CircAGFG1通过miR-375/USP22轴调节食管鳞癌细胞的放射敏感性研究

目的研究环状带有FG重复序列1(CircAGFG1)通过miR-375/泛素特异性蛋白酶22(USP22)轴对食管鳞癌(ESCC)细胞放射敏感性的影响。方法采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测人ESCC细胞株KYSE150及人ESCC放射性抵抗细胞KYSE150-R中CircAGFG1、miR-375、USP22表达。将体外培养的KYSE150-R细胞随机分为对照组、辐照组、辐照+阴性对照组、辐照+CircAGFG1敲低组、辐照+CircAGFG1敲低+miR-375 inhibitor组,分组转染后,4Gy 6MV-X线辐照后24 h采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测各组KYSE150-R细胞中CircAGFG1、miR-375、USP22表达;采用CCK-8法和平板集落形成实验检测各组KYSE150-R细胞增殖;采用流式细胞术检测各组KYSE150-R细胞凋亡;采用免疫荧光染色检测各组KYSE150-R细胞凋亡相关蛋白Bax与Bcl-2比值(Bax/Bcl-2)。将各组细胞接种在裸鼠右后肢腋下来构建ESCC移植瘤模型,饲养3周后检测各组裸鼠肿瘤体积及重量。采用双荧光素酶报告基因实验检测KYSE150-R中CircAGFG1对miR-375的靶向调节与miR-375对USP22的靶向调节。结果与KYSE150细胞相比,KYSE150-R细胞中CircAGFG1 mRNA表达、USP22 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05),miR-375 mRNA表达降低(P<0.05)。与对照组相比,辐照+CircAGFG1敲低组CircAGFG1 mRNA表达、USP22 mRNA及蛋白表达、细胞增殖率、集落生成率、裸鼠肿瘤体积与肿瘤重量降低(P<0.05),细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、miR-375 mRNA表达升高(P<0.05);辐照组、辐照+阴性对照组细胞各指标比较无明显差异(P>0.05)。与辐照组相比,辐照+CircAGFG1敲低组CircAGFG1 mRNA、USP22 mRNA及蛋白表达、细胞增殖率、集落生成率、裸鼠肿瘤体积与肿瘤重量降低(P<0.05),细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、miR-375 mRNA表达升高(P<0.05)。与辐照+CircAGFG1敲低组相比,辐照+CircAGFG1敲低+miR-375 inhibitor组USP22 mRNA及蛋白表达、细胞增殖率、集落生成率、裸鼠肿瘤体积与肿瘤重量升高(P<0.05),细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、miR-375 mRNA表达降低(P<0.05);辐照+阴性对照组与对照组细胞各指标无明显变化(P>0.05)。CircAGFG1可靶向下调KYSE150-R细胞miR-375表达,而miR-375可靶向下调KYSE150-R细胞USP22表达。结论敲低CircAGFG1可通过上调miR-375来减弱USP22表达,从而增强ESCC细胞的放射敏感性,提升放射性对ESCC细胞的杀伤力,并促使其凋亡。

miR-365靶向调控USP22促进大肠癌细胞组蛋白修饰和EMT

目的探讨miR-365对大肠癌细胞组蛋白修饰和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其机制。方法采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测大肠癌细胞株(高转移细胞系HCT-116、LoVo和中低转移细胞系SW480)中miR-365 mRNA表达量。通过转染miRNA模拟物、抑制物构建miR-365过表达和敲低模型,SW480细胞分为miR-365模拟物组、miR-365抑制物组和NC组;采用RT-PCR检测miR-365和特异性泛素肽酶22(ubiquitin-specific peptidase 22,USP22)mRNA表达水平;采用双荧光素酶报告基因检测miR-365与USP22的相互作用;Western blot法检测Vimentin、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达水平;采用斑点杂交法检测H2A和H2B蛋白泛素化修饰;采用Transwell法检测各组细胞迁移情况,细胞划痕实验检测细胞转移能力。结果HCT-116和LoVo细胞系的miR-365 mRNA表达量显著低于SW480细胞系(P<0.05)。与NC组比较,miR-365抑制物组miR-365 mRNA的表达显著降低,而miR-365模拟物组则升高(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染后miR-NC+USP22-wt组荧光素酶活性明显高于miR-365+USP22-wt组(P<0.05);而miR-365+USP22-mut组和miR-NC+USP22-mut组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR法检测结果显示,与NC组比较,miR-365抑制物组SW480细胞中USP22 mRNA的表达量显著升高,而miR-365模拟物组则降低(P<0.05)。斑点杂交法结果显示,与NC组比较,miR-365抑制物组H2AK119ub表达量显著升高,而miR-365模拟物组则降低(P<0.05);与NC组比较,miR-365抑制物组H2BK120ub表达量显著升高,而miR-365模拟物组则降低(P<0.05)。Western blot结果显示,与NC组比较,miR-365抑制物组SW480细胞中N-cadherin蛋白表达量显著降低,而miR-365模拟物组则升高(P<0.05);与NC组比较,miR-365抑制物组SW480细胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表达量显著升高,而miR-365模拟物组则降低(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,与NC组和miR-365模拟物组比较,miR-365抑制物组愈合率明显升高(P<0.05);视野下miR-365抑制物组SW480细胞穿模数量明显高于NC组和miR-365模拟物组(P<0.05)。结论miR-365可通过靶向调控USP22的表达,继而调节组蛋白泛素化修饰,诱导上皮-间质转化的发生,最终引起大肠癌细胞转移。

地西他滨联合CAG方案治疗复发急性髓细胞白血病患者的疗效及对miR-34b、USP22表达的影响

目的探讨地西他滨联合CAG方案治疗复发急性髓细胞白血病(AML)患者的疗效及对microRNA-34b(miR-34b)、特异性泛素蛋白酶22(USP22)表达的影响。方法将30例复发AML患者按照随机数字表法分为治疗组和对照组,各15例,分别采用地西他滨联合CAG方案、CAG方案。比较两组的总缓解率(ORR)、miR-34b和USP22的表达,随访观察两组患者的生存率,采用Kaplan-Meier法分析中位总生存(OS)期,分析miR-34b和USP22的表达与预后的相关性。结果治疗组ORR显著高于对照组(66.67%vs.26.67%,P<0.05)。治疗组化疗后miR-34b蛋白表达升高,USP22蛋白表达降低,且与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。随访24~36个月,治疗组和对照组生存率分别为53.3%、33.3%(P>0.05)。治疗组中位OS期为9.53个月(95%CI:7.94~11.11),显著高于对照组6.57个月(95%CI:5.21~7.92)(P<0.05)。与存活组比较,死亡组化疗后miR-34b蛋白表达明显降低,USP22蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论地西他滨联合CAG方案治疗复发AML患者,可能通过调控miR-34b及其下游靶基因USP22的表达,有效提高缓解率,延长生存期,改善预后。

miR-30a-5p调控USP22对MPP^(+)诱导的SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-30a-5p对1甲基4苯基吡啶(MPP^(+))诱导的人神经母细胞瘤(SK-N-SH)细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法体外培养SK-N-SH细胞,分为对照组(NC组)、MPP^(+)组(1 mmol/L MPP^(+)作用细胞24 h)、MPP^(+)+miR-30a-5p组(1 mmol/L MPP^(+)作用转染miR-30a-5p模拟物的细胞24 h)、MPP^(+)+miR NC组(1 mmol/L MPP^(+)作用转染模拟物阴性对照序列的细胞24 h)、MPP^(+)+siUSP22组(1 mmol/L MPP^(+)作用转染USP22小干扰RNA的细胞24 h)、MPP^(+)+si-NC组(1 mmol/L MPP^(+)作用转染乱序无意义阴性序列的细胞24 h)、MPP^(+)+miR-30a-5p+pcDNA USP22组(1 mmol/L MPP^(+)作用共转染miR-30a-5p模拟物与USP22过表达载体的细胞24 h)和MPP^(+)+miR-30a-5p+pcDNA NC组(1 mmol/L MPP^(+)作用共转染miR-30a-5p模拟物与空载体的细胞24 h),实时荧光定量PCR(RTqPCR)检测各组细胞中miR-30a-5p和USP22 mRNA表达水平,蛋白印迹(Western Blot)法检测各组细胞中USP22蛋白表达水平,细胞计数试剂盒8(CCK8)检测各组细胞存活率,流式细胞仪检测组各组细胞凋亡率,Western Blot检测各组细胞中细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-30a-5p与USP22靶向调控关系。结果与NC组比较,MPP^(+)组细胞中miR30a 5p表达水平显著降低(P<0.05),USP22的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与MPP^(+)+miRNC组比较,MPP^(+)+miR-30a-5p组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与MPP^(+)+siNC组比较,MPP^(+)+siUSP22组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。与MPP^(+)+miR-30a-5p+pcDNA NC组比较,MPP^(+)+miR 30a5p+pcDNA USP22组细胞存活率和CyclinD1蛋白表达水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率和Cleaved caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。miR-30a-5p在SK-N-SH细胞中靶向负调控USP22表达。结论上调miR-30a-5p表达可促进MPP^(+)诱导的SK-N-SH细胞增殖,并抑制细胞凋亡,其作用机制与下调细胞中USP22表达有关。

血浆外泌体源性miR-335-5p可作为三阴性乳腺癌诊断指标并抑制免疫逃逸

目的本研究旨在探究血浆外泌体源性miR-335-5p调控泛素特异性蛋白酶22(USP22)对三阴性乳腺癌(TNBC)免疫逃逸的影响。方法收集TNBC患者血浆与健康人血浆,之后分离血浆外泌体,实时定量PCR检测外泌体中miR-335-5p的相对表达。双荧光素酶报告实验验证miR-335-5p与USP22的相互作用。调节外泌体、MDA-MB-436细胞中miR-335-5p与USP22的表达,将其与CD8^(+)T淋巴细胞共培养并将其分为不同组。流式细胞术检测各组细胞中细胞凋亡情况,ELISA检测各组细胞γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的水平。Western blot法检测细胞中USP22对程序性死亡蛋白1配体1(PD-L1)稳定性的影响。裸鼠成瘤实验检测miR-335-5p与PD-L1在体内对肿瘤生长的影响。结果TNBC外泌体样本中miR-335-5p的表达下调。USP22被证实为miR-335-5p的一个靶基因,此外,USP22可以抑制PD-L1蛋白泛素化。过表达miR-335-5p能抑制TNBC的免疫逃逸。抑制miR-335-5p可以促进TNBC的免疫逃逸,该作用可以通过下调USP22得到部分挽救。敲低miR-335-5p能促进体内肿瘤生长,加入PD-L1抗体后肿瘤生长被抑制。结论外泌体源性miR-335-5p通过下调USP22,促进USP22对PD-L1的泛素化,并抑制PD-L1介导的TNBC免疫逃逸。

miR-34b调控去泛素化酶USP22在急性髓细胞白血病细胞HL60中的生物学作用

目的研究miR-34b调控其靶基因USP22分子机制及其在急性髓细胞白血病细胞HL60中的生物学效应。方法荧光定量PCR (qPCR)检测miR-34b、USP22转录水平;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测USP22、Bax、Bcl-2蛋白表达水平;急性髓细胞白血病HL60细胞中过表达、抑制miR-34b或干扰USP22后,CCK-8及AnneximV分别检测细胞增殖活性及凋亡变化。双荧光素酶报告基因系统证实miR-34b与USP22的3,非编码区(3-UTR)相互作用。结果 miR-34b在白血病细胞HL60中表达下调,为外周血健康对照单个核细胞的0. 46 ±0. 07倍(P<0.01)。与对照细胞相比,在HL60细胞中过表达miR-34b或抑制miR-34b后,细胞相对活性分别出现减低或增强现象(P<0.01)。miR-34b在HL60中过表达后,凋亡细胞(29.91 ±1. 14)%较对照细胞(8.77 ±0. 23)%增加了 2.41倍(P<0.01), Western印迹检测证实了促凋亡分子Bax及抑制凋亡分子Bcl-2在miR-34b过表达后分别出现了上调及下调现象。利用在线预测软件预测USP22可能是miR-34b直接调控基因。在HL60细胞中过表达或抑制miR-34b后,USP22转录水平及蛋白表达水平均不同程度上调及下调(P<0.01)。双荧光素酶报告基因系统证实miR-34b过表达后,USP22野生型的3-UTR较对照组显著下调(P<0.01),而突变型无显著改变。进一步敲减USP22后HL60细胞增殖活性减低,并诱导细胞凋亡。结论 miR-34b对白血病细胞HL60的抑癌活性可部分通过抑制USP22得以实现;同时过表达miR-34b或抑制USP22表达有望成为急性髓细胞白血病的诊治靶点。

九香虫水提液通过miR-1287-5p/泛素特异性肽酶22通路调控非小细胞肺癌增殖、侵袭和迁移的分子机制

将九香虫水提液用于非小细胞肺癌的治疗,探讨九香虫水提液对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的调控机制。用九香虫水提取液(44、66、99 mg/L)处理A549细胞,筛选最适浓度99 mg/L。用脂质体法将miR-NC组(转染miR-NC)、miR-1287-5p组(转染miR-1287-5p mimics)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、antimiR-1287-5p组(转染anti-miR-1287-5p)、Jiuxiang aqueous extract+anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC用99 mg/L九香虫水提取液处理)、Jiuxiang aqueous extract+anti-miR-1287-5p组(转染anti-miR-1287-5p用99 mg/L九香虫水提取液处理)转染至A549细胞;噻唑蓝(MTT)法、迁移实验(Transwell)小室、免疫印迹(Western blot)实验、实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞的抑制率、迁移侵袭、细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin D1)、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子1A(p21)、基质金属蛋白酶(MMP) 2、MMP-9、干扰泛素特异肽酶(USP22)、miR-1287-5p的表达;双荧光素酶报告基因实验检测细胞的荧光活性。九香虫水提取液呈浓度依赖性显著提高A549细胞的抑制率,抑制细胞的迁移和侵袭,下调Cyclin D1、MMP-2、MMP-9,上调p21(P<0.05)。九香虫水提取液呈浓度依赖性显著上调miR-1287-5p的表达,下调USP22表达,并且过表达miR-1287-5p能够抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,下调Cyclin D1、MMP-2、MMP-9,上调p21,而抑制miR-1287-5p可逆转九香虫水提取液对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,并上调Cyclin D1、MMP-2、MMP-9,下调p21。此外,miR-1287-5p明显的抑制野生型USP22的A549细胞荧光活性。九香虫水提取液可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,其机制与上调miR-1287-5p进而靶向抑制USP22相关,可为九香虫水提取液治疗非小细胞肺癌提供支持。