肠癌细胞生物学功能的影响。方法 采用人结肠上皮细胞株NCM460为对照,对人结直肠癌细胞株HCT116和SW480采用qRT-PCR检测细胞的miR-1273g-3p表达。采用Western blot检测TGF-β和Smad4蛋白的表达。将miR-1273g-3p抑制剂转染至HCT116和SW480细胞中(miR-1273g-3p抑制剂组),并设立转染抑制剂对照剂的空载对照(抑制剂对照组)。采用qRT-PCR验证转染效果。将转染后的HCT116细胞皮下注射至BALB/c裸鼠体内。采用qRT-PCR和Western blot检测转染后细胞中TGF-β和Smad4 mRNA和蛋白的表达。采用细胞增殖和细胞毒性分析(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、划痕实验和transwell小室侵袭实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过BiBiServ及TargetScan网站预测mi R-1273g-3p与TGF-β的相关性,并用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1273g-3p与TGF-β的结合情况。结果 与人结肠上皮细胞NCM460比较,人结直肠癌细胞HCT116和SW480中miR-1273g-3p、TGF-β蛋白和Smad4蛋白均高表达(均P<0.01)。瞬时转染48 h后,与抑制剂对照组比较,miR-1273g-3p抑制剂组miR-1273g-3p表达降低(P<0.01),TGF-β和Smad4的mRNA和蛋白表达均减少(均P<0.01),细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低(均P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-1273g-3p可以靶向结合TGF-β;SW480细胞中,miR-1273g-3p抑制野生型TGF-β-3’ untranslated region(UTR)质粒转染的荧光素酶活性(P<0.01),而对突变型TGF-β-3’UTR质粒转染的荧光素酶活性无影响(P>0.05)。结论 抑制miR-1273g-3p的表达可抑制结直肠癌细胞HCT116和SW480的增殖、迁移和侵袭能力。此作用可能与TGF-β/Smad4信号通路有关。

miR-215-5p调控YY1通过TGF-β1/Smad信号通路对PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探究MicroRNA-215-5p(miR-215-5p)在多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠中的表达及其对卵巢颗粒细胞(GC)凋亡的影响,并分析潜在机制。方法采用脱氢表雄酮(DHEA)建立PCOS大鼠模型,分离并培养原代PCOS大鼠卵巢GC,分为对照组(control组)、sh-NC组、sh-YY1组、sh-YY1+LY2109761组、miR-NC组、miR-215-5p mimic组、miR-215-5p mimic+pc-NC组、miR-215-5p mimic+pc-YY1组。TUNEL法检测PCOS大鼠卵巢组织GC凋亡;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测卵巢组织/GC中miR-215-5p、阴阳-1(YY1)mRNA表达;CCK-8法和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot检测PCOS大鼠卵巢组织/GC中YY1、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad4蛋白表达。结果miR-215-5p在PCOS大鼠卵巢组织中低表达,YY1 mRNA和蛋白水平在PCOS大鼠卵巢组织中显著升高(P<0.05);敲低YY1或上调miR-215-5p可显著增强PCOS大鼠卵巢GC增殖能力,抑制GC凋亡,升高TGF-β1、Smad4蛋白水平(均P<0.05);TGF-β/Smad4信号通路抑制剂LY2109761可显著减弱敲低YY1对卵巢GC凋亡的抑制作用(P<0.05);在过表达miR-215-5p的基础上,上调YY1可抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活,显著减弱miR-215-5p mimic对PCOS大鼠卵巢GC凋亡的抑制作用(P<0.05)。结论miR-215-5p在PCOS中呈低表达,过表达miR-215-5p可能通过下调YY1,激活TGF-β1/Smad信号通路,促进PCOS大鼠卵巢GC增殖并抑制其凋亡。

外泌体介导的miR-663a通过调控TGF-β1/Smad信号通路影响结肠癌细胞侵袭和迁移

目的探讨外泌体介导的miR-663a通过调控转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响。方法从人骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液上清中分离外泌体,透射电子显微镜观察外泌体结构,Western印迹检测外泌体中CD63、CD81蛋白表达;将miR-NC、miR-663a mimics分别转染于外泌体,并分组为:EXO组(未转染的外泌体)、EXO-miR-NC组、EXO-miR-663a组,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组外泌体中miR-663a的表达;将上述各组外泌体分别与SW480细胞共培养,并分别命名为SW480+EXO组、SW480+EXO-miR-NC组、SW480+EXO-miR-663a组,在SW480+EXO-miR-663a组中加入TGF-β1/Smad信号通路激活剂SRI-011381,命名为SW480+EXO-miR-663a+SRI组,另取SW480细胞记为SW480组作为对照,激光共聚焦显微镜观察SW480细胞内吞外泌体;Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;Western印迹检测各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达。结果透射电子显微镜观察到BMSC细胞的外泌体均呈现出直径为30~100 nm的囊泡状结构,Western印迹结果表明,CD63和CD81蛋白在BMSC细胞的外泌体中高表达,而在细胞裂解液中几乎不表达;EXO组中miR-663a的表达水平显著高于BMSC细胞(P<0.05);与EXO组和EXO-miR-NC组比较,EXO-miR-663a组中miR-663a的表达水平显著升高(P<0.05);激光共聚焦显微镜结果显示,PKH26标记红色荧光的外泌体主要位于SW480细胞胞质内,并分布在核周围,大部分SW480细胞可见到红色荧光信号;与SW480组比较,SW480+EXO组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著降低(P<0.05);与SW480+EXO组和SW480+EXO-miR-NC组比较,SW480+EXO-miR-663a组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达进一步显著降低(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a+SRI组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著高于SW480+EXO-miR-663a组(P<0.05)。结论外泌体介导的miR-663a通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移。

BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

背景:先天性马蹄内翻足主要表现为骨本身异常及软骨发育异常,BMP/Smad信号通路可以指导胚胎期骨和软骨的发育,但其在马蹄内翻足病因领域发挥的作用尚无动物实验证实。目的:探讨BMP/Smad信号通路参与调控先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常的机制。方法:将生长状况相同的孕10 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组采用135 mg/kg维甲酸灌胃制作马蹄内翻足模型,对照组采用等量植物油灌胃;孕21 d后剖腹取出胎鼠,实验组孕鼠产下胎鼠41只中出现马蹄足畸形27只,畸型率65.9%;对照组获得胎鼠36只,均未出现畸形。分离胎鼠足踝部组织进行苏木精-伊红染色,并采用Western blot、RT-qPCR、免疫组化检测BMP/Smad信号通路核心蛋白Smad5、P-Smad5、通路下游蛋白SP7以及Sox9的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,苏木精-伊红染色可见实验组大鼠足踝部组织中软骨基质增多,骨间缝隙增大;②免疫组化显示实验组Smad5与SP7表达水平下降,而Sox9基因表达增高;③RT-qPCR结果显示实验组大鼠足踝部组织中Smad5、SP7的mRNA表达水平下降,Sox9 mRNA表达水平升高;④Western blot结果显示实验组大鼠足踝部软骨组织中P-Smad5/Smad5及SP7表达降低,Sox9表达升高;⑤结果说明,先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨异常的发生与BMP/Smad信号通路传导障碍有关。

益气解毒方通过TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的研究益气解毒方对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并从转化生长因子β1(TGF-β1)/SMAD3信号通路探讨其对增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法(1)将鼻咽癌细胞分为4组:溶剂对照组、益气解毒方0.5 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)2μg·mL^(-1)组,采用实时无标记细胞功能分析仪(real time cellular analysis technology,RTCA)监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(2)将鼻咽癌细胞分为5组:溶剂对照组、TGF-β110 ng·mL^(-1)组、TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、LY320088210μmol·L-1组,采用实时无标记细胞功能分析仪监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(3)随机将裸鼠分为模型组、益气解毒方组和5-Fu组。皮下部位注射细胞悬液制备鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,基本成瘤后,5-Fu组每2 d腹腔注射1次,其余组每天灌胃给药1次,连续3周。每隔3 d测量瘤体体积1次;Western Blot法检测各组组织中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与溶剂对照组比较,益气解毒方(0.5、1.0 mg·mL^(-1))组的细胞增殖曲线均下降,细胞迁移和侵袭能力均降低(P<0.05,P<0.01),且E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),β-catenin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,益气解毒方组的鼻咽癌移植瘤体积明显减小(P<0.05),且益气解毒方组移植瘤组织中的β-catenin和N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.01)。加入TGF-β1信号通路激活剂和抑制剂后,与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的TGF-β1、SMAD3、β-catenin和N-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),且细胞增殖、迁移和侵袭的能力明显增强(P<0.01)。结论益气解毒方能够通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

前癃通胶囊介导miR-216a-5p/TPT1/mTORC1通路调控良性前列腺增生的实验研究

目的通过细胞实验探讨前癃通胶囊(qian long tong capsule,QLTC)能否通过调控miR-216a-5p/肿瘤蛋白翻译控制1/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1,miR-216a-5p/TPT1/mTORC1)信号通路抑制良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)。方法将25只大鼠随机分为对照组(等体积生理盐水),QLTC低(56.25 mg/mL)、中(112.50 mg/mL)、高(225.00 mg/mL)剂量组,LBSC组(168.75 mg/mL),每组5只。每组灌胃1 mL/次,2次/d,连续5 d。各组大鼠麻醉后制备含药血清。根据实验目的不同,将CP-H022细胞分5步做实验处理,每部分实验进行独立分组。将miR-216a-5p过表达和沉默表达,及TPT1过表达进行对照研究;RT-qPCR法检测正常和BPH模型CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量,并观察不同浓度QLTC处理的BPH细胞中miR-216a-5p表达量的差异;细胞集落形成实验检测细胞增殖能力;CCK-8法检测BPH模型细胞增殖;RT-qPCR法检测miR-216a-5p、TPT1 mRNA表达水平;流式细胞术检测细胞凋亡;生信分析、双荧光素酶实验验证miR-216a-5p与TPT1的靶向关系;过表达TPT1后,Western blot法检测BPH细胞中TPT1/mTORC1信号通路相关分子表达情况。结果与对照组1比较,模型组1的CP-H022细胞内miR-216a-5p表达量下调(P<0.05);不同浓度的QLTC均能上调miR-216a-5p表达量(P<0.05);根据本实验结果,本研究将选用QLTC(高剂量)组CP-H022细胞进行后续实验。与模型组2比较,QLTC组2细胞增殖减少、凋亡增加(P<0.05),B细胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)表达降低(P<0.05),Bcl-2关联X蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein,Bax)、cleaved Caspase-3表达升高(P<0.05)。敲低miR-216a-5p后,与模型组4比较,QLTC组4细胞增殖增强、凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达降低(P<0.05)。与mimic-NC组比较,miR-216a-5p mimic组TPT1表达量降低(P<0.05);QLTC处理后,细胞TPT1、p-mTORC1表达均降低(P<0.05);过表达TPT1后BPH细胞增殖功能增强(P<0.05),凋亡减少(P<0.05),Bcl-2表达升高(P<0.05),Bax、cleaved Caspase-3表达下降(P<0.05)。结论QLTC可通过介导miR-216a-5p下调TPT1/mTORC1通路,进而抑制BPH。

肾小管HIF-1α/miR-23a通路在脓毒血症急性肾损伤中的作用机制

目的探讨肾小管低氧诱导因子-1α(HIF-1α)/MicroRNA-23a(miR-23a)通路在脓毒血症急性肾损伤(SA-AKI)中的作用及相关作用机制。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HK-2细胞),采用脂多糖(LPS)处理HK-2细胞构建SA-AKI细胞模型。LPS处理的HK-2细胞分为LPS组、NC siRNA组、HIF-1αsiRNA组、anti-miR-NC组、anti-miR-23a组、HIF-1αsiRNA+miR-NC组、HIF-1αsiRNA+miR-23a组,以正常培养的HK-2细胞作为空白对照组(Control组)。采用qRT-PCR法检测细胞中HIF-1α、miR-23a基因表达;CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;ELISA法检测细胞中炎性因子[白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]水平;Western blot法检测细胞中HIF-1α蛋白、NF-κB通路蛋白表达。结果与Control组比较,LPS组HK-2细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达水平、miR-23a mRNA表达水平均升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。与LPS组比较,HIF-1αsiRNA组HK-2细胞中HIF-1α蛋白和mRNA表达水平、miR-23a mRNA表达水平均降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低(P<0.05)。与LPS组比较,anti-miR-23a组HK-2细胞中miR-23a mRNA表达水平降低,细胞活力升高,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低(P<0.05)。与HIF-1αsiRNA组比较,HIF-1αsiRNA+miR-23a组HK-2细胞中miR-23a mRNA表达水平升高,细胞活力降低,细胞凋亡率、细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高(P<0.05)。与Control组比较,LPS组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均升高(P<0.05)。与LPS组比较,HIF-1αsiRNA组和anti-miR-23a组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均降低(P<0.05)。与HIF-1αsiRNA组比较,HIF-1αsiRNA+miR-23a组HK-2细胞p-NF-κB-p65/NF-κB-p65、p-IκBα/IκBα比值均升高(P<0.05)。结论肾小管HIF-1α通过调控miR-23a表达调节NF-κB信号通路,从而参与LPS诱导的肾小管上皮细胞损伤。

miR-590-5p靶向TGF-β1/Smad3通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的研究

目的探讨miR-590-5p通过TGF-β1/Smad3通路调控瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭的作用。方法获取瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养采用随机数字表法分组,分为空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组、miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组,其中空白对照组不进行转染,空载体转染组转染空载体、miR-590-5p mimic组转染miR-590-5p mimic、miR-590-5p inhibitor组转染miR-590-5p inhibitor、miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组转染miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1。采用CCK-8试验检测各组细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transwell试验检测细胞侵袭能力,蛋白质印迹法检测TGF-β1、Smad3蛋白表达。结果miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞培养24、48和72 h时细胞增殖活力明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞凋亡率明显高于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞侵袭数明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-590-5p mimic和siRNA TGF-β1共转染组细胞TGF-β1、Smad3蛋白相对表达量明显低于空白对照组、空载体转染组、miR-590-5p mimic组、miR-590-5p inhibitor组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论抑制miR-590-5p表达,可促进瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和侵袭以及抑制细胞凋亡,可能与通过TGF-β1/Smad3通路调控有关。

百令胶囊上调miR-145-5p逆转TGF-β_(1)/Smad3通路机制初探

目的探讨百令胶囊(BLC)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型大鼠肺损伤的改善作用,以及对香烟烟雾提取物(CSE)作用下人支气管上皮细胞BEAS-2B生长的影响。方法将60只SD大鼠随机分为正常对照组(A组,灌胃生理盐水2 mL),模型组(B组,灌胃生理盐水2 mL),BLC组(C组,灌胃BLC 5.5 mg/kg),miR-145-5p inhibitorNC组(D组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitorNC 6μL),miR-145-5p inhibitor组(E组,灌胃BLC 5.5 mg/kg+尾静脉注射miR-145-5p inhibitor 6μL),各12只。以香烟烟雾吸入法复制大鼠COPD模型。建模成功后灌胃相应药物或生理盐水(每日1次),尾静脉注射相应药物(每周1次),连续8周。以0(空白对照),3%,5%,10%,20%CSE,以及加5%,10%,20%,40%的BLC药物血清(BLC-S)孵育细胞48 h。检测大鼠潮气量(TV)、呼气峰流量(PEF)、分钟通气量(MV)、用力肺活量(FVC)和第0.3秒用力呼气容积(FEV_(0.3));观察肺组织病理形态;免疫组化法检测Smad3表达水平,用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定转化生长因子(TGF)-β_(1)表达水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测miR-145-5p mRNA表达水平。采用CCK-8法检测细胞活力。结果与B组比较,C组及D组大鼠TV,PEF,MV,FVC,FEV0.3均显著升高;与D组比较,E组大鼠上述指标均显著降低(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织病理形态显著改善,平均肺泡数显著增加,肺泡直径显著减小;与D组比较,E组大鼠肺组织病理形态未改善,且平均肺泡数显著减少,肺泡直径显著增长(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下的细胞活力显著增强(P<0.05)。与B组比较,C组及D组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与D组比较,E组大鼠肺组织中Smad3,TGF-β_(1)的表达水平均显著升高,miR-145-5p mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与5%CSE条件比较,5%CSE+20%BLC-S条件下细胞Smad3和TGF-β_(1)的表达水平均显著降低,miR-145-5p mRNA表达水平显著升高(P<0.05);与5%CSE+20%BLC-S+inhibitor NC条件比较,同水平inhibitor条件下细胞Smad3及TGF-β_(1)表达水平均显著升高(P<0.05)。结论BLC在体内和体外均显示出对香烟诱导COPD的保护作用,其机制可能与上调miR-145-5p水平逆转香烟暴露激活的TGF-β_(1)/Smad3信号通路有关。

金莲花总黄酮下调miR-215-5p抑制PI3K/AKT信号通路影响AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和迁移

目的 探讨金莲花总黄酮对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖、迁移的影响和潜在机制。方法 不同浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)的金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导CFs。细胞计数试剂盒检测细胞活力确定金莲花总黄酮使用浓度。Transwell实验、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞迁移、miR-215-5p表达水平。Western印迹检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。将miR-215-5p模拟物、抑制物分别转染CFs,检测上调或下调miR-215-5p对AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移的影响。结果 金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导的CFs后,细胞活力、迁移能力、miR-215-5p、磷酸化(p)-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著升高(P<0.05)。下调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达能够显著降低金莲花总黄酮对AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力及PI3K/AKT信号通路的影响(P<0.05)。结论 金莲花总黄酮能够降低AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移,其机制可能与下调miR-215-5p表达和抑制PI3K/AKT信号通路有关。

清肾颗粒含药血清通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路减轻NRK-52E细胞转分化

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)诱导NRK-52E(大鼠肾小管上皮细胞)细胞转分化模型中miR-23b-5p是否能对Nrf2通路靶向调节,并阐明清肾颗粒含药血清减轻NRK-52E细胞转分化的机制。方法构建TGF-β1诱导的NRK-52E细胞转分化模型,分别使用miR-23b-5p mimic、inhibitor以及阴性对照(NC)siRNA转染细胞;采用清肾颗粒含药血清进行干预,分为正常组、TGF-β1组、清肾颗粒组、miR-23b-mimic-NC组、miR-23b-mimic组、miR-23b-mimic+清肾颗粒组。采用CCK8法测定NRK-52E细胞活性;双荧光素酶报告基因实验检测miR-23b-5p与Nrf2间的靶向关系;Westernblot法检测细胞中Nrf2、Keap1、α-SMA蛋白表达;RT-qPCR法检测细胞中miR-23b、Keap1、Nrf2、α-SMAmRNA表达;流式细胞术检测ROS。结果根据CCK8结果筛选得出清肾颗粒含药血清的最佳浓度和时间分别为20%和24h,TGF-β1刺激的最佳浓度和时间分别为10ng/mL和24h。转染miR-23b-5p mimic和inhibitor发现,当miR-23b-5p过表达后,Nrf2 mRNA表达量也增加;而miR-23b-5p表达沉默后,Nrf2 mRNA表达量也减少。双荧光素酶报告显示,Rno-miR-23b-5p能显著下调Rno-Nrf2-wt荧光素酶活性(P<0.05),但未能下调突变Rno-Nrf2-mu荧光素酶活性(P>0.05)。清肾颗粒含药血清的干预实验发现,与正常组比较,TGF-β1组的miR-23b-5p、Nrf2表达降低,Keap1、α-SMA和ROS表达升高(P<0.05)。与TGF-β1组比较,清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS表达降低(P<0.05);miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic-NC组比较,miR-23b-mimic组miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。与miR-23b-mimic组比较,miR-23b-mimic+清肾颗粒组的miR-23b-5p、Nrf2表达升高,Keap1、α-SMA和ROS降低(P<0.05)。结论清肾颗粒含药血清能通过miR-23b-5p靶向Nrf2通路机制减轻NRK-52E细胞转分化。

积雪草苷对HSFB miR-564及其介导的TGF-β_(1)/Smad信号通路的影响

目的:探讨积雪草苷对人增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)中miR-564及其介导的TGF-β_(1)/Smad信号通路中相关蛋白表达的影响。方法:HSFB分为对照组、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL组,其中对照组加入100μL的DMEM培养基进行培养,0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.5mg/mL和1mg/mL积雪草苷组分别加入含相应浓度AS的DMEM培养基继续培养。分别采用MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,酶联免疫吸附试验检测细胞MMP-2、COLⅠ和COLⅢ的表达水平,免疫荧光检测细胞α-SMA蛋白的表达,RT-PCR法检测细胞中miR-564的表达,Westernblot检测TGF-β_(1)/Smad信号通路中相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,积雪草苷干预后HSFB增殖水平显著降低,凋亡水平显著增加,细胞中MMP-2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、α-SMA、TGF-β_(1)、p-Smad2,p-Smad3蛋白的表达和miR-564的表达均明显降低,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),其中以1mg/mL组对HSFB作用最佳。结论:积雪草苷能够通过抑制HSFB中miR-564的表达,进而抑制TGF-β_(1)/Smad信号通路的激活,达到促进细胞凋亡、抑制细胞增殖和胶原分泌的作用。

miR-425-5p靶向ZNF423基因调控Notch信号通路促进胃癌细胞侵袭转移

目的探究miR-425-5p靶向ZNF423基因通过Notch信号通路对胃癌细胞侵袭转移的影响和机制。方法qRT-PCR和Western blot检测人胃上皮细胞GES-1和3种胃癌细胞(AGS、SGC-7901和BGC-823)中miR-425-5p和ZNF423的表达水平。以SGC-7901细胞为研究对象,构建抑制miR-425-5p表达的细胞株,qRT-PCR检测miR-425-5p的表达水平,Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力,Western blot检测迁移侵袭和Notch信号通路相关蛋白的表达水平。双荧光素酶报告基因实验和Western blot验证miR-425-5p和ZNF423的靶向调控关系。结果与GES-1细胞相比,3种胃癌细胞中miR-425-5p的表达显著上调,ZNF423的表达显著下调。稳定抑制miR-425-5p表达的细胞株构建成功。抑制miR-425-5p可显著抑制MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes5和Hey1蛋白的表达,抑制SGC-7901细胞的迁移和侵袭。沉默ZNF423可逆转抑制miR-425-5p表达对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。沉默ZNF423还可逆转抑制miR-452-5p表达对胃癌细胞中Notch信号通路的抑制作用。结论miR-425-5p通过下调ZNF423表达激活Notch信号通路,进而促进胃癌细胞的侵袭和转移。

外泌体miR-20a-5p调控Sp1/CD147信号通路促进非小细胞肺癌的骨转移

目的探究外泌体miR-20a-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)骨转移的调控作用及机制。方法提取并鉴定16HBE、A549、PC9、H1299细胞以及转染miR-20a-5p mimic和miR-NC的A549细胞所分泌的外泌体。qRT-PCR检测各种细胞及外泌体中miR-20a-5p的表达。将A549和RAW264.7细胞分为PBS组、16HBE exo组、A549 exo组、miR-NC exo组和miR-20a-5p exo组。Transwell小室检测A549细胞迁移和侵袭能力,TRAP染色检测破骨细胞分化。Western blot检测各组RAW264.7细胞Sp1和CD147的表达。6周龄的雌性Balb/c裸鼠随机分为5组,分别注射PBS(A组)、16HBE exo(B组)、A549 exo(C组)、miR-NC exo(D组)和miR-20a-5p exo(E组)外泌体4周,构建NSCLC骨转移的小鼠模型;HE染色观察各组小鼠骨转移情况。结果透射电镜下观察到A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo为具有双层膜的囊泡样结构,粒径在30~100 nm,且均表达CD9、CD81、HSP70标志蛋白。miR-20a-5p高表达于NSCLC细胞及其外泌体。与PBS组相比,A549 exo组肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。与miR-NC exo组相比,miR-20a-5p exo组A549细胞迁移和侵袭能力增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。在小鼠体内实验中,A组、B组骨组织骨小梁结构完整,组织中有少量肿瘤细胞,骨髓腔相对完整,病变较少;C组小鼠骨组织出现大量肿瘤细胞且细胞紧密排列,骨小梁显著破坏,核浆比例严重失调,病变显著增加;E组小鼠骨组织中出现大量肿瘤细胞,骨小梁破坏严重,病变较D组显著。结论外泌体miR-20a-5p可显著促进NSCLC的体内外转移,其机制可能为激活破骨细胞Sp1/CD147信号通路从而促进破骨细胞的分化。

过表达miR-664a-5p激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨质疏松大鼠骨重建

目的探究过表达miR-664a-5p的脂肪间充质干细胞(miR-664a-5p-ADSCs)通过激活Wnt/β-catenin信号通路对骨质疏松(OP)大鼠骨重建的促进作用。方法将大鼠分为Sham组、OVX组、ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组。切除卵巢建立OP大鼠模型,Sham组仅切除脂肪组织。3个月后,ADSCs组和miR-664a-5p-ADSCs组分别尾静脉注射miR-664a-5p-ADSCs及其阴性对照ADSCs;Sham组和OVX组注射等量生理盐水。1个月后进行指标检测。micro-CT、HE染色、TRAP染色检测OP大鼠骨重建情况;免疫组化染色、RT-qPCR、Western blot检测Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白的表达。结果Sham组骨小梁完整,破骨细胞较少;与Sham组相比,OVX组骨小梁稀疏且变薄,破骨细胞较多;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05);与OVX组相比,ADSCs组、miR-664a-5p-ADSCs组骨小梁增加且增厚,破骨细胞较少;Runx2、ALP、OCN、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白水平明显升高,且miR-664a-5p-ADSCs组上述效果强于ADSCs组(P<0.05)。结论过表达miR-664a-5p的ADSCs通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进OP大鼠骨重建。

miR-30a-5p调控ECM-受体作用信号通路相关蛋白抑制肺腺癌细胞的侵袭和迁移

目的探讨miR-30a-5p和细胞外基质(ECM)-受体作用信号通路相关蛋白在肺腺癌细胞进展中发挥的调控作用。方法将miR-30a-5p模拟物及其阴性对照分别转染到肺腺癌Calu-3细胞内,设为miR-30a-5p模拟物组、模拟物对照组。通过基因集富集分析(GSEA)软件对miR-30a-5p进行通路富集分析。将miR-30a-5p抑制剂及其阴性对照转染到细胞内,设为miR-30a-5p抑制剂组、抑制剂对照组,在miR-30a-5p抑制剂组的细胞中加入ECM-受体相互作用通路蛋白抑制剂,设为miR-30a-5p抑制剂+ECM-受体相互作用抑制剂组。采用qRT-PCR法检测不同处理组细胞中miR-30a-5p mRNA表达水平,采用Western blot法检测肺腺癌细胞系中ECM-受体作用信号通路相关蛋白磷酸化水平,采用噻唑蓝(MTT)实验、细胞划痕愈合实验和Transwell实验分别检测各处理组细胞的增殖、迁移与侵袭能力。结果与人正常支气管上皮细胞BEAS-2B比较,肺腺癌细胞系SPC-A1、Calu-3、HCC827、PC14中miR-30a-5p表达水平下调(均P<0.05)。与模拟物对照组相比,miR-30a-5p模拟物抑制了细胞的增殖、迁移与侵袭(均P<0.05)。在Calu-3细胞中,miR-30a-5p显著富集在ECM-受体作用信号通路上。与抑制剂对照组相比,miR-30a-5p抑制剂组中ECM-受体作用信号通路相关蛋白磷酸化水平上调(均P<0.05),而miR-30a-5p抑制剂+ECM-受体相互作用抑制剂组相关蛋白磷酸化水平得到恢复。与抑制剂对照组相比,miR-30a-5p抑制剂组Calu-3细胞的增殖、迁移与侵袭上调(均P<0.05),miR-30a-5p抑制剂+ECM-受体相互作用抑制剂组Calu-3细胞的增殖、迁移与侵袭能力得到恢复。结论miR-30a-5p可能在肺腺癌细胞的发生、发展中发挥重要的作用,部分作用是通过调控ECM-受体作用信号通路相关蛋白实现的,miR-30a-5p可能是治疗肺腺癌的新靶点。