miR-449b通过E2F3-p53途径抑制子宫内膜腺癌细胞HEC-1-B的生长

目的探讨miR-449b对子宫内膜腺癌细胞HEC-1-B增殖和凋亡的影响及其作用的分子途径。方法脂质体lipofectamine 2000包被miR-449b并转染入HEC-1-B细胞,实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miR-449b的表达水平,CCK-8试验检测转染前后细胞活性,流式细胞仪来检测转染前后细胞凋亡情况。细胞克隆形成实验观察转染前后细胞克隆形成能力。Western blot方法检查转染前后细胞内E2F3蛋白和p53的表达情况。结果转染后实验组miR-449b表达量较NC组增加,细胞增殖能力和克隆能力减弱,而细胞凋亡增加(P<0.05)。miR-449b使E2F3表达下调,p53表达上调(P<0.05)。结论 miR-449b通过E2F3-p53途径抑制HEC-1-B细胞增殖并促进凋亡,可能作为治疗子宫内膜腺癌的新分子靶标。

miR-449b表达对慢性乙型肝炎合并肝细胞癌患者预后的影响

目的:探讨miR-449b表达对慢性乙型肝炎(CHB)合并肝细胞癌(HCC)患者预后的影响。方法:选取2014年1月至2018年1月的100例CHB合并HCC患者为观察组,同期40例CHB患者作为对照组,使用qRT-PCR检测患者外周血中miR-449b水平,分析miR-449b与观察组患者总生存期(OS)的关系。结果:观察组外周血miR-449b表达水平(0.27±0.10),低于对照组(0.64±0.10),差异有统计学意义(P<0.05)。miR-449b表达与HBV病毒载量、肿瘤分期、Child-Pugh分级具有相关性(P<0.05)。观察组共失访9例,成功随访率91.0%,平均随访时间(49.9±7.9)个月,死亡51例。miR-449b表达增高组2年死亡率为15.91%,miR-449b表达降低组2年死亡率为38.30%,差异具有统计学意义(P<0.05)。Kaplan-Meier联合Log-rank检验提示,miR-449b表达降低组OS短于miR-449b表达升高组(P<0.05)。Cox分析结果显示,miR-449b表达、年龄、TNM分期、病毒载量是CHB合并HCC OS的独立影响因素(P<0.05)。结论:CHB合并HCC患者外周血中miR-449b表达水平与TNM分期、病毒载量及Child-Pugh分级有关,且miR-449b表达降低患者的OS缩短,miR-449b可能是CHB合并HCC预后的标志物。

miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响

【目的】研究miR-449b对绵羊早期胚胎发育的影响。【方法】采用Percoll密度梯度离心法获得纯化绵羊精子,将绵羊卵丘-卵母细胞复合体(COCs)在培养箱中培养16~18 h获得成熟卵母细胞,从1月龄纯种萨福克绵羊耳组织分离成纤维细胞,通过实时荧光定量PCR比较绵羊精子、成熟卵母细胞与成纤维细胞中miR-449b的相对表达量;给成熟卵母细胞分别显微注射0.9%生理盐水(Con组)、miR-449b模拟物对照(NC mimic)与miR-449b模拟物(miR-449b mimic),注射后进行孤雌激活,分别于激活的第2、7天统计胚胎卵裂率与囊胚率;将成熟卵母细胞进行体外受精(IVF),收集IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎,采用免疫荧光法比较组蛋白H3K9me3的变化。【结果】miR-449b在精子中的表达显著高于成熟卵母细胞和成纤维细胞(P<0.05);与Con组相比,miR-449b mimic和NC mimic组胚胎的卵裂率均显著降低(P<0.05),NC mimic组胚胎卵裂率显著低于miR-449b mimic组(P<0,05);miR-449b mimic组胚胎囊胚率提高,但差异不显著(P>0.05);IVF、Con、NC mimic与miR-449b mimic组2-细胞胚胎均表达组蛋白H3K9me3,且都在细胞核表达。与Con组相比,NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著增加(P<0.05),miR-449b mimic组显著降低(P<0.05);NC mimic组2-细胞胚胎组蛋白H3K9me3的表达水平显著高于miR-449b mimic组(P<0.05),miR-449b mimic与IVF组无显著差异(P>0.05)。【结论】miR-449b能显著提高绵羊早期胚胎的发育率,且降低早期胚胎中H3K9me3的表达水平。

miR-449b介导5-氟尿嘧啶/顺铂抑制肝癌细胞的迁移

目的研究化疗药5-氟尿嘧啶和顺铂对miR-449b在肝癌细胞中表达的影响及其抑制肝癌细胞迁移能力的分子机制。方法收集肝癌患者的组织样本,提取总RNA,用real-time PCR法检测肝癌组织样本中miR-449b的表达;5-氟尿嘧啶和顺铂处理肝癌细胞,检测miR-449b的表达;在肝癌细胞中过表达miR-449b或用5-氟尿嘧啶和顺铂分别处理肝癌细胞,利用细胞划痕实验检测肝癌细胞的迁移能力变化;设计拯救实验,探究化疗药5-氟尿嘧啶和顺铂通过诱导miR-449b表达,参与肝癌细胞迁移能力调控;软件预测结合Western blot实验,鉴定miR-449b的功能靶基因。结果 miR-449b在肝癌患者组织中表达下调(P<0.001);5-氟尿嘧啶和顺铂诱导肝癌细胞内源性miR-449b的表达上调(P<0.001);过表达miR-449b可以抑制肝癌细胞的迁移(P<0.001);敲低miR-449b的表达可以抑制5-氟尿嘧啶和顺铂对肝癌细胞迁移能力的抑制作用(P<0.05);catenin-δ是miR-449b的直接靶基因。结论5-氟尿嘧啶和顺铂通过诱导miR-449b的表达抑制肝癌细胞的迁移。

miR-449b多态性位点rs10061133差异调控LHCGR表达

目的探究miR-449b多态性位点rs10061133 A>G在卵巢功能不全(POI)中的可能作用机制。方法生物信息学预测可能与POI相关的miR-449b潜在靶基因。双荧光素酶检测LHCGR是否为miR-449b的靶基因以及miR-449b rs10061133不同基因型对LHCGR表达调控的影响。结果生物信息学预测LHCGR为miR-449b的潜在靶基因,双荧光素酶测定证实LHCGR是miR-449b的靶基因。与GG基因型相比,rs10061133 AA基因型显著减弱LHCGR 3’UTR的荧光素酶活性。结论LHCGR为miR-449b的靶基因,多态性位点rs10061133 A>G可能通过差异调控LHCGR表达在POI的发生发展中发挥作用。

miR-449b-5p通过靶向Cyclin E2 抑制卵巢癌细胞生长和细胞周期进展

目的:探讨miR-449b-5p对卵巢癌细胞生长的作用和机制。方法:选取2018年6月至2020年6月于四川省人民医院妇产科接受手术的20例卵巢癌患者的癌组织和癌旁组织,以及正常卵巢上皮细胞系HOSEpiC和6种人宫颈癌细胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和A2780,用qPCR检测卵巢癌组织和细胞中miR-449b-5p与CCNE2 mRNA的表达。将miR-NC、miR-499b-5p mimic、miR-499b-5p inhibitor、pc-CCNE2质粒分别或联合转染进入SKOV3细胞,通过CCK-8法测定细胞生长,流式细胞术检测细胞周期,WB法检测CCNE2蛋白的表达。双荧光素酶报告实验验证miR-449b-5p与CCNE2的靶向关系。裸鼠皮下注射转染miR-499b-5p mimic的SKOV3细胞悬液构建移植瘤模型,每周检测移植瘤体积,第42天处死,电子天平称皮下肿瘤重量,免疫组化法检测移植瘤组织中CCNE2和Ki67的表达。结果:与正常卵巢组织和上皮细胞系HOSEpiC相比,miR-499b在人宫颈癌组织和细胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和A2780中表达明显下调(P<0.01)。与Control组相比,miR-499b mimic组SKOV3细胞增殖明显受到抑制(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显升高(P<0.01);miR-499b inhibitor组SKOV3细胞增殖水平升高(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.01)。miR-499b-5p高表达明显抑制了含有野生型CCNE2质粒的荧光素酶活性(P<0.01),但对突变型CCNE2质粒的荧光素酶活性无影响。与miR-499b mimic组相比,miR-499b mimic+pc-CCNE2组SKOV3细胞生长明显增加(P<0.01),G0/G1期细胞比例明显降低(P<0.01)。与miR-NC组相比,miR-499b mimic组裸鼠移植瘤体积明显变小(P<0.01),瘤质量明显减轻(P<0.01),CCNE2和Ki67阳性细胞明显减少(P<0.01)。结论:miR-449b-5p通过靶向Cyclin E2抑制卵巢癌细胞生长和细胞周期进展。

miR-449b对GBM细胞替莫唑胺治疗敏感性的影响

目的 miR-449b在多种肿瘤细胞中都处于低表达状态,是潜在的肿瘤抑制因子。本课题主要探究miR-449b表达对GBM细胞替莫唑胺(TMZ)治疗敏感性的的影响及内在的调控机制。方法选用两株GBM细胞,T98G和LN229,将miR-449b模拟剂转入这两种细胞中,采用MTT法、克隆集落法和免疫印迹法检测miR-449b表达对不同剂量TMZ处理后的GBM细胞的存活、增殖能力和凋亡水平的影响;同时检测miR-449b表达对替莫唑胺治疗下GBM细胞ATP水平的影响,以及将外源ATP脂质体转入后对细胞活力的影响。结果 MTT研究表明,增加miR-449b表达可降低替莫唑胺治疗下GBM细胞的存活能力,表现为肿瘤细胞活力下调、克隆集落形成能力减弱及Cleaved-PARP的蛋白水平增加;ATP检测结果发现,miR-449b表达可降低替莫唑胺应激下肿瘤细胞ATP水平,并且外源性ATP补充可明显增强替莫唑胺治疗下肿瘤细胞的活力。结论以上研究结果提示,miR-449b可通过加剧替莫唑胺治疗下GBM细胞ATP水平消耗,进而促进GBM细胞对替莫唑胺治疗的敏感性,有利于提高替莫唑胺对GBM的治疗效果及其在临床上的应用。

绵羊miR-449a/b前体序列组织表达及生物信息学分析

【目的】探究miR-449a/b在绵羊生长发育和繁殖性能方面的作用,为进一步研究miR-449a/b在绵羊繁殖调控中的作用提供参考。【方法】以湖羊为研究对象,利用实时荧光定量PCR技术鉴定miR-449a/b在湖羊下丘脑、垂体和卵巢中的相对表达量。使用TargetScan、miRWalk、miRDB软件预测绵羊miR-449a/b前体序列的靶基因,利用微生信和KOBAS网站对其进行GO功能和KEGG通路富集分析。【结果】试验获得的前体序列与NCBI数据库中绵羊前体序列信息比对结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,miR-449a在垂体中的相对表达量显著高于miR-449b(P<0.05),miR-449b在卵巢中的相对表达量极显著高于miR-449a(P<0.01)。利用3个靶基因预测软件做韦恩图分析,取其交集得到miR-449a/b的靶基因数目分别为299和23个。GO功能富集显示,miR-449a/b主要被富集到生物进程;KEGG通路富集结果取前20个通路进行分析发现,主要包括催产素、MAPK等与繁殖调控相关的信号通路。【结论】miR-449a在垂体中的表达量较高,miR-449b在卵巢中的表达量较高。miR-449a/b的靶基因数目分别为299和23个,其基因功能主要集中在生物过程,可能参与湖羊的繁殖调控。

miR-20a-3p、miR-449b-5p在妊娠糖尿病中的表达及临床意义

目的 通过基于基因表达数据库(GEO)的基因表达数据,描述miR-20a-3p、miR-449b-5p与妊娠糖尿病之间的关系。方法 本研究选择了GEO数据库中的GSE182737及GSE98403两个数据集,将妊娠糖尿病组(GDM)和正常组(normal)的外周血标本分别作为实验组和对照组,分别筛选表达差异cicrRNA及miRNA,通过cicrRNA数据库筛选靶向miRNA,取交集miRNA。利用mirPATH软件对交集的差异miRNA行京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体(GO)功能分析。收集2019年1月至2020年12月在常熟市第二人民医院产科就诊的GDM的患者60例,同期正常妊娠的产妇60例,对采集的血液标本进行qPCR验证miR-20a-3p、miR-449b-5p的表达。结果 GSE182737的差异cicrRNA为10个,GSE98403的差异miRNA为73个,两个数据集表达差异miRNA交集为7个。通过miPATH软件对交集的差异miRNA行KEGG富集,结果显示在脂肪酸代谢及合成等通路上显著富集。GO富集分析显示在应激反应及细胞死亡等通路上显著富集。通过实时免疫荧光定量聚合酶链反应(qPCR)的验证,miR-20a-3p在GDM组血液样本中表达为0.688±1.024,在正常组中的表达量为3.572±1.021,miR-449b-5p在正常组血液样本中表达为11.347±1.963,在GDM组中的表达量为1.902±1.814,两组之间存在显著表达差异(P<0.05)。受试者操作特征(ROC)曲线显示miR-20a-3p、miR-449b-5p在GDM中的曲线下面积分别为0.9431及0.9398。相关性分析显示胰岛素抵抗指数与miR-20a-3p、miR-449b-5p的关系为负相关(P<0.05)。结论 根据生物信息学分析,我们发现筛选出的候选miR-20a-3p、miR-449b-5p与GDM的发生及发病机制密切相关,可以作为早期筛查GDM的生物标志物。

circBIRC6靶向miR-449b-5p调控胃癌SUN-1细胞的增殖、细胞周期及凋亡

目的探讨circBIRC6对胃癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响及可能的作用机制。方法收集2020年1月至5月武汉科技大学附属孝感医院收治的53例胃癌患者的癌组织及其癌旁组织标本,RT-qPCR法检测胃癌组织、癌旁组织与人胃黏膜细胞GES1、人胃癌细胞SNU-1、AGS、HS-746T中circBIRC6、miR-449b-5p的表达量;以SNU-1细胞为研究对象,随机分组为si-NC组、si-circBIRC6组、miR-NC组、miR-449b-5p组、si-circBIRC6+anti-miR-NC组、si-circBIRC6+anti-miR-449b-5p组;CCK-8法、流式细胞仪分别检测细胞增殖、细胞周期及凋亡率;双荧光素酶报告实验检测miR-449b-5p过表达对野生型载体WT-circBIRC6荧光素酶活性的影响;western blot检测cleaved caspase-3蛋白表达量。结果与癌旁组织比较,胃癌组织中circBIRC6的表达量升高(P<0.05),miR-449b-5p的表达量降低(P<0.05);与GES1细胞比较,SNU-1、AGS、HS-746T细胞中circBIRC6的表达量升高(P<0.05),miR-449b-5p的表达量降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-circBIRC6组细胞活力和S期细胞比例降低(P<0.05),G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05);与miR-NC组比较,miR-449b-5p组细胞活力和S期细胞比例降低(P<0.05),G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。miR-449b-5p过表达可降低WT-circBIRC6的荧光素酶活性(P<0.05)。与si-circBIRC6+anti-miR-NC组比较,si-circBIRC6+anti-miR-449b-5p组细胞活力和S期细胞比例升高(P<0.05),G0/G1期细胞比例、细胞凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。结论干扰circBIRC6表达可通过上调miR-449b-5p表达而抑制胃癌细胞增殖、细胞周期进程及诱导细胞凋亡。

香猪睾丸miR-449b和miR-222分子的发育性变化

为了阐明miR-449b和miR-222对贵州从江香猪睾丸发育的调节作用。运用qPCR方法检测香猪睾丸组织中miR-449b和miR-222表达量的发育性变化,通过miRSystem数据库、Kobas数据库对预测的靶基因进行信号转导通路富集分析。经克隆测序,得到香猪miR-222序列,与猪的相似性为100%,而且物种之间miR-449b和miR-222两个分子的保守性都很高。香猪睾丸中miR-449b于1~4月龄期间的表达量逐渐上升,4月龄时表达量达到峰值,之后下降;miR-222的表达量呈现相反的变化趋势,于1~4月龄期间表达量逐渐下降,1月龄时最高,4月龄时最低,之后的表达量有所回升;已知物种的miR-449b和miR-222序列高度保守;经预测miR-449b靶基因有420个,富集于卵母细胞减数分裂、Notch信号通路、Ras信号通路等100个途径(P<0.05),miR-222的靶基因有429个,富集于细胞周期、Fox O信号通路、TGF-β信号通路等69个通路(P<0.05);miR-449b和miR-222的靶基因共享的通路为Wnt信号通路、MAPK信号通路、雌激素信号通路等42个(P<0.05)。

miR-449a/b负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖

目的探讨miR-449a/b在胃癌发生中的可能作用机制。方法采用qRT-PCR方法检测了miR-449a/b和E2F1基因在胃癌细胞BGC-823和胃粘膜细胞GES-1表达情况;采用瞬时转染技术将miR-449a/b模拟物(mimic)以及mimic阴性对照分别转入胃癌细胞BGC-823中,qRT-PCR验证转染成功后,通过CCK-8法检测胃癌细胞的增殖能力,流式细胞术检测胃癌细胞凋亡的变化,细胞划痕实验检测胃癌细胞的迁移能力,Western blot方法检测miR-449a/b上调后其靶基因蛋白的表达水平;并通过转染E2F1过表达质粒和空质粒对照入胃癌细胞BGC-823,Western blot确定转染效率后,分别用qRT-PCR和数字PCR检测miR-449a/b的表达水平。结果相比于正常胃粘膜细胞株GES-1,miR-449a/b在胃癌细胞株BGC-823中表达均下调(P<0.01);过表达miR-449a/b可抑制胃癌细胞BGC-823增殖和迁移,并促进其凋亡(P<0.05);过表达的E2F1可上调miR-449a/b的表达(P<0.001),而上调miR-449a/b的表达,其直接靶基因CDK4、CDK6表达下调,并可通过CDKs-pRb-E2F1信号通路,间接下调E2F1蛋白的表达(P<0.01)。结论 miR-449a/b的低表达和E2F1的高表达均参与了胃癌的发生、发展,并且miR-449a/b能负反馈调节E2F1抑制胃癌细胞增殖。

bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c靶基因预测及生物信息学分析

【目的】试验旨在对bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的序列保守性、转录因子和靶基因进行生物信息学预测和分析,探究其影响精子发生的作用机制,为研究其生物学功能及作用机制提供指导和思路。【方法】利用miRBase数据库获取不同物种的bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c序列并进行相似性分析;通过TargetScan、miRWalk、miRDB等方法预测bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的靶基因,对获得的靶基因集合分别进行GO功能和KEGG通路富集分析;通过AnimalTFDB获取共同调控bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c的转录因子,并构建TF-miRNA-mRNA作用网络。【结果】bta-miR-34b/c和bta-miR-449a/b/c在不同物种间高度保守。预测得到2个转录因子和49个候选靶基因,这些靶基因主要富集在精子发生、钙离子依赖性胞吐的调节、胰岛素分泌的调节等GO条目,以及HIF-1信号通路、甲状腺激素信号通路、Wnt信号通路等KEGG通路。bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c与上游转录因子NR2C2和HIC1,下游靶基因AXL、E2F3、DAAM1等共同构成的作用网络通过调控减数分裂、细胞周期、细胞凋亡、精子细胞能量代谢等生物过程影响精子发生。【结论】bta-miR-34b/c、bta-miR-449a/b/c通过上游转录因子和下游靶基因组成的分子调控网络共同调节精子发生过程。

m icroRNA-449b对高迁移率族蛋白B1介导树突状细胞功能的影响

目的:探讨mi R-449b在高迁移率族蛋白B1(HMGB1)刺激树突状细胞(DC)中的变化及其对DC免疫功能的影响。方法:分别以10、100、1 000 ng/ml剂量的HMGB1刺激小鼠脾脏来源的CD11c+DC,于48后检测DC表面分子CD80、CD86、MHC-II及细胞内mi R-449b改变;流式细胞仪分析不同剂量HMGB1刺激对DC凋亡的影响。DC转染mi R-449b模拟物(mi R-449b)、抑制物(In-mi R-449b)及相应对照(mi R-NC、In-mi RNC)后,HMGB1(100 ng/ml)刺激48 h收取细胞,检测DC表面分子、凋亡改变以及与T细胞混合培养后T细胞增殖、分化功能的变化。结果:HMGB1刺激DC后,其表面分子随着剂量的增加表达上调,其中以100 ng/ml组上调最为明显,而大剂量(1 000 ng/ml)时表达有所下调;mi R-449b在48 h 100及1 000 ng/ml HMBG1组表达明显上调(P<0.05);随着HMGB1剂量的增加,DC在48 h凋亡逐渐增加(P<0.05)。转染mi R-449b可上调其在细胞内表达,而抑制物可抑制其表达;上调mi R-449b后HMGB1(100 ng/ml)刺激48 h DC表面分子CD86表达显著上调(P<0.05)、凋亡增加(P<0.01)、对T细胞的共刺激增殖效应减弱、混合性淋巴细胞反应中IL-4水平增多(P<0.01)、IFN-γ水平下降(P<0.05)。结论:mi R-449b可负性调控HMGB1介导DC免疫功能及促进其凋亡,进而在机体免疫反应障碍过程中发挥调控作用。

基于转录组学分析miR-34b/c与miR-449对小鼠输出小管结构与功能的影响

目的:研究miR-34b/c、miR-449在维持输出小管正常结构与功能中发挥的作用,探索miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠不育的分子机制。方法:HE染色对小鼠输出小管形态进行观察;利用转录组测序技术对野生型小鼠和miR-34b/c^(-/-)、miR-449^(-/-)双敲除小鼠输出小管基因表达进行分析,从中筛选出miR-34b/c、miR-449可能的靶基因与差异表达基因进行联合分析;qRT-PCR法验证测序结果。结果:双敲除小鼠输出小管形态异常;与野生型小鼠相比,双敲除小鼠输出小管中参与纤毛等结构形成以及水、离子、蛋白质转运等活动的基因表达显著下降。结论:miR-34b/c、miR-449的缺失导致双敲除小鼠输出小管结构异常,输出小管纤毛运动与重吸收功能障碍,导致双敲除小鼠不育。

MicroRNA-449b-5p通过靶向KLF4促进肝细胞癌的增殖和转移

目的旨在探讨miR-449b-5p在肝细胞癌发病机制中的作用。方法用miR-449b-5p模拟物或miR-449b-5p抑制剂转染肝细胞癌细胞系。通过CCK-8和Transwell实验鉴定mi R-449b-5p对肝细胞癌细胞增殖和迁移能力的影响。Westernblot和qRT-PCR检测miR-449b-5p和KLF4m RNA的表达水平。采用双荧光素酶法验证miR-449b-5p与KLF4的关系。结果研究结果显示miR-449b-5p在人肝癌组织和细胞系中的表达上调。此外,降低miR-449b-5p的表达抑制了肝癌细胞的增殖和迁移能力。机制方面,实验数据证明KLF4是miR-449b-5p在肝癌细胞中的直接作用靶点。同时,拯救实验证实过表达KLF4可以抵消miR-449b-5p促进肝癌细胞增殖和转移的能力。与此同时,研究结果表明细胞周期抑制剂p21在HCC细胞中异常下调,而降低mi R-449b-5p表达后这种抑制作用被逆转。结论研究结果表明miR-449b-5p可通过靶向KLF4促进肝癌细胞的增殖和转移。

艾司氯胺酮对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制实验研究

目的:探讨艾司氯胺酮对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及可能的作用机制。方法:收集26例肝癌患者的癌组织和癌旁组织。实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肝癌组织和细胞微小RNA(miR)-449b-5p和转化生长因子-β诱导因子同源盒2(TGIF2)mRNA表达。选取上述基因变化最显著的细胞进行后续实验。将肝癌SK-Hep-1细胞分为对照组(正常培养)、艾司氯胺酮-L组(1 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H组(2 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H+inhibitor NC组(转染inhibitor NC+2 mmol/L艾司氯胺酮处理)、艾司氯胺酮-H+miR-449b-5p inhibitor组(转染miR-449b-5p inhibitor+2 mmol/L艾司氯胺酮处理)。细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖。划痕实验检测细胞迁移能力。Transwell实验检测细胞侵袭能力。流式细胞术检测细胞凋亡情况。Western blot检测细胞中肿瘤增殖细胞核抗原(Ki-67)、半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved caspase-3)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、血管内皮生长因子A(VEGF-A)、TGIF2蛋白表达量。双荧光素酶报告基因实验验证miR-449b-5p和TGIF2的靶向关系。结果:肝癌组织和细胞TGIF2 mRNA表达水平升高,miR-449b-5p表达水平降低(均P<0.05)。与对照组比较,艾司氯胺酮-L组、艾司氯胺酮-H组以及艾司氯胺酮-H+inhibitor NC组SK-Hep-1细胞中miR-449b-5p表达水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,TGIF2 mRNA表达水平、OD_(450)值(24、48 h)、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数及Ki-67、MMP-9、VEGF-A、TGIF2蛋白表达水平降低(均P<0.05)。与艾司氯胺酮-H+inhibitor NC组比较,艾司氯胺酮-H+miR-449b-5p inhibitor组SK-Hep-1细胞miR-449b-5p表达水平、细胞凋亡率及Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,TGIF2 mRNA表达水平、OD_(450)值(24、48 h)、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数及Ki-67、MMP-9、VEGF-A、TGIF2蛋白表达水平升高(均P<0.05)。miR-449b-5p mimic+TGIF2-WT组荧光素酶活性低于miR-NC+TGIF2-WT组(P<0.05)。结论:艾司氯胺酮通过上调miR-449b-5p/TGIF2轴抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。

微RNA-449b-5p通过调控NOTCH1基因的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探究miR-449b-5p通过调控NOTCH1基因的表达抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制。方法实时荧光定量PCR、免疫印迹检测甲状腺乳头状癌细胞中miR-449b-5p和NOTCH1的表达,过表达miR-449b-5p,沉默或者过表达NOTCH1基因,检测细胞增殖、迁移和侵袭情况;双荧光素酶实验检测miR-449b-5p和NOTCH1的联系。结果与Nthy-ori3-1细胞比较,甲状腺乳头状癌细胞BCPAP、TPC-1、K1中miR-449b-5p表达水平显著降低,NOTCH1mRNA及蛋白水平均显著升高(P<0.05);过表达miR-449b-5p后,与Control组、miR-NC组比较,miR-449b-5p组miR-449b-5p水平显著升高,NOTCH1水平显著降低,OD值、迁移、侵袭细胞数显著降低,CyclinD1、MMP-2蛋白水平显著降低,p21、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);双荧光素酶报告实验显示,免疫印迹证实miR-449b-5p对NOTCH1的影响,miR-449b-5p可与NOTCH1结合负向调控NOTCH1水平;沉默NOTCH1后,与Control组、si-NC组比较,si-NOTCH1组NOTCH1蛋白水平显著降低,OD值、迁移和侵袭细胞数显著减少,CyclinD1、MMP-2蛋白水平显著降低,p21、E-cadherin蛋白水平显著升高(P<0.05);与miR-449b-5p+pcDNA3.1组比较,miR-449b-5p+pcDNA3.1-NOTCH1组NOTCH1水平显著升高,OD值、迁移和侵袭细胞数目显著升高,CyclinD1、MMP-2蛋白水平显著升高,p21、E-cadherin蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论过表达miR-449b-5p抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖、迁移和侵袭,过表达NOTCH1基因能逆转过表达miR-449b-5p对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。

miR-449对骨髓间充质干细胞成骨分化调控的机制研究

目的探究miR-449是否具有调控骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化的作用。方法分离、培养骨髓MSCs,采用流式细胞仪检测CD44、CD29、CD34、CD45等表面相关标志抗原的表达鉴定骨髓MSCs;将MSCs分为对照组、miR-449a组、miR-449b组及anti-miR-449组,对照组用成骨诱导培养基培养,其余各组分别经miR-449a/b或inhibitors转染后在成骨诱导培养基培养,分别于培养第3、6、9、12天检测各组碱性磷酸酶活性,qRT-PCR检测miR-449a/b对成骨特异性基因Runx2、Osterix表达的影响。结果①第4代间充质干细胞CD44、CD29表达阳性,而CD34和CD45表达阴性,符合骨髓间充质干细胞的特征。②成骨诱导培养3、6、9、12 d后,MSCs细胞碱性磷酸酶活性较上一时间点升高,且呈时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);MSCs成骨诱导培养3、6、9、12 d后,Runx2、Osterix表达水平逐渐升高。③miR-449a组和miR-449b组AKP活性低于对照组,而anti-miR-449组AKP活性升高,差异有统计学意义(P<0.05);miR-449a组和miR-449b组Runx2、Osterix表达较对照组下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本次实验成功分离、培养了骨髓MSCs,其具有体外成骨分化能力,而miR-449能抑制骨髓MSCs向成骨分化。