抑制miR-327表达的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建并鉴定可稳定抑制miR-327表达的重组腺病毒载体。方法:根据miR-327成熟体反向互补序列,合成寡核苷酸链,构建抑制miR-327表达的质粒载体,并对阳性克隆子进行测序鉴定。miR-327shRNA重组质粒载体经包装、扩增、纯化获得miR-327shRNA重组腺病毒,测定滴度。结果:获得最终滴度为1×10^(11) PFU/mL的大鼠miR-327shRNA重组腺病毒载体。结论:成功构建具备一定滴度的大鼠miR-327shRNA重组腺病毒载体,为后期揭示miR-327在心血管疾病中的作用及机制提供了基础。

黄芪甲苷通过下调miR-327缓解缺氧对脑微血管内皮细胞凋亡及炎症反应的影响

目的探讨黄芪甲苷对缺氧处理的脑微血管内皮细胞(BMECs)损伤的影响及分子机制。方法体外培养BMECs,将其分为对照组、模型组、低、中、高剂量黄芪甲苷组、高剂量黄芪甲苷+miR-NC、高剂量黄芪甲苷+miR-327;四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;蛋白质印迹(western blot)法检测蛋白表达;试剂盒检测BMECs损伤标志物,包括乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px);酶联免疫吸附实验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α);实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-327的表达水平。结果与对照组比较,缺氧处理9 h与12 h处,BMECs存活率显著降低(P<0.05)。与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著升高,Bcl-2表达水平显著降低,Bax表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量黄芪甲苷组细胞凋亡率均显著降低,Bcl-2表达水平升高,Bax表达水平降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。与对照组相比,模型组LDH、MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平显著升高,SOD和GSH-Px表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量黄芪甲苷组LDH、MDA、IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平显著降低,SOD和GSH-Px表达水平显著升高,且呈剂量依赖性(P<0.05)。与对照组相比,模型组miR-327表达水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,低、中、高剂量黄芪甲苷组miR-327表达水平显著降低,且呈剂量依赖性(P<0.05)。过表达miR-327逆转了黄芪甲苷对缺氧处理BMECs凋亡和炎症反应的影响。结论黄芪甲苷可能通过下调miR-327表达缓解缺氧对BMECs凋亡及炎症反应的影响。