傣药咪多领通过miR-27b-3p/GDF-6分子轴对增生性瘢痕成纤维细胞的作用机制

目的探讨傣药咪多领通过miR-27b-3p/GDF-6分子轴对增生性瘢痕成纤维细胞的影响。方法收集增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)组织及其配对正常皮肤组织,并分别分离两组织中的成纤维细胞HSFs和NSFs。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-27b-3p及GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)实验检测GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA蛋白的表达水平;CCK-8和EdU检测HSFs细胞的增殖活力;使用ANNEXIN V-FITC/PI试剂盒检测HSFs细胞的凋亡水平。结果傣药咪多领可以下调HSFs细胞中GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA的表达水平,并抑制HSFs细胞增殖(P<0.05)。miR-27b-3p在HS组织和HSFs细胞中异常低表达,且傣药咪多领能上调miR-27b-3p的表达(P<0.05)。miR-27b-3p靶向负调控GDF-6的表达水平(P<0.05)。敲降miR-27b-3p或过表达GDF-6上调HSFs细胞中GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA的表达水平,并促进HSFs细胞增殖(P<0.05)。结论傣药咪多领通过上调miR-27b-3p抑制GDF-6的表达水平,从而抑制增生性瘢痕成纤维细胞HSFs中GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA的表达水平并抑制HSFs细胞增殖。

miR-27b-3p调控TMBIM6对A549细胞凋亡影响

目的 miR-27b-3p在抑制肺癌细胞的增殖中发挥抑癌基因作用,而跨膜Bax抑制剂的母体6(transmembrane Bax inhibitor motif-containing 6,TMBIM6)作为抗凋亡蛋白发挥促癌作用。miR-27b-3p是否调控TMBIM6参与了肺癌细胞凋亡有待进一步探讨。本研究探讨miR-27b-3p靶向调控TMBIM6对非小细胞癌A549细胞的生物学行为的影响。方法细胞实验:以不同肺癌细胞株A549、H1975、H1650和人正常肺上皮细胞BEAS-2B为研究对象;RT-qPCR检测miR-27b-3p表达,双荧光素酶实验检测miR-27b-3p和TMBIM6的靶向关系;脂质体法向A549细胞转染miR-27b-3p mimics和mimics NC后,平板克隆和MTT法检测A549增殖能力,AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术检测对凋亡的影响。动物实验:采用皮下移植方法建立60只A549裸鼠移植瘤模型,瘤内定点注射miR-27b-3p agomir或者agomir NC,3周后统一处死各处理组裸鼠,测量肿瘤质量,并采用TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡的情况;蛋白质印迹法检测各组细胞和组织中TMBIM6、calpain-2、caspase-12和Bcl-xL蛋白表达。结果细胞实验:miR-27b-3p表达水平在A549(1.44±0.07)、H1975(2.82±0.08)、H1650(4.04±0.11)和Beas2B细胞(14.44±0.20)中差异有统计学意义,F=2 180.00,P<0.05。与人正常肺上皮细胞相比,A549、H1975和H1650中miR-27b-3p表达水平降低,均P<0.05;且A549细胞中miR-27b-3p表达水平低于H1975和H1650细胞,均P<0.05。双荧光素酶实验结果显示,在TMBIM6野生型3′UTR中,miR-27b-3p mimics组荧光素酶的活力值(0.52±0.07)低于mimics NC组(0.98±0.04),差异有统计学意义,t=15.97,P<0.05;提示TMBIM6是miR-27b-3p的直接靶点。与mimics NC和空白对照组相比,miR-27b-3p mimics转染组细胞的增殖率下降,P<0.05;而凋亡率升高,P<0.05。动物实验:与agomir NC组〔(909.30±8.21)mg〕和空白对照组〔(908.20±10.64)mg〕相比,miR-27b-3p agomir组剥离肿瘤的质量〔(398.70±7.54)mg〕减少,F=1 095.00,P<0.05。TUNEL法检测结果显示,miR-27b-3p agomir组组织中细胞凋亡率〔(67.01±3.48)%〕高于agomir NC〔(12.33±1.36)%〕和空白对照组〔(15.97±0.98)%〕,F=188.40,P<0.05。蛋白质印迹结果表明,在A549细胞或者肿瘤组织中过表达miR-27b-3p,calpain-2和caspase-12表达均升高,均P<0.05;而TMBIM6和Bcl-xL表达均降低,均P<0.05。结论 miR-27b-3p靶向抑制TMBIM6表达,激活calpain-2/caspase-12信号通路促进非小细胞肺癌细胞凋亡。