miR-4279通过靶向Gli1调控宫颈癌的发生发展

目的探讨miR-4279在子宫颈癌的增殖过程中的作用及其作用靶点。方法利用q RT-PCR比较miR-4279在正常宫颈上皮细胞和宫颈癌细胞系He La和C-33A中的表达水平;通过转染miR-4279的模拟物或抑制物的方法来过表达或敲低miR-4279;通过miR-4279靶基因预测网站miRanda和Targetscan,寻找miR-4279的靶基因;通过免疫印迹来检测Gli1的蛋白水平,利用荧光素酶报告系统来检测Gli1 3’-UTR的活性,明确Gli1是否为miR-4279的靶基因。结果 （1）与正常宫颈上皮细胞（1.00±0.02）相比,miR-4279在宫颈癌细胞系He La（0.54±0.10）和C-33A（0.48±0.08）中表达显著较低（P〈0.001）;（2）网站预测结果显示,Gli1为miR-4279的潜在靶基因;（3）过表达miR-4279下调Gli1的蛋白水平,抑制miR-4279上调Gli1的蛋白水平;（4）过表达miR-4279导致结合Gli1的3’-UTR的能力（1.30±0.03）显著高于对照组（1.00±0.01）（P〈0.01）,抑制miR-4279导致结合Gli1的3’-UTR的能力（0.43±0.02）显著低于对照组（1.00±0.06）（P〈0.001）。结论 miR-4279能够通过Gli1调控宫颈癌的发生发展,是一种潜在的抑癌因子。

MicroRNA-4279通过靶向核心启动子区域上调Notch-1基因表达进而抑制细胞凋亡

【目的】寻找与Notch-1基因核心启动子结合的micro RNA(miRNA)并阐明其调控功能,研究免疫细胞肿瘤的发生发展机制。【方法】首先使用生物信息学手段筛选与Notch-1基因核心启动子区域结合的miRNA,进而利用荧光素酶报告系统对其调控作用进行实验验证;通过突变核心启动子上的结合位点进一步确定该miRNA特异性靶向基因核心启动子区域。检测转染该miRNA后H9细胞中Notch-1的mRNA与内源蛋白表达水平。另外通过转染该miRNA并用H2O2诱导凋亡,研究该miRNA对H9细胞凋亡的影响。进一步在上述实验条件下,使用siRNA降低靶基因(Notch-1)的表达,然后检测miRNA对H9细胞系的凋亡的影响。【结果】首先通过软件预测,我们发现了miR-4279可以与Notch-1的核心启动子序列结合。荧光素酶报告实验表明miR-4279可以增强Notch-1启动子的转录活性;而在miR-4279的靶位点引入突变后,该增强作用消失。RT-qPCR和Western Blot实验表明miR-4279能够显著增强内源Notch-1 mRNA与蛋白的表达。H2O2诱导凋亡实验表明,miR-4279可以抑制H9细胞的凋亡。siRNA干扰实验表明,当Notch-1通路被抑制后,miR-4279导致的细胞凋亡抑制的效果消失。【结论】miR-4279通过靶向Notch-1基因核心启动子区域,特异性增加Notch-1基因的表达,进而增强H9细胞对H2O2诱导的凋亡的抗性。