幽门螺杆菌诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化

目的:探讨幽门螺杆菌(H.pylori)诱导的人胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响及机制,为进一步阐明H.pylori的致癌机制提供新线索。方法:超高速离心法和试剂盒提取H.pylori刺激组和对照组AGS细胞释放的外泌体,采用透射电镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)和Western blot对外泌体进行鉴定;qRT-PCR检测H.pylori诱导的胃癌细胞AGS源性外泌体中miR-382-5p表达;将miR-382-5p mimic转染至THP-1巨噬细胞,Western blot检测巨噬细胞自噬标志物LC3Ⅱ、P62、Beclin-1的表达,免疫荧光检测自噬小体数量;Western blot检测PTEN蛋白、其下游蛋白PI3K、AKT、mTOR及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达水平;流式细胞术检测巨噬细胞表型分子CD206和HLA-DR表达水平;ELISA检测巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-10和精氨酸酶1表达水平。结果:提取的外泌体符合外泌体形态,且高表达其表面标志蛋白CD9、CD63、TSG101;与空白对照组相比,H.pylori感染组AGS源性外泌体中miR-382-5p表达显著升高;miR-382-5p mimic转染导致巨噬细胞LC3、Beclin-1表达降低,P62表达升高,自噬小体数量降低;PTEN蛋白表达降低,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达明显增加。转染同时导致巨噬细胞M2型标志蛋白CD206表达增加,M1型标志蛋白HLA-DR表达降低;IL-10和精氨酸酶1表达增加,IL-6和TNF-α表达降低。抑制剂BEZ235预处理可部分逆转miR-382-5p对巨噬细胞自噬和极化的影响。结论:H.pylori诱导的胃癌细胞源性外泌体miR-382-5p通过靶向PTEN基因,激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制巨噬细胞自噬并促进其M2极化。

血清miR-382-5p在丙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者中的表达及其临床价值

目的探讨血清miR-382-5p在丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)相关肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者中的表达及其联合甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)、异常凝血酶原-Ⅱ(protein induced by vitamin K antagonist-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)对HCC诊断的价值。方法选取2019年1月至2022年3月保定市人民医院收治的102例HCV相关HCC患者(HCC组)、55例肝硬化患者(肝硬化组)和45例体检正常者(对照组)为研究对象,比较各组血清miR-382-5p、AFP及PIVKA-Ⅱ水平,比较不同临床特征HCC患者血清miR-382-5p的表达水平。应用受试者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)曲线分析血清miR-382-5p、AFP及PIVKA-Ⅱ水平对HCC的诊断价值。采用Pearson相关分析HCC患者血清miR-382-5p表达水平与AFP及PIVKA-Ⅱ的相关性。结果HCC组血清miR-382-5p(6.83±2.51比3.15±1.08比1.82±0.76)、AFP[(527.10±73.26)μg/L比(22.84±9.25)μg/L比(3.17±0.36)μg/L]及PIVKA-Ⅱ[(352.64±69.12)mAU/ml比(21.73±6.90)mAU/ml比(18.30±4.27)mAU/ml]水平均显著高于肝硬化组和对照组(P均<0.05)。TNM分期Ⅲ~Ⅳ期(8.70±3.51比5.06±1.80)、Child-Pugh分级C级(8.14±2.90比5.62±1.91)、低分化(7.68±2.70比6.11±2.08)、门静脉癌栓(7.74±2.73比6.04±2.01)及远处转移(8.06±2.84比5.71±1.95)的HCC患者血清miR-382-5p表达水平显著升高(P均<0.05)。miR-382-5p、AFP及PIVKA-Ⅱ三项联合诊断HCC的ROC曲线下面积最大(0.980,95%CI:0.918~0.997),其敏感度最高(98.5%)。相关分析显示,HCC患者血清miR-382-5p水平与AFP(r=0.795,P<0.001)和PIVKA-Ⅱ(r=0.866,P<0.001)均呈正相关。结论血清miR-382-5p水平在HCV相关HCC患者中显著升高,联合AFP及PIVKA-Ⅱ检测可提高HCC的诊断价值。

miR-382-5p、PCT、SAA、CRP与早产儿肺部疾病相关性研究

目的探究血清miR-382-5p、降钙素原(PCT)、淀粉样蛋白A(SAA)和C反应蛋白(CRP)与早产儿肺部疾病相关性研究。方法选取2016年1月至2021年1月入住保定市第一中心医院的157例早产儿作为研究对象,其中无肺部疾病的新生儿38例(对照组),有肺部疾病的新生儿119例,并将患有肺部疾病的新生儿分为新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)组(39例)、支气管肺发育不良(BPD)组(40例)、肺动脉高压(PPHN)组(40例),Pearson法分析miR-382-5p与PCT、SAA和CRP水平的相关性,Logistic回归分析早产儿患肺部疾病的影响因素,受试者工作特征(ROC)曲线分析miR-382-5p的诊断价值。结果与对照组比较,NRDS、BPD、PPHN组患儿血清miR-382-5p表达水平均显著降低,而PCT、SAA和CRP水平均显著上升,差异具有统计学意义(F值分别为216.047、83.917、183.164、124.093,P<0.05);Pearson相关分析显示miR-382-5p表达水平与PCT、SAA和CRP水平均呈负相关(r值介于-0.583~-0.450之间,P<0.05);Logistic回归分析显示低表达miR-382-5p,PCT、SAA、CRP高水平及低出生体重均是早产儿患肺部疾病的独立危险因素(OR值分别为4.301、1.243、7.247、3.421、3.469,P<0.05);ROC分析显示血清miR-382-5p的曲线下面积为0.858,敏感度和特异度分别为90.42%和85.63%。结论miR-382-5p在患肺部疾病的早产儿血清中低表达,PCT、SAA、CRP高表达,均与早产儿肺部疾病相关,可作为辅助早产儿肺部疾病诊断的标志物。

非小细胞肺癌组织中LINC00707、miR-382-5p表达及其与患者预后的关系

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中非编码RNA 00707(LINC00707)、微小RNA-382-5p(miR-382-5p)表达及其与患者预后的关系。方法:选取本院2018年2月至2020年2月收治的127例NSCLC患者术中留取的NSCLC组织和癌旁组织标本。采用Pearson法分析NSCLC组织LINC00707与miR-382-5p表达的相关性;采用Kaplan-Meier法分析NSCLC组织LINC00707、miR-382-5p表达与患者预后关系;采用多因素Cox回归分析NSCLC患者预后的影响因素。结果:与癌旁组织相比,NSCLC组织中LINC00707表达水平较高,miR-382-5p表达水平较低(P<0.05);NSCLC组织中LINC00707与miR-382-5p表达水平呈负相关(r=-0.692,P<0.05);不同年龄、性别、肿瘤直径、浸润深度、组织学分类的NSCLC患者LINC00707、miR-382-5p表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05),而TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、淋巴结发生转移、分化程度为低分化的患者NSCLC组织中LINC00707呈现高表达水平,miR-382-5p则呈现出低表达水平(P<0.05);LINC00707低表达患者3年生存率(27/63,42.86%)高于LINC00707高表达患者(18/64,28.13%)(χ^(2)=5.123,P=0.024),miR-382-5p高表达患者3年生存率(28/64,43.75%)高于miR-382-5p低表达患者(17/63,26.98%)(χ^(2)=4.089,P=0.043);TNM分期、淋巴结转移、分化程度、LINC00707、miR-382-5p是NSCLC患者死亡的影响因素(P<0.05)。结论:NSCLC组织中LINC00707表达较高,miR-382-5p表达较低,二者与NSCLC患者TNM分期、淋巴结转移、分化程度等临床病理特征密切相关,同时也是影响NSCLC患者预后的敏感指标。

环状RNA circSATB2通过调控miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究

目的探讨环状RNA circSATB2通过调控miR-382-5p对肺癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究。方法采用qRT-PCR检测肺癌组织和细胞内circSATB2和miR-382-5p的表达量。将H1299细胞分为si-NC(转染si-NC)组、si-circSATB2(转染si-circSATB2)组、miR-NC(转染miR-NC)组、miR-382-5p(转染miR-382-5p)组、si-circSATB2+anti-miR-NC(共转染si-circSATB2和anti-miR-NC)组和si-circSATB2+anti-miR-382-5p(共转染si-circSATB2和anti-miR-382-5p)组;用qRT-PCR检测circSATB2和miR-382-5p的表达量;MTT实验检测细胞增殖变化;Transwell检测细胞迁移和侵袭变化;Western Blot检测Ki67、MMP9蛋白表达;双荧光素酶报告实验验证circSATB2和miR-382-5p的关系。结果与癌旁组织和BEAS-2B细胞相比,circSATB2在肺癌组织和肺癌细胞H460、H1299、A549的表达量明显增加,miR-382-5p表达量明显降低。敲低circSATB2或过表达miR-382-5p能降低细胞的OD值,减少细胞迁移数目和侵袭数目,降低Ki67、MMP9蛋白表达。circSATB2能调控miR-382-5p的表达,抑制miR-382-5p的表达可以逆转敲低circSATB2对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结论敲低circSATB2通过上调miR-382-5p的表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

lncRNA HOXC-AS1靶向miR-382-5p调控ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤实验研究

目的探讨lncRNA HOXC-AS1对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的血管内皮细胞损伤的影响及其可能作用机制。方法采用ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞HUVEC建立动脉粥样硬化模型;MTT法检测不同ox-LDL对HUVEC细胞活力的影响;pcDNA、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-382-5p、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-NC、pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p mimics分别转染至HUVEC细胞后用100 mg/L ox-LDL处理24 h;qRT-PCR法检测lncRNA HOXC-AS1、miR-382-5p的表达量;ELISA法检测IL-1β、IL-6、TNF-α的水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验检测lncRNA HOXC-AS1与miR-382-5p的靶向关系;Western blot法检测Cleaved-caspase-3蛋白表达量。结果与NC组比较,25 mg/L ox-LDL组、50 mg/L ox-LDL组、100 mg/L ox-LDL组细胞活力降低(P<0.05);ox-LDL诱导的HUVEC中lncRNA HOXC-AS1的表达量降低(P<0.05),miR-382-5p的表达量升高(P<0.05);转染pcDNA-lncRNA HOXC-AS1或转染anti-miR-382-5p后可降低ox-LDL诱导的HUVEC中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平(P<0.05),并可降低细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平(P<0.05);lncRNA HOXC-AS1可靶向调控miR-382-5p的表达;共转染pcDNA-lncRNA HOXC-AS1和miR-382-5p mimics可降低转染pcDNA-lncRNA HOXC-AS1对ox-LDL诱导的HUVEC细胞凋亡及炎性反应的抑制作用。结论lncRNA HOXC-AS1过表达可通过靶向调控miR-382-5p表达而抑制炎性反应及细胞凋亡从而减轻ox-LDL诱导的血管内皮细胞损伤。

miR-382-5p在口腔鳞状细胞癌中的表达及其对细胞侵袭迁移的影响和作用机制研究

目的研究微小RNA-382-5p(miR-382-5p)在口腔鳞状细胞癌(OSCC)中的表达水平及对肿瘤细胞侵袭迁移的影响和作用机制。方法收集2015年3月至2021年3月西安市儿童医院收治的12例OSCC患儿癌组织和癌旁正常组织,采用实时荧光定量RCR法检测miR-382-5p和张力蛋白同源基因(PTEN)表达水平。行CAL-27细胞培养,转染后行Transwell试验,以及细胞迁移侵袭试验;采用双荧光素酶试验验证结果。结果miR-382-5p抑制物组和si-NC组迁移细胞数分别为(178.25±30.29)个和(142.46±26.83)个,两组侵袭细胞数分别为(253.32±62.08)个和(202.41±54.54)个,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-382-5p和PTEN在癌组织中的相对表达水平分别为0.87±0.31和0.72±0.26,癌旁组织中相对表达水平分别为0.62±0.19和0.51±0.20,癌组织和癌旁组织miR-382-5p和PTEN相对表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。PTEN-WT+miR-NC组和PTEN-WT+miR-382-5p组荧光活性变化倍数比较,差异有统计学意义(P<0.05),PTEN-MUT-miR-NC组和PTEN-MUT-miR-382-5p组荧光活性变化倍数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-382-5p抑制物+si-NC组和miR-382-5p抑制物+si-PTEN组细胞迁移数分别为(170.45±35.56)个和(274.10±81.36)个,细胞侵袭数分别为(138.96±32.25)个和(180.04±25.63)个,两组间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论miR-382-5p在OSCC癌组织中呈高表达,miR-382-5p可通过调控PTEN水平,影响肿瘤细胞侵袭迁移。

微小RNA-382-5p(miR-382-5p)对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

目的观察微小RNA-382-5p(miR-382-5p)对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响并探讨其作用机制。方法选择乳腺癌患者86例,取患者乳腺癌组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm为观察组,同时取与乳腺癌病灶间隔5 cm以上同样大小的正常组织为对照组。行细胞培养和转染、PT-PRC检测、Western blot法检测蛋白表达、平板克隆试验、CCK-8法检测和流式细胞术。结果观察组样本miR-382-5p与对照组相比呈现显著低表达,且具有统计学差异(P<0.05),观察组转染后的MCR-7细胞miR-382-5p表达量高于对照组,且具有统计学差异(P<0.05),但观察组细胞中NF90 mRNA较对照组明显降低,且均具有统计学差异(P<0.05),细胞转染48 h后,Western blot法检测结果显示MCF-7细胞转染miR-382-5p后NF90、Bcl-2蛋白表达观察组较对照组明显下调,p53、p21、Bax观察组较对照组明显上调,Cyclin E1蛋白无明显变化。观察组患者克隆形成数低于对照组,细胞凋亡率高于对照组,且具有统计学差异(P<0.05),采用CCK法检测不同时间点MCF-7细胞生长,在细胞生长第4、5天,观察组细胞活力低于对照组,且具有统计学差异(P<0.05),细胞生长1、2、3天两组细胞活力无统计学差异(P<0.05),经过流式细胞术检查,显示MCF-7细胞转染miR-382-5p后凋亡率高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论miR-382-5p具有抑制乳腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡的作用,其基因与靶向抑制NF90基因具有相关性。

circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴调控铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移

目的探索circ0000799经miR-1287-5p/GPX4轴对铁死亡促进三阴乳腺癌脑转移的影响机制。方法检测circ0000799在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达。沉默亲代三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231和子代脑转移细胞MDA-MB-231-BM中circ0000799的表达。比较各组细胞生长、侵袭能力、脑转移结节数目。使用双荧光素酶报告基因实验验证circ0000799、miR-1287-5p、GPX4调控关系。检测circ0000799对铁死亡相关蛋白谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)表达和总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比的影响。结果与人正常乳腺上皮细胞(MCF-10A)或癌旁组织比较,circ0000799在三阴乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中上调,且在子代三阴乳腺癌细胞系及脑转移灶中上调最为显著(P<0.05)。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组细胞生长、侵袭能力降低(P<0.05)。sh-circCTR组、sh-circ0000799组、sh-circ0000799+RSL3组脑转移结节数量依次降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验显示,circ0000799可与miR-1287-5p相互作用,miR-1287-5p可与GPX4相互作用。与sh-circCTR组比较,sh-circ0000799组miR-1287-5表达增加,总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽比和GPX4表达降低(P<0.05)。与miR-CTR组比较,miR-1287-5p组GPX4 mRNA表达降低(P<0.05)。结论circ0000799在三阴乳腺癌中高表达且可能通过miR-1287-5p/GPX4轴促进三阴乳腺癌脑转移。

新风胶囊抑制软骨细胞炎症和细胞外基质降解:基于调控miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴

目的探讨新风胶囊(XFC)对白介素(IL)-1β诱导的软骨细胞功能的影响及作用机制。方法构建IL-1β诱导的软骨细胞炎症模型;SD大鼠灌胃制备XFC含药血清。细胞增殖实验(CCK-8)和流式细胞术筛选最佳XFC含药血清浓度;双荧光素酶报告分析miR-502-5p和TRAF2的靶向关系。构建miR-502-5p抑制表达质粒(inhibitor)及阴性对照组,转染至软骨细胞中。分为对照组(NC),IL-1β组,XFC组,IL-1β+NC-inhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor,IL-1β+miR-502-5pinhibitor+XFC最佳含药血清组,酶联免疫吸附试验(ELASA)检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-4、IL-10的水平。逆转录PCR(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹实验(WB)、免疫荧光法检测Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、软骨蛋白聚糖抗体(ADAMTS5)和miR-502-5p/TRAF2/NF-κB基因的表达。结果与NC组相比,IL-1β组中软骨细胞活力下降,细胞凋亡率升高,且miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降,IL-1β、TNF-α和ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高(P<0.05)。筛选得出20%XFC为最佳含药血清浓度。与IL-1β组相比,XFC含药血清干预后,软骨细胞活力升高,细胞凋亡率下降,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κBp65表达下降,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达升高(P<0.05)。与NC-inhibitor相比,转染miR-502-5p inhibitor后,IL-1β、TNF-α、ADAMTS5、MMP13、TRAF2、NF-κB p65表达升高,miR-502-5p、IL-4、IL-10和COL2A1表达下降;与miR-502-5pinhibitor相比,将miR-502-5pinhibitor转染的软骨细胞和最佳XFC含药血清共培养后,XFC含药血清能逆转miR-502-5p抑制状态对软骨细胞炎症和ECM的影响。结论XFC抑制软骨细胞炎症、细胞外基质降解,减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤,其机制可能是通过调节miR-502-5p/TRAF2/NF-κB轴。

circLRP6调节miR-31-5p/HMGA1轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的分析circLRP6调节miR-31-5p/高迁移率族蛋白A1(HMGA1)轴对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响。方法体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组,对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养,并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内,实时定量PCR测定细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1 mRNA水平,试剂盒测定细胞上清液白细胞介素-6(IL-6)水平、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平、乳酸脱氢酶(LDH)活性以及丙二醛(MDA)含量;流式细胞仪观察细胞凋亡;Western blotting测定细胞HMGA1、Bax、Bcl-2蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验分析miR-31-5p与circLRP6、HMGA1的靶向关系。结果与对照组相比,高糖组HK-2细胞circLRP6水平升高,细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖组相比,高糖+si-circLRP6组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低(均P<0.05);与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比,高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、IL-6、TNF-α、LDH、MDA、细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高(均P<0.05)。miR-31-5p与circLRP6、HMGA1均具有靶向关系。结论沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p,抑制HMGA1表达,对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。

circFAT1调节miR-211-5p/CCND2轴对糖尿病心肌病大鼠心肌损伤的影响

目的探讨circFAT1对糖尿病心肌病(DCM)大鼠心肌损伤的影响及对miR-211-5p/细胞周期蛋白D2(CCND2)轴的调节机制。方法利用高糖高脂饲料联合链脲佐菌素建立DCM大鼠模型,并随机分为DCM组、circ-NC组、circFAT1组、circFAT1+激动剂-NC组和circFAT1+miR-211-5p激动剂组,以喂食普通饲料的大鼠作为对照组,每组20只。实时PCR检测心肌组织中circFAT1、miR-211-5p、CCND2水平;Western blotting检测心肌组织CCND2蛋白表达;生化分析仪检测大鼠空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平;心脏超声检测大鼠心功能;HE和Masson染色观察心肌组织病理形态;TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况;ELISA法检测白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;双荧光素酶报告基因实验验证circFAT1、miR-211-5p、CCND2之间的靶向关系。结果与对照组相比,DCM组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)水平降低(P<0.05),FBG、TC、TG、左心室舒张末期直径(LVEDd)、左心室收缩末期直径(LVEDs)、胶原容积分数(CVF)、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平均升高(P<0.05);与DCM组相比,circFAT1组circFAT1、CCND2 mRNA及蛋白表达,LVEF、LVFS水平升高(P<0.05),FBG、TC、TG、LVEDd、LVEDs、CVF、细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05);miR-211-5p激动剂逆转了circFAT1对DCM心肌损伤的缓解作用,且CCND2 mRNA及蛋白表达降低(P<0.05)。结论circFAT1通过调控miR-211-5p/CCND2轴减轻DCM大鼠心肌组织损伤。

灰树花多糖通过LncRNA HULC/miR-186-5p轴调控胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:分析灰树花多糖(Grifola frondose polysaccharide,GFP)对胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及机制。方法:将对数期GBC-SD细胞随机分组:对照组、GFP组(0.5、1、2µg/mL GFP)、shNC组、shHULC组、miR-NC组、miR-186-5p mimics组、GFP+pcDNA组、GFP+pcDNA-HULC组。CCK-8法检测细胞抑制率;Transwell小室法检测GBC-SD细胞迁移和侵袭;Western Blot印迹检测Cyclin D1、P21、MMP-2、MM-9蛋白水平;qRT-PCR检测LncRNA HULC和miR-186-5p的水平;Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p的结合位点,双荧光素酶报告实验检测LncRNA HULC和miR-186-5p的靶向关系。裸鼠移植瘤实验检测GFP对GBC-SD细胞移植瘤体内生长的影响。结果:0.25~8µg/mL GFP对胆囊癌GBC-SD细胞具有一定的抑制作用;与对照组比较,0.5、1、2µg/mL的GFP(极)显著(P<0.05,P<0.01)抑制GBC-SD细胞迁移和侵袭,(极)显著降低Cyclin D1、MMP-2和MM-9水平(P<0.05,P<0.01),(极)显著(P<0.05,P<0.01)增加P21水平,极显著(P<0.01)下调LncRNA HULC,上调miR-186-5p的表达(P<0.05,P<0.01);Starbase在线软件预测HULC与miR-186-5p存在结合位点,与miR-NC组比较,miR-186-5p mimics组HULC-WT的荧光素酶活性极显著降低(P<0.01),而HULC-MUT荧光素酶活性无统计学差异(P>0.05);与shNC组比较,shHULC组HULC相对表达水平极显著(P<0.01)降低,miR-186-5p相对表达水平极显著(P<0.01)增加,细胞存活率、迁移数目、侵袭数目极显著(P<0.01)降低,Cylin D1、MMP-2和MM-9水平极显著下调(P<0.01);与GFP+pcDNA组比较,GFP+pcDN-HULC组抑制率显著降低(P<0.05),迁移数目、侵袭数目极显著增加(P<0.01),Cylin D1、MMP-2和MM-9水平显著上调(P<0.05);与GFP+pcDNA给药组比较,GFP+pcDN-HULC给药组瘤体体积、质量极显著增加(P<0.01),miR-186-5p水平极显著下调(P<0.01)。结论:GFP可抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制与调控LncRNA HULC/miR-186-5p有关。

安罗替尼通过调控miR-16-5p/PD-1轴抑制人非小细胞肺癌细胞系增殖并促进凋亡

目的 探讨安罗替尼对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法 将非小细胞肺癌细胞系A549和H1299分别采用安罗替尼、miR-16-5p激动剂和/或PD-1过表达载体进行处理。CCK-8实验和EDU实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;RT-qPCR检测miR-16-5p相对表达量;Western blot检测程序性细胞死亡-1蛋白(PD-1)的表达。双荧光素酶报告实验确定miR-16-5p和PD-1的靶向关系。用A549细胞构建裸鼠成瘤模型,检测安罗替尼对体内肿瘤生长的影响。结果 安罗替尼在A549和H1299细胞中以剂量依赖的方式显著增加miR-16-5p表达,同时降低PD-1表达,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p过表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡(P<0.05)。miR-16-5p能靶向PD-1,且负调控PD-1表达。siRNA下调PD-1表达后明显抑制细胞增殖,并促进细胞凋亡(P<0.05)。过表达PD-1则可逆转安罗替尼介导的miR-16-5p对A549和H1299细胞的促增殖和抗凋亡作用(P<0.05)。体内实验证实,安罗替尼能够明显抑制肿瘤生长(P<0.05)。结论 安罗替尼可有效抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,减少体内肿瘤生长,其作用机制与miR-16-5p/PD-1信号轴相关。

miR-17-5p靶向B7-H3对结直肠癌细胞生物学特性及免疫调节作用的影响

目的:探究miR-17-5p对B7-H3的调控以及在结直肠癌发展中的免疫调节作用。方法:收集25例人结直肠癌组织及相邻正常组织,通过实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化实验分析miR-17-5p、B7-H3和PD-L1的表达水平。将人结直肠癌HCT-116细胞分为4组:miR-NC组、miR-17-5p mimic组、si-NC组、si-B7-H3组。通过细胞集落形成实验、Transwell实验和流式细胞术分析HCT-116细胞生长、侵袭能力和凋亡率。通过荧光素酶报告基因实验分析miR-17-5p对B7-H3的调控作用。通过ELISA实验分析细胞培养液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α的细胞因子水平。结果:与癌旁组织比较,结直肠癌组织中miR-17-5p表达下降,B7-H3表达升高。miR-17-5p mimic和si-B7-H3能够降低HCT-116细胞集落形成数量和侵袭数量,促进HCT-116细胞凋亡,并能降低培养液中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ及TNF-α水平。此外,miR-17-5p mimic和si-B7-H3能够抑制HCT-116细胞PD-L1表达。结论:miR-17-5p能够靶向抑制B7-H3表达,影响结直肠癌发展中的免疫调节作用,并能抑制结直肠癌细胞的转移,促进结直肠癌细胞凋亡。

乌梅总黄酮对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中miR-145-3p/CREB5轴的影响

目的研究乌梅总黄酮(Fructus mume total flavone,FMF)对MPP^(+)诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞基因表达的影响。方法采用CCK-8筛选FMF及MPP^(+)作用于SH-SY5Y细胞的最佳浓度与时间。收集对照组、模型组(MPP^(+)诱导)和FMF组(MPP^(+)诱导+FMF干预)SH-SY5Y细胞,进行全基因转录组高通量测序,并筛选差异表达的miRNAs和mRNAs。通过生信软件分析miR-145-3p潜在靶基因,并与差异表达mRNAs相交取交集。将SH-SY5Y细胞分为6组:对照组、模型组、miR-145-3p mimics组、mimics NC组、miR-145-3p inhibitor组、inhibitor NC组。qRT-PCR检测细胞miR-145-3p表达水平,Western blot检测细胞CREB5蛋白表达水平,双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性。结果对照组与模型组间比较,存在33个差异表达miRNAs,模型组与FMF组间比较,存在16个差异表达miRNAs,取交集后,得到7个差异表达的miRNAs,其中miR-145-3p在模型组下调,在FMF组上调。经分析获到4个miR-145-3p调控的差异靶基因:CREB5、EGLN1、NTNG1和SLC22A15。与对照组比较,模型组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。与NC组比较,miR-145-3p mimics组miR-145-3p表达水平显著升高,CREB5蛋白表达水平显著降低,miR-145-3p inhibitor组miR-145-3p表达水平显著降低,CREB5蛋白表达水平显著升高。双荧光素酶报告基因结果显示miR-145-3p与CREB5存在靶向调控关系。结论miR-145-3p和CREB5均在MPP^(+)诱导的SH-SY5Y细胞中差异表达,FMF可调控miR-145-3p/CREB5轴在细胞中的表达水平。

miR-218-5p靶向PDE7A调节人非小细胞肺癌A549细胞的糖酵解

目的:探究miR-218-5p靶向磷酸二酯酶7A(PDE7A)调节人非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞糖酵解过程的机制。方法:常规培养A549细胞,用Lipo3000将miR-218-5pmimic、mimic-NC、PDE7A过表达质粒(PDE7A-oe)和PDE7A对照质粒(PDE7A-NC)转染A549细胞,记为miR-218-5pmimic组、mimic-NC组、PDE7A-oe组和PDE7A-NC组。qPCR法验证转染效率,WB法检测糖酵解关键酶蛋白的表达,葡萄糖测定法和乳酸生成测定法检测各转染组A549细胞中2脱氧葡萄糖和乳酸含量,双萤光素酶报告基因实验验证miR-218-5p与PDE7A靶向结合关系,用TCGA数据库数据分析PDE7AmRNA在肺癌组织中的表达水平。结果:在A549细胞中成功地过表达了miR-218-5p(P<0.01)。过表达miR-218-5p均能显著抑制A549细胞中PDE7A、HK2、PKM2蛋白的表达(均P<0.01)、葡萄糖摄取量和乳酸生成量(均P<0.01)。过表达PDE7A均可显著促进A549细胞中PDE7A、HK2、PKM2蛋白的表达(均P<0.01),以及葡萄糖摄取量和乳酸生成量(均P<0.01)。A549细胞中miR-218-5p可与PDE7AmRNA的3´-UTR直接结合。数据库数据分析结果显示,PDE7AmRNA在肺鳞状细胞癌组织中呈高表达(P<0.01)。结论:miR-218-5p靶向PDE7A调控A549细胞中HK2和PKM2的表达水平,进而抑制糖酵解过程,miR-218-5p/PDE7A可能是NSCLC临床诊断和治疗的潜在靶点。

miR-222-5p靶向WNK2基因促进肝细胞癌生长

目的 探讨miR-222-5p对肝细胞癌(HCC)生长的影响及其分子机制。方法 实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测miR-222-5p和WNK2 mRNA在HCC组织、癌旁组织及正常肝细胞系L02、不同HCC细胞系Hep3B、HepG2、HuH-7中表达;生物信息学预测和双荧光素酶验证miR-222-5p和WNK2靶向关系;取生长密度达50%~60%的HepG2癌细胞,分为miR-222-5p NC组、miR-222-5p mimics组、miR-222-5p inhibitor组、miR-222-5p NC+pSUPER-si NC组、miR-222-5p NC+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si NC组、miR-222-5p inhibitor+pSUPER-si WNK2组、miR-222-5p NC+pcDNA组、miR-222-5p NC+pcDNA-WNK2组、miR-222-5p mimics+pcDNA组、miR-222-5p mimics+pcDNA-WNK2组,另取未转染L02正常肝细胞和HepG2癌细胞。24 h后,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖率;平板克隆法检测克隆形成能力;裸鼠成瘤实验检测细胞在动物体内成瘤能力;Western印迹法检测WNK2蛋白表达水平。结果 与癌旁组织及正常肝细胞相比,HCC组织及各细胞系中miR-222-5p表达水平明显升高,WNK2 mRNA和蛋白水平明显降低(P<0.05)。与miR-222-5p NC组相比,miR-222-5p mimics组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05),miR-222-5p inhibitor组miR-222-5p表达水平、增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低,WNK2蛋白表达水平升高(P<0.05)。miR-222-5p和WNK2存在靶向关系。与miR-222-5p NC+pcDNA组相比,miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05);miR-222-5p mimics+pcDNA组增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p NC+pcDNA WNK2组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显升高(P<0.05)。与miR-222-5p mimics+pcDNA组相比,miR-222-5p mimics+pcDNA WNK2组细胞增殖活性、克隆形成数和成瘤能力明显降低(P<0.05)。结论 过表达miR-222-5p可能通过靶向抑制WNK2表达促进肝癌HepG2细胞的增殖、克隆形成和成瘤能力,促进HCC生长。

miR-214-5p通过DNMT1介导的AXIN2基因DNA甲基化修饰在皮肤基底细胞癌中的作用机制

目的探讨皮肤基底细胞癌中轴抑制蛋白2(Axis inhibition protein 2,AXIN2)基因启动子甲基化对基因转录的影响及miR-214-5p通过靶向DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)对AXIN2甲基化率的调控机制。方法收集2022年1月-2023年6月在广州市皮肤病防治所就诊治疗的102例皮肤基底细胞癌(Cutaneous basal cell carcinoma,BCC)患者作为研究对象,提取癌组织和癌旁正常组织标本及基线资料。焦磷酸测序法检测AXIN2基因启动子区甲基化率。实时荧光定量PCR检测AXIN2、DNMT1基因mRNA和miR-214-5p的表达水平。将miR-214-5p模拟物(mimic)、抑制物(inhibitor)及其阴性对照(mimic NC和inhibitor NC)分别对基底细胞癌A431细胞进行转染,48 h后检测DNMT1基因mRNA表达水平和AXIN2基因甲基化率。结果BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率显著高于癌旁正常组织(t=5.128,P<0.001),AXIN2基因mRNA相对表达水平显著低于癌旁正常组织(t=7.826,P<0.001),DNMT1基因mRNA表达水平显著高于癌旁正常组织(t=4.838,P<0.001),miR-214-5p表达水平显著低于癌旁正常组织(t=5.426,P<0.001)。BCC癌组织的AXIN2基因甲基化率与其mRNA表达水平呈负相关(r=-0.793,P<0.001),DNMT1基因mRNA水平与AXIN2基因甲基化率呈正相关(r=0.814,P<0.001),miR-214-5p表达水平与DNMT1基因mRNA水平呈负相关(r=-0.747,P<0.001)。双荧光素酶报告基因实验结果证实,DNMT1是miR-214-5p的靶基因。细胞转染后,与mimic NC、inhibitor和inhibitor NC比较,mimic的DNMT1基因mRNA水平、AXIN2基因甲基化率显著降低(P<0.001);而inhibitor的DNMT1基因mRNA水平和AXIN2基因甲基化率相较于其他三组明显上升(P<0.001)。结论miR-214-5p可通过调控下游靶蛋白DNMT1表达,影响AXIN2基因的DNA甲基化率,调控AXIN2基因的表达水平,参与皮肤基底细胞癌的发生机制。

miR-93-5p通过PI3K/AKT通路调控HepG2细胞自噬

目的:探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖消耗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路的影响。方法:高浓度葡萄糖诱导构建胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,设计合成miR-93-5p inhibitor和NC,结合自噬抑制剂3-MA,将细胞分为Control组、IR组、IR+inhibitor NC组、IR+inhibitor组、IR+3-MA+inhibitor组。CCK8法检测各组细胞增殖活力,试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞糖原合成情况,Western-Blot法检测细胞自噬基因微管相关蛋白1轻链3(autophagy genes microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-I、LC3-II、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)蛋白、PI3K/AKT通路蛋白(AKT、p-AKT)的表达。结果:与对照组相比,IR组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达下降(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均增加(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比,IR+inhibitor组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达增加(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均下降(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比,3-MA能逆转miR-93-5p inhibitor的作用。结论:miR-93-5p通过PI3K/AKT通路促进HepG2细胞自噬,进而抑制胰岛素抵抗,缓解糖尿病造成的机体损伤。