miR-4298靶向TGIF2影响多发性骨髓瘤细胞的增殖和迁移的机制研究

目的研究微小RNA-4298(miR-4298)对多发性骨髓瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响以及作用机制。方法荧光定量PCR(qPCR)检测miR-4298在多发性骨髓瘤细胞系(U-266、SKO-007、RPMI-8226)中的表达量;RPMI-8226细胞随机分为对照组(常规培养细胞)、miR-NC组(转染miR-4298阴性对照)、miR-4298组(转染miR-4298模拟物);qPCR检测转染效果,分别采用细胞计数(CCK-8),细胞划痕和Transwell实验检测RPMI-8226细胞增殖、迁移和侵袭能力,TargetScan预测,双荧光素酶报告基因验证miR-4298与转化生长交互作用因子2(IGFIF2)的靶向关系,蛋白质印迹法(Western blot)检测TGFB诱导因子同源盒2(TGIF2)蛋白表达水平。结果miR-4298在多发性骨髓瘤细胞系(U-266、SKO-007、RPMI-8226)中表达量下调(P<0.05);上调miR-4298抑制RPMI-8226细胞增殖(P<0.05),降低其迁移、侵袭(P<0.05);TGIF2是miR-4298下游靶基因;miR-4298与TGIF2蛋白水平呈线性负相关;上调TGIF2能逆转miR-4298对RPMI-8226细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用。结论miR-4298在多发性骨髓瘤细胞系表达量下调,其可能通过抑制TGIF2阻碍RPMI-8226细胞增殖、迁移、侵袭。

TSA上调miR-4298靶向抑制PADI4表达在诱导U251细胞凋亡中的作用

目的探讨微小RNA-4298(miR-4298)靶向抑制肽酰精氨酸脱亚胺基酶4(PADI4)表达在组蛋白去乙酰化酶抑制因子曲古抑菌素A(TSA)诱导U251细胞凋亡中的作用机制。方法实验分为TSA组(0.2μmol/L TSA处理)和对照组。采用CCK8法检测TSA对U251细胞增殖的影响;流式细胞术检测药物作用后U251细胞的凋亡水平;反转录PCR和蛋白质印迹法测定miR-4298干扰后PADI4基因和蛋白表达的变化;Luciferase实验测定miR-4298对PADI4的3′UTR区靶向结合与荧光素酶活性的影响;PADI4转染U251细胞,观察miR-4298对凋亡功能的拯救作用。实验各分为3组,即NC组、miR-4298 mimic组、TSA+miR-4298 mimic组以及NC组、miR-4298 inhibitor组、TSA+miR-4298 inhibitor组。结果U251细胞经0.2μmol/L的TSA作用4 d后,对照组的吸光度(A)值为1.168±0.148,高于TSA组的0.737±0.007,差异有统计学意义(t=4.948,P=0.008)。与对照组相比,经0.2μmol/L TSA处理48 h后,U251细胞发生明显的凋亡现象(27.62%±3.49%vs.4.99%±0.13%,t=11.190,P<0.001)。与药物作用前相比,TSA作用48 h后,PADI4基因表达(0.386±0.020 vs.0.903±0.021)和蛋白表达水平(0.276±0.041 vs.0.777±0.031)均有所降低,差异均有统计学意义(t=30.400,P<0.001;t=16.770,)P<0.001。miR-4298在TSA诱导U251细胞凋亡的过程中表达升高(2.573±0.289 vs.1.003±0.136;t=8.487,P=0.001),并且miR-4298与PADI4的表达呈负相关(r=-0.877,P=0.002)。Luciferase实验证实,miR-4298对野生型PADI4的3′UTR区具有靶向结合和荧光素酶抑制作用。与NC组(0.920±0.026)相比,miR-4298 mimic组(0.413±0.049)和TSA+miR-4298 mimic组(0.213±0.035)PADI4基因相对表达水平均有所降低,差异均有统计学意义(均P<0.001);其蛋白表达水平变化与基因变化趋势一致。与NC组(3.78%±0.68%)相比,miR-4298 mimic组(7.96%±1.10%)和TSA+miR-4298 mimic组(13.74%±1.26%)诱导细胞凋亡的水平均有所增加,差异有统计学意义(P=0.005;P<0.001)。与NC组(0.183±0.025)相比,miR-4298 inhibitor组(0.483±0.032)和TSA+miR-4298 inhibitor组(0.386±0.025)PADI4基因表达均有所升高,差异有统计学意义(P<0.001;P=0.015)。蛋白表达水平变化与基因变化趋势一致。与NC组(4.96%±0.59%)相比,miR-4298 inhibitor组(23.83%±2.20%)和TSA+miR-4298 inhibitor组(9.55%±1.49%)诱导细胞凋亡的水平均有所增加,差异有统计学意义(均P<0.001)。救援实验中,miR-4298 mimic组明显升高PADI4表达水平(P<0.001),miR-4298 mimic+PADI4组则相对逆转PADI4表达水平(P=0.002)。结论miR-4298可通过靶向调控PADI4基因表达参与U251细胞的凋亡发生过程,miR-4298可能是脑胶质瘤靶向干预治疗的靶点。