感音神经性耳聋患者外周血miR-34c、miR-29b的表达及意义

目的探讨感音神经性耳聋(SNHL)患者外周血miR-34c、miR-29b的表达情况及临床意义。方法筛选2020年6月至2023年6月我院收治的神经性耳聋患者140例为观察组,同期选取体检健康者40例为对照组。根据听力损伤情况将SNHL患者分为轻度耳聋组63例,中度耳聋组42例,重度耳聋组35例。采用qRT-PCR检测miR-34c、miR-29b的表达,并检测VEGF、氧化应激水平(TAC、SOD、MDA)、NO和Cx26;采用Pearson检验进行相关性分析,采用logistic回归分析SNHL病情严重程度的独立危险因素,采用ROC曲线评估miR-34c、miR-29b对SNHL患者病情严重程度的预测价值。结果4组NO、TAC、SOD、Cx26水平比较,重度耳聋组<中度耳聋组<轻度耳聋组<对照组(P<0.05);VEGF和MDA水平比较,重度耳聋组>中度耳聋组>轻度耳聋组>对照组(P<0.05)。4组miR-34c mRNA和miR-29b mRNA表达水平比较,重度耳聋组>中度耳聋组>轻度耳聋组>对照组(P<0.05)。Pearson相关分析显示,SNHL患者外周血miR-34c、miR-29b与VEGF、MDA呈正相关,与NO、TAC、SOD、Cx26呈负相关(P<0.05)。多因素logistic回归分析显示,VEGF、MDA、NO、Cx26、TAC、SOD、miR-34c、miR-29b是影响SNHL病情严重程度的独立因素。结论miR-34c、miR-29b在SNHL患者中过表达,可作为预测评估SNHL患者病情严重程度的血清标志物。

miR-34c-5p靶向poFUT1对胎盘血管形成的影响

目的:探讨miR-34c-5p与poFUT1的靶向关系及对胎盘血管形成的影响。方法:利用ENCORI数据库预测miR-34c-5p与poFUT1的结合位点,采用双荧光素酶报告实验验证。随机选取2023年4至10月在郑州大学第三附属医院住院的胎儿生长受限(FGR)孕妇20例(FGR组),选择同期正常孕妇20例为对照。采用实时荧光定量PCR法检测两组胎盘组织中miR-34c-5p和poFUT1 mRNA的表达。取脐静脉内皮细胞,分组转染miR-34c-5p模拟物及其对照(NC)、miR-34c-5p抑制物及其NC、si-poFUT1 NC、si-poFUT1、si-poFUT1+miR-34c-5p抑制物,采用CCK-8法、Transwell实验以及成管实验检测细胞转染24、48、72、96 h后的增殖能力,转染48 h后的侵袭能力和成管能力。结果:FGR组和对照组胎盘组织中miR-34c-5p表达水平分别为(1.57±0.39)、(1.09±0.18),poFUT1 mRNA表达水平分别为(0.51±0.17)、(1.06±0.13),FGR组胎盘组织中miR-34c-5p表达水平高于对照组,poFUT1 mRNA表达水平低于对照组(P<0.05)。与miR-34c-5p模拟物NC组比较,模拟物组侵袭细胞数和管腔节点数减少,细胞增殖活性降低(P<0.05)。与miR-34c-5p抑制物NC组比较,抑制物组侵袭细胞数和管腔节点数增加,细胞增殖活性升高(P<0.05)。与si-poFUT1 NC组相比,si-poFUT1组侵袭细胞数和管腔节点数减少,细胞增殖活性降低(P<0.05),而si-poFUT1+miR-34c-5p抑制物组上述变化较si-poFUT1组部分逆转(P<0.05)。结论:miR-34c-5p可能通过调控poFUT1影响血管内皮细胞功能,从而影响胎盘的血管形成,参与FGR的发生。

EBV下调miR-34c促进鼻咽癌细胞增殖、迁移的作用及机制研究

目的:探究爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)下调miR-34c促进鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭的作用及机制。方法:采用qPCR检测EBV阴性鼻咽癌SUNE1、CNE2、HK1细胞和EBV阳性C666-1细胞中miR-34c表达水平。构建miR-34c模拟物以分析miR-34c对鼻咽癌细胞生物学功能的影响。使用CCK-8、划痕愈合试验以及Transwell细胞侵袭试验检测鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Western blotting测定细胞中迁移、侵袭相关蛋白以及Erk1/2信号通路蛋白的表达水平。结果:miR-34c在EBV阳性C666-1细胞表达下调(P<0.05)。CCK-8结果显示,miR-34c组C666-1细胞在16、24、48 h的活力明显低于EBV组(P<0.01)。划痕试验和Transwell试验结果显示,与miR-34c组比较,EBV组C666-1细胞迁移和侵袭能力均明显增强(P<0.01)。Western blotting结果显示,与miR-34c组比较,EBV组C666-1细胞迁移和侵袭相关蛋白Vimentin、Snail、MMP-2、MMP-3及Erk1、Erk2蛋白表达均明显升高(P<0.01)。结论:miR-34c在EBV阳性鼻咽癌细中表达下调,EBV下调miR-34c可增强鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移能力及激活Erk1/2信号通路。

血浆miR-320c、miR-126及miR-34c联合检测对慢性阻塞性肺疾病严重程度的预测价值

目的探讨血浆miRNA水平与慢性阻塞性肺疾病(COPD)严重程度的相关性。方法利用荧光定量PCR(qPCR)检测健康人群(10例)及COPD患者(10例)血浆miRNA的表达水平,筛选与COPD患者密切相关的miRNA。进一步在健康人群(28例)和COPD慢性阻塞性肺疾病全球创议(GOLD)Ⅰ级(30例)、Ⅱ级(32例)、Ⅲ级(30例)及Ⅳ级(28例)患者中明确候选miRNA单独及联合检测对COPD严重程度的预测价值。结果COPD患者血浆miR-320c、miR-126及miR-34c水平显著高于健康人群(P<0.01)。随着COPD级别的增加,血浆miR-320c、miR-126及miR-34c的表达水平亦增加。miR-320c、miR-126、miR-34c单独及联合检测预测中重度COPD患者的ROC曲线下面积(AUC^(ROC))分别为0.822、0.705、0.783及0.892。结论血浆miR-320c、miR-126及miR-34c可预测COPD严重程度,其联合检测的预测效能显著高于单项miRNA。

癌相关成纤维细胞外泌体miR-34c-5p对胃癌细胞干细胞样表型的影响

目的探讨癌相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAFs)来源的外泌体miR-34c-5p是否有助于促进胃癌(gastric carcinoma,GC)细胞的干细胞样特性。方法收集并鉴定初代培养的CAFs和配对的正常成纤维细胞(normol fibroblasts,NFs)的外泌体,检测CAFs和NFs之间外泌体中miR-34c-5p的差异表达。CCK8实验检测GC细胞活力;克隆形成实验检测GC细胞增殖能力;Transwell实验检测GC细胞侵袭能力;细胞成球形成实验评估GC细胞成球能力;蛋白质印迹法检测细胞干细胞特性相关蛋白的表达。结果miR-34c-5p在CAFs衍生的外泌体中的表达显著降低。与CAFs-exo组比较,CAFs-exo中miR-34c-5p抑制GC细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05);抑制GC细胞成球,并降低SOX2、OCT4和NANOG蛋白的表达水平,有显著性差异(P<0.05)。结论CAFs来源的外泌体miR-34c-5p抑制GC细胞的干细胞样表型。

miR-34c抑制NLRP3炎性小体诱导的小胶质细胞焦亡机制研究

目的:探索miR-34c在调控NLRP3炎性小体激活caspase-1信号通路诱导小胶质细胞焦亡中的作用。方法:观察脂多糖(LPS)联合ATP激活小胶质细胞后,通过乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测LDH的释放,以判断小胶质细胞细胞膜的完整性;再对miR-34c转染后的小胶质细胞在LPS和ATP激活下,观察小胶质细胞细胞膜变化。采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)分别检测miR-34c转染后的小胶质细胞和未转染的小胶质细胞在LPS和ATP刺激下活力变化情况。采用蛋白免疫印迹分别检测LPS+ATP诱导的小胶质细胞(对照组)中和miR-34c转染后小胶质细胞(观察组)中的蛋白表达情况,如NLRP3炎性小体、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18。结果:LPS+ATP联合诱导下的小胶质细胞较正常的小胶质细胞,miR-34c表达减少(P<0.01);观察组小胶质细胞LDH释放水平较对照组下降(P<0.01);CCK-8测试细胞活力中,2组小胶质细胞除第1天活力差异无统计学意义(P>0.05)外,其他时间观察组均明显高于对照组(P<0.01);观察组中小胶质细胞中NLRP3炎性小体、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18生成较之对照组小胶质细胞中炎性小体相关因子减少(P<0.01)。结论:miR-34c可以抑制LPS+ATP诱导的小胶质细胞焦亡,可能通过降低NLRP3炎性小体活化及下游caspase-1依赖细胞焦亡信号通路关键蛋白表达有关。

miR-34c-5p/PAICS轴调节肺腺癌细胞生物学行为研究

目的分析miR-34c-5p靶向结合磷酸核糖基氨基咪唑羧化酶(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase,PAICS)促进肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)增殖、迁移和侵袭的能力。方法生物信息学分析miR-34c-5p和PAICS在LUAD组织中的表达情况及与临床特征之间的关系。实验将A549、Calu-3细胞分为miR-NC组、miR-34c-5p组、miR-34c-5p+PAICS组。实时荧光逆转录定量聚合酶链反应(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定miR-34c-5p表达水平。细胞计数试剂盒(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞增殖能力。Transwell实验检测各组细胞迁移和侵袭能力。裸鼠成瘤实验检测瘤体重量、体积。Western blot测定各组细胞PAICS蛋白表达水平。数据库预测miR-34c-5p靶基因,双荧光酶素报告实验进行验证。结果miR-34c-5p在LUAD组织中低表达,PAICS在LUAD组织中高表达,且均与临床不良表型有关。miR-34c-5p组中miR-34c-5p表达高于miR-NC组(P<0.05)。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显降低(P均<0.05)。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组瘤体重量变轻,体积减小(P均<0.05)。生物信息学和双荧光酶素报告实验均表明PAICS是miR-34c-5p作用靶点。与miR-NC组相比,miR-34c-5p组PAICS mRNA和PAICS蛋白表达水平明显下降(P均<0.05)。miR-34c-5p抑制PAICS的表达,促进LUAD细胞增殖、迁移、侵袭的能力。结论miR-34c-5p通过靶向结合PAICS促进LUAD细胞增殖、迁移和侵袭,从而促进LUAD的发展进程。

circDLGAP4及miR-34c在帕金森病患者血清中的表达及临床意义

目的:探讨环状RNA-DLGAP4(circular RNA-DLGAP4,circDLGAP4)及微小RNA-34c(microRNA-34c,miR-34c)在帕金森病(Parkinson′s disease,PD)患者血清中的表达及其对疾病的诊断价值。方法:选取2019年1月至2021年1月我院收治的72例PD患者作为PD组,并根据Hoehn-Yahr分级对PD患者进行分组。另选取同期在我院体检的健康志愿者75例作为对照组。通过实时荧光定量PCR检测两组受试者血清circDLGAP4及miR-34c的相对表达量,并通过统一帕金森病评定量表(UPDRS)统计PD患者UPDRSⅠ、UPDRSⅡ及UPDRSⅢ评分。通过Pearson相关性、受试者工作特征(ROC)曲线分析circDLGAP4及miR-34c在PD中的诊断价值。结果:PD组患者血清circDLGAP4和miR-34c表达水平低于对照组(P<0.05)。中度组PD患者血清circDLGAP4和miR-34c表达水平较轻度组更低(P<0.05);重度组PD患者血清circDLGAP4和miR-34c表达水平较中度组更低(P<0.05)。PD患者血清circDLGAP4和miR-34c表达水平与UPDRSⅡ评分、UPDRSⅢ评分、Hoehn-Yahr分级呈负相关(P<0.05)。血清circDLGAP4、miR-34c联合检测对PD的诊断效能更高。结论:circDLGAP4及miR-34c可作为诊断PD的分子标志物。

上调miR-34c抑制胶质瘤细胞的迁移及侵袭

目的研究miR-34c对人脑胶质瘤细胞株U251和U87的迁移和侵袭的影响。方法应用脂质体将miR-34c导入胶质瘤细胞株U251和U87后,应用定量PCR验证转染效果,应用Transwell小室检测细胞迁移、侵袭能力变化。结果在U87和U251细胞系中,miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量要明显小于正常胶质细胞系HEB。而转染了miR-34c-3p的U87和U251细胞,其miR-34c-3p的表达量明显高于未转染组的细胞(Normal组,P<0.05)和NC组细胞(P<0.05),miR-34c-5p也呈同样的变化。利用Transwell小室,U251细胞转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后,其迁移至下室的细胞数量与Normal组和NC组比较显著减少,在U87细胞中的情况相同。结论转染上调miR-34c在胶质瘤中的表达能够抑制其迁移和侵袭能力,为脑胶质瘤靶向治疗提供可靠的依据。

UVB诱导下早衰人皮肤成纤维细胞中miR-34c及SIRT1表达的研究

目的:运用反复亚毒性剂量紫外线B(ultraviolet B,UVB)辐射人皮肤成纤维细胞,构建应激诱导早衰(stress-inducedpremature senescence,SIPS)模型,观察衰老相关生物学标志、衰老相关基因信号分子p53、p21、p16、沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin1,SIRT1)以及miR-34c的表达情况。方法:体外培养人皮肤成纤维细胞,予连续5次、每次剂量10 mJ/cm2的UVB辐射,细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测衰老细胞,流式细胞术检测细胞周期阻滞情况,实时荧光定量PCR检测miR-34c及衰老相关基因p53、p21、p16、SIRT1 mRNA表达水平变化,Western blot检测p53、p21、p16及SIRT1蛋白水平表达。结果:与对照组相比,SIPS组细胞SA-β-Gal染色呈强阳性[对照组(8.13±1.92)%,SIPS组(94.72±2.08)%,P<0.05];多数细胞阻滞于G1期[对照组(52.96±1.76)%,SIPS组(77.31±2.05)%,P<0.05];另外,实时荧光定量PCR显示miR-34c mRNA的表达升高(miR-34c-3p、miR-34c-5p分别为对照组0.93±0.09、1.03±0.03,SIPS组2.08±0.19、12.28±1.64,P<0.05);衰老相关基因p53、p21、p16、SIRT1 mRNA的表达亦升高(对照组分别为0.74±0.23、1.06±0.23、0.86±0.13、0.74±0.25;SIPS组分别为1.84±0.55、20.25±2.34、16.7±3.94、2.15±0.22,P<0.05);Western bolt表明p53、p21、p16及SIRT1蛋白水平表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-34c在反复多次亚毒性剂量UVB辐射人皮肤成纤维细胞后表达升高,对p53起正反馈调节作用,而SIRT1并未受miR-34c的抑制。

miR-34c在急性脑梗死患者血清中的表达

目的研究miR-34c在急性脑梗死患者外周血中表达水平,评估及对急性脑梗死患者炎症反应和神经功能缺损程度的价值。方法以20例急性脑梗死患者作为梗死组,同时选取20例健康体检者作为正常组,通过对两组研究对象外周血miR-34c表达水平及与尿酸,LDL-C,C反应蛋白和入院时神经功能缺损程度进行比较,评价miR-34c的临床意义。结果和正常组对比,梗死组外周血炎症反应指标尿酸、LDL-C、C反应蛋白具有统计学差异(P<0.05),此外,miR-34c在梗死组外周血表达水平较正常组显著下降(P<0.05);而且miR-34c与尿酸,LDL-C,C反应蛋白,入院时神经功能缺损程度均为负相关关系(P<0.05)。结论急性脑梗死患者外周血miR-34c表达水平变化可以作为评估炎症反应和神经功能缺损程度的重要指标。

miR-9和miR-34c在老年痴呆患者血清中的表达及临床意义

目的研究miR-9和miR-34c在老年痴呆患者血清中的表达水平,分析其对老年痴呆的诊断价值。方法以本院接收诊治的73例老年痴呆患者为研究对象,同时选取70例将健康体检者作为正常组,采用RTq PCR检测所有研究者血清中miR-9和miR-34c的水平,采用临床痴呆评定量表(CDR)对老年痴呆患者进行认知能力评分,观察其诊断老年痴呆的灵敏度与特异度。结果与正常组相比,老年痴呆患者血清HDL-C、LDL-C、Hcy、ANP水平以及MMSE评分方面均差异显著(P <0. 05),miR-9表达水平明显下降(P <0. 01),miR-34c表达水平明显上升(P <0. 01)。依据CDR评分,痴呆程度越严重,miR-9水平越低,miR-34c水平越高。老年痴呆患者血清中miR-9与LDL-C和Hcy水平均呈负相关,与HDL-C、ANP水平以及MMSE评分均呈正相关; miR-34c与血清LDL-C和Hcy水平均呈正相关,与HDL-C、ANP水平以及MMSE评分均呈负相关。ROC分析表明,miR-9和miR-34c的AUC面积分别为0. 811、0. 819;敏感度分别为89. 58%、91. 67%;特异度分别为80. 00%、71. 11%;截断值分别为0. 87、1. 14。结论老年痴呆患者血清miR-9表达下调,而miR-34c表达上调,二者异常表达均与老年呆发生及发展过程有关,可作为临床诊断和病情监测的重要指标。

MiR-34c在奶山羊雄性生殖干细胞增殖分化中的作用

microRNA(miRNA)在奶山羊雄性生殖细胞和精子发生过程有重要的调控功能。为研究miR-34c对雄性生殖干细胞增殖与分化中的作用,本文利用视黄酸效应基因8(Stra8)在雄性生殖细胞中随年龄增长,以其表达量上调的表达特征为指针,使用实时定量PCR技术筛选分析miRNAs。结果发现,miR-34c与Stra8的表达规律基本一致。在无精症奶山羊的睾丸组织中,发现miR-34c在无精症奶山羊睾丸组织中表达缺失。利用miR-34c模拟物及抑制剂转染奶山羊雄性生殖干细胞,体外转染miR-34c模拟物及其抑制剂,发现miR-34c能够下调Rarg、Stra8与c-Myc基因的表达,减缓奶山羊雄性生殖干细胞的增殖。结果提示,miR-34c可能具有调控奶山羊雄性生殖干细胞的减数分裂的作用,同时抑制其增殖。

miR-34c对Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-B细胞生长和凋亡的影响

目的:研究miR-34c对Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-B细胞的生长及凋亡的影响。方法:用hsa-miR-34c mimics转染HEC-1-B细胞。流式细胞技术测定细胞转染率,实时荧光定量PCR验证转染后miR-34c的表达。CCK-8检测细胞增殖能力的改变。细胞克隆形成实验观察miR-34c对细胞生长的长期抑制。流式细胞技术测细胞凋亡。结果:细胞转染率为81.16%。相对于对照组,转染后实验组miR-34c表达明显增加,细胞增殖、克隆形成能力减弱,凋亡增加(P<0.05)。结论:miR-34c能明显抑制Ⅱ型子宫内膜癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,是Ⅱ型子宫内膜癌的潜在抑癌基因。

miR-34c对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮纤毛细胞分化的影响

目的探讨miR-34c对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP)鼻上皮纤毛细胞分化的影响及其调控机制。方法获取正常对照及CRSwNP患者的鼻上皮细胞,real-time PCR检测miR-34c的表达,免疫细胞化学检测纤毛细胞数量。建立鼻上皮细胞气液界面培养体系,敲低表达miR-34c后免疫荧光检测纤毛标记物β-tubulinⅣ的表达。采用IL-13刺激鼻上皮细胞,real-time PCR检测miR-34c和纤毛发生转录因子FOXJ1的表达。结果与正常对照鼻上皮细胞相比,CRSwNP鼻上皮中miR-34c表达量降低(正常对照13.43±10.31 vs CRSwNP 5.53±2.56,P<0.05),纤毛细胞百分比也有明显下调(正常对照18.20%±2.52%vs CRSwNP 12.58%±2.06%,P<0.05)。在鼻上皮细胞中敲低表达miR-34c后,纤毛细胞数量明显降低。IL-13刺激可以明显降低miR-34c(刺激前5.85±4.54 vs刺激后0.43±0.40,P<0.05)和FOXJ1(刺激前1.41±1.09 vs刺激后0.15±0.19,P<0.05)的表达量。结论IL-13可以通过调控miR-34c表达进而调控纤毛细胞分化,从而参与CRSwNP黏液纤毛功能障碍。

膀胱移行细胞癌中miR-34c的表达及其临床意义

【目的】探讨MicroRNA-34c(miR-34c)在膀胱移行细胞癌中的表达及其在膀胱癌发生、发展中的意义。【方法】运用荧光定量real-time PCR检测miR-34c在膀胱癌组织中及癌周非瘤组织的表达水平,采用2-△△Ct算法计算膀胱癌组织与癌周非瘤组织中miR-34c表达量的比值,结合术后病理参数,运用统计学方法分析miR-34c与临床病理资料之间的相关性。【结果】在人膀胱癌组织中发现miR-34c较其相应周围非瘤组织明显低表达。在26例膀胱癌组织中,16例(61.9%)miR-34c显著低表达。miR-34c的低表达与肿瘤大小和恶性程度显著相关。肿瘤越大、恶性程度越高,miR-34c的表达量越低。【结论】低表达miR-34c可能是膀胱移行细胞癌组织的重要特征,并参与膀胱癌的生物学进程,可能对膀胱癌的诊断及防治提供新的思路。

丙戊酸钠通过激活miR-34c-5p/ATG4B信号通路抑制SH-SY5Y细胞自噬

目的探讨丙戊酸钠(VPA)对SH-SY5Y细胞中miR-34c-5p/ATG4B信号通路的激活作用及对自噬的影响。方法人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含10%胎牛血清的DMEM培养基常规培养,然后使用不同剂量VPA处理SH-SY5Y细胞24 h,采用定量PCR分析VPA处理对ATG4B m RNA与miR-34c-5p表达的影响,免疫印迹法分析VPA处理对ATG4B蛋白表达的影响,将含ATG4B启动子片段的报告质粒转染SH-SY5Y细胞,然后通过荧光素酶报告基因系统分析VPA处理对ATG4B启动子活性的影响,用VPA单独或联合转录抑制剂放线菌素D分别处理SH-SY5Y细胞不同时间,定量PCR分析检测不同处理对ATG4B mRNA稳定性的影响,用VPA单独或联合miR-34c-5p抑制剂处理细胞24 h,通过检测不同处理对ATG4B表达变化的影响,进而判断miR-34c-5p在VPA下调ATG4B表达中的作用,同时通过Western blot检测不同处理对LC3-II表达的影响,分析细胞自噬水平变化。结果 VPA可剂量依赖性降低SH-SY5Y细胞中ATG4B的mRNA和蛋白水平(P<0.05)。VPA处理不影响SHSY5Y细胞中ATG4B的启动子活性(P>0.05),但显著下调其mRNA的稳定性(P<0.05)。同时,VPA处理明显增强SH-SY5Y细胞中miR-34c-5p的表达水平(P<0.05)。使用miR-34c-5p抑制剂与VPA联合处理SH-SY5Y细胞,可逆转VPA对ATG4B表达的下调作用。VPA处理还下调了SH-SY5Y细胞中LC3-II的表达水平(P<0.05)。结论 VPA可能通过激活miR-34c-5p/ATG4B信号通路而抑制SH-SY5Y细胞自噬。

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示:miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。

miR-34c在哺乳动物生殖发育过程中的功能探讨

miRNA是对基因转录后调控有重要作用的非编码RNA,其中miR-34c被证实在哺乳动物精卵都有表达,且在精子成熟及合子卵裂中有重要作用,其已有报道的作用靶点如Bcl-2、Fox O3a、Myc、TGIF2和Notch2多与细胞凋亡或与哺乳动物繁殖性状相关。本文拟就miR-34c在哺乳动物生殖发育中可能的生物学功能进行探讨。

敲低miR-34c-5p抑制低氧诱导的大鼠骨髓间充质干细胞的凋亡

目的探讨敲低miR-34c-5p对提高骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)存活率的作用。方法将大鼠BM-MSCs分为常氧组(normoxia组)、低氧组(hypoxia组)、常氧抑制剂阴性对照组(normoxia inhibitor NC组)、低氧抑制剂阴性对照组(hypoxia inhibitor NC组)、常氧微RNA(miR)抑制剂组(normoxia miR inhibitor组)和低氧miR抑制剂组(hypoxia inhibitor miR组);Lipofectamine2000将miR-34c-5p inhibitor转染至BM-MSCs细胞;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和ELISA检测miR-34c-5p、IGF、HGF、bFGF和VEGF表达;流式细胞测量术和TUNEL检测细胞凋亡,Western blot检测cleaved caspase-3,-9,Bcl-2和Bax蛋白水平;生化试剂盒检测ATP/ADP。流式细胞测量术检测细胞摄取葡萄糖能力。结果与hypoxia inhibitor NC组相比,敲低miR-34c-5p可明显抑制MSCs凋亡(P<0.01),显著降低cleaved caspase-3,-9和Bax蛋白表达,提高Bcl-2蛋白表达(P<0.01);IGF、HGF、bFGF和VEGF表达显著升高(P<0.05,P<0.01);ATP/ADP比率和细胞摄取葡萄糖的能力显著提高(P<0.05,P<0.01)。结论敲低miR-34c-5p可抑制低氧诱导的大鼠BM-MSCs的凋亡。