miR-324-3p/MAGOH分子轴在脑胶质瘤中的功能及作用机制研究

目的探究miR-324-3p/MAGOH分子轴在脑胶质瘤中的功能及作用机制。方法收集2022年6月—2023年6月遵义医科大学附属医院神经外科接受手术治疗的胶质瘤患者(n=50)和非胶质瘤的脑病患者(n=20)样本,体外培养人脑胶质瘤细胞系U87。实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System,qPCR)检测脑胶质瘤细胞(U87)和患者临床标本中miR-324-3p和MAGOH的表达。蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测MAGOH、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和MMP9的表达水平。细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测胶质瘤细胞的增殖能力。Transwell检测胶质瘤细胞的侵袭能力。荧光素酶报告基因检测miR-324-3p和MAGOH的相互作用。免疫组化检测MAGOH在脑胶质瘤组织中的表达。结果胶质瘤患者癌组织中MAGOH的表达较高,差异有统计学意义(P<0.01);且与miR-324-3p的表达呈现显著负相关(r=0.7383,P=0.0002)。过表达MAGOH能促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭(P<0.01),而过表达miR-324-3p能抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭(P<0.01)。miR-324-3p和MAGOH的3’-UTR相互作用,且过表达MAGOH能抑制miR-324-3p对胶质瘤细胞的抑制作用(P<0.01)。结论miR-324-3p通过抑制MAGOH的表达来抑制胶质瘤细胞和增殖和侵袭。

miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体影响牙槽骨成骨细胞增殖及凋亡

背景:miR-338-3p能够抑制破骨细胞分化,下调核因子κB受体活化因子配体水平能够促进骨形成。然而miR-338-3p是否通过调控核因子κB受体活化因子配体表达影响牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡尚不清楚。目的:探究miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法:分离人牙槽骨成骨细胞,对其进行细胞转染及Wnt-C59(Wnt/β-catenin通路抑制剂)处理,分为转染对照组、miR-338-3p组、miR-338-3p+对照组、miR-338-3p+核因子κB受体活化因子配体组和miR-338-3p+Wnt-C59组。双荧光素酶实验验证miR-338-3p对核因子κB受体活化因子配体的调控作用;CCK-8、EdU染色检测细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞周期和凋亡水平;RT-qPCR检测细胞miR-338-3p、核因子κB受体活化因子配体、Wnt-3a、β-catenin、糖原合酶激酶3βmRNA表达水平;Western Blot检测细胞核因子κB受体活化因子配体、增殖细胞核抗原、Ki67、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Bax、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3、Wnt-3a、β-catenin、糖原合酶激酶3β蛋白表达水平。结果与结论:①miR-338-3p靶向调控核因子κB受体活化因子配体;②过表达miR-338-3p后,细胞存活率、EdU阳性细胞率、S期细胞比例升高,细胞凋亡率降低,miR-338-3p、增殖细胞核抗原、Ki67、细胞周期蛋白D1、Bcl-2、Wnt-3a、β-catenin mRNA和蛋白水平升高,Bax、天冬氨酸半胱氨酸蛋白酶3、核因子κB受体活化因子配体、糖原合酶激酶3βmRNA和蛋白水平降低(均P<0.05);③过表达核因子κB受体活化因子配体或Wnt-C59处理能够减弱过表达miR-338-3p对细胞增殖、凋亡的影响(均P<0.05);④结果表明,miR-338-3p靶向核因子κB受体活化因子配体表达可促进牙槽骨成骨细胞增殖,并抑制细胞凋亡,其可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路发挥作用。

水飞蓟素通过调控miR-124-3p/WEE1轴影响胶质瘤细胞恶性生长的机制研究

目的探讨水飞蓟素(SM)对胶质瘤细胞恶性生长的影响以及对miR-124-3p/WEE1轴的调控机制。方法将胶质瘤U87细胞分为对照组,SM低、中、高浓度组,SM高浓度+miR-124-3p抑制剂组(SM高+miR-124-3p inhibitor组)。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,流式细胞术检测细胞周期变化,Western blotting检测细胞中细胞周期蛋白D1(cyclin D1)及凋亡相关蛋白的表达,实时定量PCR检测细胞中miR-124-3p和WEE1 mRNA水平,荧光素酶活性实验验证miR-124-3p和WEE1之间的靶向关系,建立NOD/SCID小鼠颅内移植瘤模型并进行给药和分析。结果与对照组比较,不同浓度SM处理组的细胞增殖活性、迁移和侵袭细胞数、cyclin D1蛋白表达、WEE1 mRNA表达水平降低,G0/G1周期细胞数、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3及miR-124-3p表达升高(P<0.05);进一步转染miR-124-3p inhibitor后发现,SM对胶质瘤细胞恶性行为的抑制作用被逆转。小鼠体内实验显示,SM处理组肿瘤的质量和体积均低于模型组(P<0.05),且小鼠体质量无显著变化(P>0.05)。结论SM可通过上调miR-124-3p靶向下调WEE1抑制胶质瘤细胞的恶性生长。

LncRNA PURPL调节miR-342-3p/PIK3R1轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究长链非编码RNA(PURPL)调节微小RNA-342-3p(miR-342-3p)/磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基1(PIK3R1)轴对肝癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:细胞实验:将si-NC、si-PURPL、si-PURPL+inhibitor NC、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor分别转染至肝癌细胞Huh-7细胞并命名为si-NC组、si-PURPL组、si-PURPL+inhibitor NC组、si-PURPL+miR-342-3p inhibitor组,未做任何处理的Huh-7细胞记为NC组。双荧光素酶报告基因实验验证LncRNA PURPL、miR-342-3p、PIK3R1的关系;qRT-PCR检测人正常肝细胞系L02和人肝癌细胞系Huh-7中LncRNA PURPL、miR-342-3p表达;Western blot检测L02细胞、Huh-7细胞PIK3R1蛋白水平;MTT法检测Huh-7细胞增殖情况;流式细胞术检测Huh-7细胞凋亡率;Transwell检测Huh-7细胞侵袭数量;划痕试验测定Huh-7细胞迁移。体内实验:构建裸鼠异种移植模型,分组同细胞实验,检测肿瘤体积和肿瘤重量。结果:细胞实验结果显示:与si-NC组相比,si-PURPL组Huh-7细胞OD490值、划痕愈合率、侵袭细胞数量、LncRNA PURPL、PIK3R1水平显著下降(P<0.05),Huh-7细胞凋亡率、miR-342-3p相对表达量显著升高(P<0.05),而抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL抑制Huh-7细胞增殖、迁移、侵袭和促进凋亡的效果;LncRNA PURPL负向调控miR-342-3p/PIK3R1轴。体内结果显示:si-PURPL组裸鼠肿瘤体积和质量较si-NC组下降(P<0.05);抑制miR-342-3p表达减弱了沉默LncRNA PURPL对体内肿瘤生长的抑制作用。结论:沉默LncRNA PURPL可抑制Huh-7细胞的恶性生物学行为,其机制可能与调控miR-342-3p/PIK3R1轴有关。

糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制研究

目的 探究糖肾地黄汤通过调控lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴延缓糖尿病肾病进展的机制。方法 用小鼠单侧肾切除+腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)诱导糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)模型,选择糖尿病肾病小鼠模型组共45只小鼠,雌性CBA/J 30只,雄性DBA/2 15只,另选正常健康小鼠10只作为正常对照组。将造模的糖尿病肾病小鼠分为模型组、糖肾地黄汤高剂量组(TSDHDHD组)、糖肾地黄汤中剂量组(TSDHDMD组)、糖肾地黄汤低剂量组(TSDHDLD组),每组10只。HE染色检测小鼠的病理学变化,应用全自动生化分析仪对所获得小鼠血清空腹血糖(Fasting blood glucose, FBG),甘油三酯(Triglyceride, TG),胆固醇(Cholesterol, TC)水平,RT-PCR法分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2mRNA的表达,免疫印迹法(Westernblot, Wb)分析ARAP1、miR-25-3p、SGLT2、Bax/Bcl-2的蛋白表达。采用SPSS 23.0统计软件。结果 对照组中细胞排列致密整齐、完整,存在少量脂肪细胞(P>0.05);与对照组比较,模型组细胞结构较为散乱,且由稀疏变细,近端脂肪细胞数目增多,差异存在统计学意义(P<0.05);相比模型组,各剂量组糖肾地黄汤脂肪细胞数目下降,比较存在统计学差异(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组油红O染色镜下IOD表达降低(P<0.05)。治疗前与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平升高(P<0.05),模型组与不同剂量糖肾地黄汤组相比无统计学差异(P>0.05);与治疗前相比,治疗12周后不同剂量糖肾地黄汤组模型组FBG水平均降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组TG、TC水平降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平明显升高,Bax/Bcl-2mRNA水平明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2mRNA水平降低,Bax/Bcl-2mRNA水平明显升高(P<0.05)。与对照组相比,模型组、不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达明显升高,Bax/Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组相比,不同剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2水平降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05);与中、低剂量糖肾地黄汤组相比,高剂量糖肾地黄汤组ARAP1、miR-25-3p、SGLT2蛋白表达降低,Bax/Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论 糖肾地黄汤可能通过调节lncRNA-ARAP1/miR-25-3p/SGLT2轴,从而达到延缓糖尿病肾病进展的目的。

五味子苷B调控miR-370-3p/CCL3轴对幼年肺炎小鼠免疫炎症因子水平的影响

目的:探讨五味子苷B(Sch B)在幼年肺炎小鼠的作用机制。方法:将90只幼年雄性小鼠随机分为对照组、模型组、Sch B低剂量组(Sch BL组)、Sch B高剂量组(Sch BH组)、Sch BH+antagomir-NC组、Sch BH+miR-370-3p antagomir组各15只。Sch BL组和Sch BH组小鼠分别灌胃20、60 mg/kg的Sch B;Sch BH+antagomir-NC组和Sch BH+miR-370-3p antagomir组,先将1 nmol的miR-370-3p antagomir、antagomir-NC用20μL的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解,在Sch B灌胃后将miR-370-3p antagomir、antagomir-NC质粒分别经尾静脉注射到小鼠体内;对照组和模型组给予等量生理盐水。每天1次,持续给药7 d。测定各组小鼠肺组织的湿干质量比;采用苏木精-伊红(HE)染色观察各组小鼠肺组织的病理形态;检测各组小鼠肺组织中炎症因子水平;流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群;实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测肺组织中miR-370-3p和CCL3的mRNA水平;双荧光素酶实验验证miR-370-3p与CCL3的靶向关系。结果:与对照组相比,模型组幼鼠肺组织结构紊乱,肺泡壁变厚,出现大量炎性细胞浸润,组织受损严重,肺组织湿干质量比、CD8^(+)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、CCL3 mRNA水平均升高,CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、miR-370-3p水平均降低(P均<0.05)。与模型组相比,Sch BL组和Sch BH组幼鼠肺组织中肺泡壁变薄,炎性细胞浸润明显减少,损伤减轻,肺组织湿干质量比、CD8^(+)、TNF-α、IL-6、CCL3 mRNA水平均降低,CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)、miR-370-3p水平均升高(P均<0.05)。加入miR-370-3p antagomir进行回补实验,结果显示Sch B对肺炎幼鼠免疫功能和炎症保护作用被逆转,且CCL3 mRNA水平升高(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验验证了miR-370-3p与CCL3存在靶向关系。结论:Sch B能够通过靶向调节miR-370-3p/CCL3轴来增强幼年肺炎小鼠免疫功能,并抑制炎症反应。

异鼠李素介导miR-454-3p/PIK3R1轴对口腔鳞状细胞癌细胞生物学特性的影响

目的:探讨异鼠李素(ISO)对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞生物学特性的影响,以及在该过程中对miR-454-3p/PIK3R1轴的调控机制。方法:MTT法检测ISO对TSCC1细胞的毒性,随后将TSCC1细胞分为OSCC组、ISO组、ISO+miR-NC组、ISO+miR-454-3p mimic组。MTT法检测各组细胞的存活率;克隆形成实验检测各组细胞增殖情况;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力;RT-qPCR法检测各组细胞中miR-454-3p和PIK3R1的mRNA水平;Western blotting法检测各组细胞中PIK3R1蛋白的表达;双荧光素酶实验验证miR-454-3p与PIK3R1的靶向关系;建立裸鼠移植瘤模型,将小鼠分为模型组、ISO组、ISO组+agomir-NC组,ISO组+miR-454-3p agomir组,每组5只,干预15 d后检测各组小鼠的肿瘤质量和体积;RT-qPCR法检测肿瘤组织中miR-454-3p和PIK3R1的mRNA水平。结果:体外实验发现,与OSCC组比较,ISO组和ISO+miR-NC组细胞存活率、迁移和侵袭细胞数量、miR-454-3p表达水平均降低(P<0.05),细胞凋亡率、PIK3R1 mRNA和蛋白表达水平均升高(P<0.05);miR-454-3p mimic回补实验逆转了ISO对OSCC的抑癌作用及PIK3R1的表达水平(P<0.05),同时双荧光素酶报告基因实验验证了miR-454-3p与PIK3R1之间存在靶向关系;体内实验发现,与模型组比较,ISO组小鼠移植瘤的质量和体积均减小(P<0.05),miR-454-3p表达水平、PIK3R1 mRNA表达水平以及miR-454-3p agomir的回补实验结果均与体外实验保持一致。结论:ISO能够通过调节miR-454-3p/PIK3R1轴抑制OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。

CircRHOT1调节miR-187-3p/SOX4轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响

目的:研究环状RNA ras同源物基因家族成员T1(CircRHOT1)调节miR-187-3p/性别决定区Y框蛋白4(SOX4)轴对乳腺癌细胞增殖、凋亡和免疫逃逸的影响。方法:采用实时荧光定量PCR和Western blot检测体外培养的人正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231中CircRHOT1、miR-187-3p与SOX4表达;将体外培养的MCF-7细胞随机分为对照组、CircRHOT1敲低(转染CircRHOT1 siRNA质粒)组、miR-187-3p mimics(转染miR-187-3p mimics)组、共转染阴性对照(转染空载质粒和miR-187-3p inhibitor阴性对照)组、CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor(转染CircRHOT1 siRNA质粒和miR-187-3p inhibitor)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹检测各组细胞CircRHOT1、miR-187-3p与SOX4表达;采用EdU染色和平板集落形成实验检测各组细胞增殖;采用流式细胞术检测各组细胞凋亡;采用免疫荧光染色检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达比值(Bax/Bcl-2)。各组细胞与人外周血淋巴细胞共培养并分组转染后,采用流式细胞术检测各组人外周血淋巴细胞中活化CD8^(+)T细胞比例;采用MTT法检测人外周血淋巴细胞对各组MCF-7细胞的杀伤率。采用双荧光素酶报告实验检测MCF-7细胞CircRHOT1对miR-187-3p、miR-187-3p对SOX4的靶向调控。结果:与人正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,人乳腺癌MCF-7、Hs-578T、MDA-MB-231细胞CircRHOT1、SOX4蛋白与mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-187-3p表达明显降低(P<0.05)。与对照组相比,CircRHOT1敲低组、miR-187-3p mimics组细胞SOX4蛋白与mRNA表达、EdU阳性率、集落生成率降低(P<0.05),miR-187-3p表达、凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴细胞中活化CD8^(+)T细胞比例及其对MCF-7细胞杀伤率升高(P<0.05)。与CircRHOT1敲低组相比,CircRHOT1敲低+miR-187-3p inhibitor组细胞CircRHOT1表达差异无统计学意义(P>0.05),SOX4蛋白与mRNA表达、EdU阳性率、集落生成率升高(P<0.05),miR-187-3p表达、凋亡率、Bax/Bcl-2、人外周血淋巴细胞中活化CD8^(+)T细胞比例及其对MCF-7细胞杀伤率降低(P<0.05);共转染阴性对照组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论:敲低CircRHOT1可通过上调miR-187-3p而降低SOX4表达,从而减弱乳腺癌细胞增殖活性,并促进其凋亡,还可抑制CD8^(+)T细胞活化并增强其癌细胞杀伤力,减弱乳腺癌细胞免疫逃逸。

环状RNA hsa_circ_0003221靶向miR-139-3p/IGF2BP3轴调控口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的分子机制

目的:探讨环状RNA hsa_circ_0003221(circPTK2)靶向微小RNA(miR)-139-3p/胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)轴调控口腔鳞癌(OSCC)细胞增殖、凋亡。方法:qRT-PCR检测组织及细胞中circPTK2、miR-139-3p、IGF2BP3 mRNA表达水平;将CAL-27细胞分为5组:sh circPTK2、sh NC、sh circPTK2+miR-139-3p inhibitor、sh circPTK2+inhibitor NC、空白组。分别检测细胞增殖率、凋亡率及相关蛋白、IGF2BP3的表达,并验证miR-139-3p与circPTK2、IGF2BP3的靶向关系。结果:miR-139-3p表达在OSCC组织及细胞中降低,circPTK2、IGF2BP3 mRNA表达增加(P<0.05);沉默circPTK2可抑制细胞增殖及circPTK2、IGF2BP3 mRNA及蛋白表达,促进细胞凋亡及miR-139-3p表达(P<0.05);miR-139-3p inhibitor逆转了沉默circPTK2对CAL-27细胞恶性行为的抑制作用(P<0.05)。miR-139-3p分别与circPTK2、IGF 2BP3存在靶向关系。结论:沉默circPTK2可通过miR-139-3p/IGF2BP3轴调控OSCC细胞增殖、凋亡。

lncRNA SNAI3-AS1调节miR-367-3p/SOX4轴对前列腺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SNAI3-AS1调节微RNA(miR)-367-3p/高迁移率族盒蛋白4(SOX4)轴对前列腺癌(PC)细胞恶性生物学行为的影响。方法实时PCR检测人PCa细胞系DU145、LNCap、PC-3、正常前列腺上皮细胞系RWPE-1以及PC组织、癌旁组织中SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4 mRNA表达。选取对数生长期的LNCap,设置空白组、阴性对照(vector)组、SNAI3-AS1过表达(vector SNAI3-AS1)组、小干扰RNA(siRNA)阴性对照(si-NC)组、si-SNAI3-AS1组、si-SNAI3-AS1+抑制剂阴性对照(NC inhibitor)组和si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor组。用克隆形成实验、Transwell实验、Hoechst33258染色分别检测细胞克隆形成能力、迁移、侵袭及凋亡;实时PCR检测LNCap中SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4 mRNA表达;Western blotting检测LNCap中SOX4蛋白表达;报告基因实验验证miR-367-3p与SNAI3-AS1、SOX4的靶向关系。结果SNAI3-AS1、SOX4 mRNA表达在DU145、LNCap、PC-3及PC组织中显著增加,miR-367-3p表达显著降低(P<0.05)。与空白组、vector组相比,vector SNAI3-AS1组SNAI3-AS1、SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著增加,miR-367-3p表达、凋亡显著降低(P<0.05);与空白组、si-NC组相比,si-SNAI3-AS1组SNAI3-AS1、SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著降低,miR-367-3p表达、凋亡显著增加(P<0.05);与si-SNAI3-AS1+NC inhibitor组相比,si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor组SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著增加,miR-367-3p表达、凋亡显著降低(P<0.05),SNAI3-AS1表达无统计学差异(P>0.05)。miR-367-3p与SNAI3-AS1、SOX4存在靶向关系。结论lncRNA SNAI3-AS1通过上调miR-367-3p/SOX4轴抑制PC细胞恶性生物学行为的发展。

circ-RBM33靶向miR-383-3p/CKS1B轴抑制鼻咽癌细胞的增殖和转移

目的:探究circ-RBM33能否靶向miR-383-3p/CKS1B轴抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。方法:qRT-PCR检测CNE1和HNEpC细胞中circ-RBM33、miR-383-3p表达。将CNE1细胞随机分为si-NC组、si-RBM33组、miR-NC组、miR-383-3p组和si-RBM33+anti-miR-383-3p组。分别检测细胞增殖(CCK-8法)、侵袭(Transwell法)和迁移(划痕实验)及细胞中CKS1B蛋白表达(蛋白质印迹法);荧光素酶活性实验检测circ-RBM33和miR-383-3p/CKS1B的靶向关系。结果:人鼻咽癌细胞CNE1中circ-RBM33相对表达量高于人鼻黏膜上皮细胞HNEpC,miR-383-3p相对表达量低于人鼻黏膜上皮细胞HNEpC(P<0.05)。si-RBM33组CNE1细胞中circ-RBM3相对表达量、细胞存活率、细胞侵袭数目、细划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均低于si-NC组(P<0.05);si-RBM33+anti-miR-383-3p组CNE1细胞存活率、细胞侵袭数目、细胞划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均高于si-RBM33组(P<0.05)。miR-383-3p组CNE1细胞中miR-383-3p相对表达量明显增加,细胞存活率、细胞侵袭数目、细划痕愈合率及细胞中CKS1B蛋白表达均低于miR-NC组(P<0.05)。转染WT-circ-RBM33/CKS1B时miR-383-3p组荧光素酶活性明显低于miR-NC组(P<0.0001)。结论:敲减circ-RBM33可能通过上调miR-383-3p表达,进而抑制CKS1B表达来抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

LncRNA PSMA3-AS1调节miR-140-3p/DDX5轴对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响

目的探讨长链非编码RNA人蛋白酶体α亚基3型的反义RNA1(PSMA3-AS1)调节miR-140-3p/DEAD box p68 RNA解旋酶(DDX5)轴对肺癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化(EMT)的影响。方法qRT-PCR、Western blot、免疫组化法分别检测40例肺癌组织和细胞系中PSMA3-AS1、miR-140-3p、DDX5表达。将A549细胞分为:control组、si-NC组、si-PSMA3-AS1组、si-PSMA3-AS1+inhibitor-NC组、si-PSMA3-AS1+miR-140-3p inhibitor组,qRT-PCR检测转染效率;MTT法、流式细胞仪、Transwell小室分别检测细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭;Western blot方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、波形蛋白(vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及DDX5蛋白的表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-140-3p与PSMA3-AS1和DDX5的关系;构建肺癌裸鼠模型,分为si-NC、si-PSMA3-AS1组,测量肿瘤质量与体积,qRT-PCR检测移植瘤组织中miR-140-3p表达,免疫组化法检测移植瘤组织Ki-67、DDX5蛋白表达。结果在肺癌组织/细胞系中,PSMA3-AS1 mRNA、DDX5蛋白表达升高,miR-140-3p mRNA表达水平降低(P<0.05);敲低PSMA3-AS1表达可显著抑制A549细胞增殖、迁移与侵袭,降低PCNA、MMP-2、vimentin、DDX蛋白表达,促进miR-140-3p、Bax、E-cadherin表达及细胞凋亡(P<0.05);下调miR-140-3p,可减弱敲低PSMA3-AS1对A549细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用及对细胞凋亡的促进作用(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-140-3p与PSMA3-AS1、miR-140-3p与DDX5存在靶向调控关系(P<0.05);体内实验显示,抑制PSMA3-AS1表达可显著降低移植瘤质量和体积,降低Ki-67、DDX5表达水平,升高miR-140-3p表达(P<0.05)。结论敲低PSMA3-AS可能通过调节miR-140-3p/DDX5轴,抑制肺癌细胞的增殖和EMT,促进细胞凋亡。

CircRERE调节miR-128-3p/WEE1轴促进人多发性骨髓瘤细胞系增殖、迁移和侵袭

目的 探究环状RNA RERE(circRERE)调节微小RNA(miR)-128-3p/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(WEE1)轴对人多发性骨髓瘤(MM)细胞系增殖、迁移和侵袭的影响。方法 体外培养从健康受试者外周血中分离的正常浆细胞(nPCs)和人MM细胞系(U266、RPMI-8226、NCI-H929、LP-1)。RT-qPCR检测circRERE、miR-128-3p表达;Western blot检测WEE1表达。转染RPMI-8226细胞后,将其分为对照组(control)(未进行转染)、sh-circRERE组、sh-NC组、miR-128-3p inhibitor组、inhibitor-NC组、sh-circRERE+inhibitor-NC组、sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor组,噻唑蓝(MTT)实验和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)免疫荧光染色检测细胞增殖;划痕愈合实验、Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭;双荧光素酶报告基因实验证实miR-128-3p与circRERE或WEE1的靶向作用关系。结果 与nPCs比较,MM细胞(RPMI-8226、U266、NCI-H929、LP-1)中circRERE、WEE1表达增加,miR-128-3p表达减少(P<0.05);与对照组比较,sh-circRERE组RPMI-8226细胞增殖率、EdU阳性细胞比例、划痕面积愈合率、侵袭数均减少(P<0.05),miR-128-3p inhibitor组则相反(P<0.05);miR-128-3p inhibitor降低了sh-circRERE对RPMI-8226细胞增殖、迁移、侵袭的影响(P<0.05)。双荧光素酶实验显示circRERE/miR-128-3p、miR-128-3p/WEE1存在靶向作用关系。结论 CircRERE能够促进RPMI-8226细胞增殖、迁移和侵袭,可能通过对miR-128-3p发挥海绵效应以增加WEE1表达而实现。

LINC00943调节miR-331-3p/KMT2A轴对宫颈癌细胞恶性生物学行为和上皮间质转化的影响

目的探讨LINC00943调节miR-331-3p/KMT2A轴对宫颈癌(CC)细胞恶性生物学行为和上皮间质转化(EMT)的影响。方法检测正常宫颈上皮细胞Ect1/E6E7和人CC细胞系(HeLa、SiHa、C33A、CaSki)中LINC00943表达,筛选HeLa细胞为最佳细胞系。Targetscan检索预测miR-331-3p与LINC00943、KMT2A的结合位点,培养HeLa细胞并分为sh-NC组、sh-LINC00943组、sh-LINC00943+NC inhibitor组、sh-LINC00943+miR-331-3p inhibitor组、miR-NC组、miR-331-3p mimics组、miR-331-3p mimics+pcDNA组、miR-331-3p mimics+KMT2A组,检测各组细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭情况以及EMT相关蛋白的表达水平。结果LINC00943在CC细胞系的HeLa细胞中表达量最高(P<0.05)。双荧光素酶报告实验表明,LINC00943靶向下调miR-331-3p,miR-331-3p靶向下调KMT2A。细胞实验结果显示:沉默LINC00943或过表达miR-331-3p可抑制HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,促进细胞凋亡(P<0.05);抑制miR-331-3p表达或过表达KMT2A可逆转沉默LINC00943或过表达miR-331-3p对HeLa细胞增殖、迁移、侵袭和EMT的抑制作用(P<0.05)。体内肿瘤形成实验证实,沉默LINC00943可显著抑制肿瘤生长和EMT。结论LINC00943在CC细胞中高表达,沉默LINC00943可调节miR-331-3p/KMT2A轴抑制CC细胞增殖、迁移、侵袭和EMT等恶性生物学行为,促进细胞凋亡。

miR-7-5p和miR-152-3p联合调控Wnt/β-catenin通路对乳腺癌细胞上皮-间质转化及化疗耐药的影响

目的探讨miR-7-5p和miR-152-3p协同抑制乳腺癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进程及紫杉醇耐药的分子机制。方法采用生物信息学软件预测miR-7-5p和miR-152-3p的靶基因,双荧光素酶报告基因检测两者与TCF4的靶向关系;Western blot法检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键调控因子β-catenin及TCF4蛋白的表达;在转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics基础上给予Wnt/β-catenin通路激活剂LiCl处理后,Western blot法检测MCF-7/TAX细胞中β-catenin、TCF4和EMT相关蛋白(E-cadherin、vimentin)的表达,Transwell小室实验检测MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力;MTT实验检测激活Wnt/β-catenin信号通路对MCF-7/TAX细胞紫杉醇耐药性的影响。结果TCF43′UTR区域存在能够与miR-7-5p及miR-152-3p互补的结合位点;转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后可使TCF4野生型(TCF4-WT)报告基因载体的荧光素酶活性较NC组明显降低(P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组相比,转染miR-7-5p mimics和miR-152-3p mimics后各组紫杉醇耐药MCF-7/TAX细胞中β-catenin和TCF4蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),且两者共同转染后MCF-7/TAX细胞中β-catenin和TCF4蛋白的表达水平较miR-7-5p组或miR-152-3p组进一步降低(P<0.05)。Western blot结果显示,LiCl处理后MCF-7/TAX细胞中β-catenin、TCF4和vimentin蛋白表达水平明显升高,而E-cadherin蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。Transwell小室结果显示,LiCl处理后MCF-7/TAX细胞侵袭和迁移能力明显增强(P<0.05)。MTT结果显示,不同浓度紫杉醇作用下,miR-7-5p+LiCl组细胞增殖活力较miR-7-5p组明显升高;同时miR-152-3p+LiCl组和miR-7-5p/152-3p+LiCl组细胞的增殖活力较NC组均明显升高(P<0.05)。结论TCF4是miR-7-5p和miR-152-3p的共同靶标。miR-7-5p和miR-152-3p可共同抑制MCF-7/TAX细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活化。

miR-324-3p通过调控MC1R基因影响黑色素的形成

旨在证明miR-324-3p可以通过调控其预测的靶基因MC1R及其下游基因的表达从而对羊驼皮肤黑色素的合成产生影响。本研究在体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中转染miR-324-3p过表达载体,应用qRT-PCR与Western blotting分析比较各试验组中MC1R基因与毛色相关基因小眼畸形相关转录因子(Microphthalmia-associtated transcription factor,Mitf)、酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)、酪氨酸相关蛋白2(Tyrosinase related protein 2,Tyrp2)的表达差异性,利用酶标仪检测黑色素产量的变化。结果显示:(1)miR-324-3p在棕色与白色羊驼皮肤中均有表达,且在棕色羊驼皮肤中极显著表达(P<0.01),其相对表达量是白色的1.64倍;(2)黑色素细胞被转染了miR-324-3p过表达载体后,处理组靶基因MC1R及其下游调控基因Mitf、Tyr和Tyrp2的表达量与黑色素产量较空白对照组均有下调,且以Mitf基因表达量极显著下调(P<0.01)。综上表明,羊驼皮肤中miR-324-3p可能通过调控MC1R基因的表达,顺势下调MC1R基因下游调控基因Mitf、Tyr与Tyrp2的表达,最终对羊驼皮肤黑色素细胞中黑色素的类型及合成量产生影响。

miR-144-3p通过靶向FZD4阻断Wnt/β-catenin通路抑制肝癌Huh-7细胞的恶性生物学行为

目的:探讨miR-144-3p通过阻断卷曲受体4(FZD4)/Wnt/β-catenin信号通路对肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其作用机制。方法:收集2012年3月至2017年7月在柳州市工人医院手术切除的18例肝癌患者的癌组织及相应的癌旁组织标本,以及肝癌细胞系Huh-7、SMMC7721和MHCC97和人正常肝上皮细胞株THLE-3,用qPCR检测肝癌组织及细胞系中miR-144-3p的表达水平。将miR-144-3p mimics/inhibitor和FZD4敲降载体转染至Huh-7细胞中,用CCK-8、Transwell、划痕愈合实验和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测Huh-7细胞的增殖、迁移和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因验证miR-144-3p和FZD4的靶向关系。结果:在肝癌组织和细胞系中miR-144-3p均呈低表达(P<0.05或P<0.01)。过表达miR-144-3p可显著抑制Huh-7细胞增殖、迁移并诱导细胞凋亡(均P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证明miR-144-3p靶向作用FZD4并下调其表达水平。体外实验进一步证实,过表达miR-144-3p靶向FZD4并阻断Wnt/β-catenin通路,进而抑制Huh-7细胞增殖、迁移和促进细胞凋亡(均P<0.01)。结论:miR-144-3p通过阻断FZD4/Wnt/β-catenin通路抑制肝癌Huh-7细胞的恶性生物学行为,为肝癌诊断或治疗提供了潜在分子靶点。

LncRNA BLACAT1调节miR-324-5p/MAP4K3轴对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探讨长链非编码RNA膀胱癌相关转录本1(LncRNA BLACAT1)调节miR-324-5p/丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)轴对人肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝癌组织、癌旁组织以及人正常肝细胞、人肝癌细胞(Huh-7、SMMC-7721、MHCC97 L)中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA的表达水平;将肝癌细胞系Huh-7细胞分为:ctrl组、si-NC组、si-BLACAT1组、si-BLACAT1+miR-NC组、si-BLACAT1+miR-324-5p inhibitor组;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中BLACAT1、miR-324-5p、MAP4K3 mRNA的表达;CCK-8法检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室检测细胞侵袭;蛋白免疫印迹检测细胞中MAP4K3、PCNA、MMP2、MMP9、c-Myc、Cyclin D1的表达;双荧光素酶报告基因实验分别验证BLACAT1和miR-324-5p、miR-324-5p和MAP4K3的关系。结果肝癌组织和人肝癌细胞系中BLACAT1、MAP4K3 mRNA表达水平显著增加,miR-324-5p表达显著降低(P<0.05);与ctrl组、si-NC组比较,si-BLACAT1组Huh-7细胞的BLACAT1、MAP4K3 mRNA表达、A450值、迁移率、侵袭率、PCNA、MMP2、MMP9、MAP4K3、c-Myc、Cyclin D1表达明显降低(P<0.05),miR-324-5p表达显著增加(P<0.05);抑制miR-324-5p表达减弱了敲低BASCAT1对Huh-7细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用;BASCAT1靶向负调控miR-324-5p表达,miR-324-5p靶向调控MAP4K3表达。结论敲低BLACAT1可能通过靶向miR-324-5p来下调MAP4K3表达,进而抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

LncRNA GAS6-AS1靶向miR-324-3p激活Wnt/β-catenin通路调控脑胶质瘤细胞增殖及放疗敏感性的研究

目的研究LncRNA GAS6-AS1对脑胶质瘤T98G细胞增殖及其放疗敏感性的影响。方法RT-qPCR技术分析脑胶质瘤组织、癌旁组织和X射线照射的T98G细胞中LncRNA GAS6-AS1、miR-324-3p基因表达。分别下调T98G细胞中GAS6-AS1或miR-324-3p的表达后,利用X射线照射细胞,分析GAS6-AS1表达下调对T98G细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。miRcode和双荧光素酶报告基因实验检测LncRNA GAS6-AS1和miR-324-3p之间的相互关系。同时上调LncRNA GAS6-AS1与miR-324-3p在T98G细胞中的表达,进一步分析T98G细胞增殖、侵袭和放疗敏感性。Western blot检测miR-324-3p对Wnt/β-catenin通路的影响。分析miR-153-3p通过Wnt/β-catenin通路对T98G细胞增殖、侵袭和放疗敏感性的影响。结果与癌旁正常组织比较,脑胶质瘤组织中LncRNA GAS6-AS1 mRNA表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。2、4、6 Gy X射线照射T98G细胞后中GAS6-AS1 mRNA表达低于0 Gy剂量X射线照射(P<0.05)。下调LncRNA GAS6-AS1表达后,GAS6-AS1 mRNA表达明显降低(P<0.01)。下调GAS6-AS1表达后,T98G细胞活力降低(P<0.01),细胞侵袭数目减少。6 Gy X射线照射细胞后活力明显降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高;下调GAS6-AS1表达后并用6 Gy X射线照射细胞,活力明显降低(P<0.05),细胞凋亡率明显升高。GAS6-AS1 wt+miR-324-3p mimics组荧光素酶活性显著低于mimics NC+GAS6-AS1 wt组(P<0.01)。与癌旁正常组织比较,脑胶质瘤组织中miR-324-3p mRNA表达显著降低(P<0.01)。2、4、6 Gy X射线照射T98G细胞后中miR-324-3p mRNA表达高于0 Gy剂量X射线照射(P<0.05)。上调GAS6-AS1和miR-324-3p表达后,GAS6-AS1、miR-324-3p mRNA表达明显升高(P<0.01)。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC组比较,pcDNA-GAS6-AS1+mimics NC组T98G细胞活力和侵袭数目显著升高(P<0.05),pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics组细胞活力和侵袭数目显著降低(P<0.05);与pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics组比较,pcDNA-GAS6-AS1+miR-324-3p mimics组细胞活力和侵袭数目显著升高(P<0.05)。与pcDNA-3.1(+)+mimics NC+6 Gy组比较,pcDNA-GAS6-AS1+mimics NC+6 Gy组细胞活力明显上升,细胞凋亡率明显降低(P<0.05);pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics+6 Gy组细胞活力明显降低,细胞凋亡率明显上升(P<0.05);与pcDNA-3.1(+)+miR-324-3p mimics+6 Gy组比较,pcDNA-GAS6-AS1+miR-324-3p mimics+6 Gy组细胞活力明显上升,细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。与mimics NC组比较,miR-324-3p mimics组细胞内β-catenin和CyclinD1蛋白表达显著降低,β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH比值显著降低(P<0.01)。与inhibitor NC组比较,miR-324-3p inhibitor组细胞内β-catenin和CyclinD1蛋白表达显著升高,β-catenin/GAPDH、CyclinD1/GAPDH比值显著升高(P<0.01)。与inhibitor NC组比较,miR-324-3p inhibitor转染T98G细胞48 h后增殖活力显著上调(P<0.05),细胞侵袭数目明显增加(P<0.01);与miR-324-3p inhibitor组比较,miR-324-3p inhibitor+XAV939组细胞增殖活力显著降低(P<0.05),细胞侵袭数目明显减少(P<0.01)。用6 Gy X射线照射T98G细胞后,与inhibitor NC组比较,miR-324-3p inhibitor组细胞增殖活力显著上调(P<0.05),细胞凋亡率明显降低(P<0.01),与miR-153-3p inhibitor组相比,miR-153-3p inhibitor+XAV939组细胞增殖活力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。结论LncRNA GAS6-AS1靶向miR-324-3p激活Wnt/β-catenin通路促进了T98G细胞增殖,降低了放疗敏感性。

lncRNA MEG3通过miR-9-5p/SOCS5轴对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探讨lncRNA母源性印记基因3(maternal imprinting gene 3,MEG3)通过miR-9-5p/SOCS5轴对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的调控作用。方法:收集2017年1月至2019年6月重庆市中医院手术切除的20例宫颈癌患者的癌及癌旁组织标本;利用脂质体转染技术分别将pcDNA3.1-MEG3、si-MEG3、miR-9-5p mimics、miR-9-5p inhibitor及其对照质粒等转染进宫颈癌HeLa和SiHa细胞,构建过表达和沉默细胞模型。用qPCR检测宫颈癌组织及细胞模型中MEG3、miR-9-5p和SOCS5表达水平,用CCK-8法、Transwell小室法检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力,用细胞免疫荧光实验检测细胞中E-cadherin和vimentin表达水平。通过在线生物信息学TargetScan数据库预测靶基因,用双荧光素酶报告基因实验验证miR-9-5p分别与MEG3和SOCS5的靶向关系。结果:分别与癌旁组织和宫颈上皮HcerEpic细胞比较,宫颈癌组织和细胞系中MEG3和SOCS5表达显著下调、miR-9-5p表达显著上调(均P<0.01)。TargetScan数据库分析和双荧光素酶报告基因实验证实miR-9-5p与MEG3或SOCS5存在靶向关系。MEG3和SOCS5显著抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力(均P<0.01),miR-9-5p显著提高细胞的增殖、迁移与侵袭能力(均P<0.01)。MEG3和SOCS5促进E-cadherin表达、抑制vimentin表达;miR-9-5p抑制E-cadherin表达、促进vimentin表达(P<0.05或P<0.01)。结论:lncRNA MEG3通过miR-9-5p/SOCS5分子轴调控宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭与EMT进程。