连翘脂苷A通过miR-502-3p/CDCA5通路调控结肠癌细胞HCT 116增殖、迁移和侵袭的分子机制研究

目的探讨连翘脂苷A是否通过微小RNA-502-3p(miR-502-3p)/细胞分裂周期相关蛋白5(CDCA5)通路调控结肠癌细胞HCT 116增殖、迁移和侵袭。方法将对数期的HCT 116细胞用80、160、320 mg/L连翘脂苷A处理,分别记为低剂量组、中剂量组、高剂量组,同时将未处理的细胞设为对照(NC)组。将正常人正常结肠上皮NCM460细胞用320 mg/L连翘脂苷A处理,计为NCM460高剂量组,将未处理的细胞设为对照,计为NCM460组。48 h后收集HCT 116细胞、进行增殖、迁移、侵袭、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9、CDCA5蛋白表达和miR-502-3p表达测定,收集NCM460细胞进行增殖、迁移、侵袭测定。根据转染靶标将HCT 116细胞分为NC组(未行转染)、si-NC组(转染si-NC)、si-CDCA5组(转染si-CDCA5)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-502-3p组(转染miR-502-3p)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-502-3p组(转染anti-miR-502-3p)、anti-miR-NC+高剂量组(转染anti-miR-NC+320 mg/L连翘脂苷A)、anti-miR-502-3p+高剂量组(转染anti-miR-502-3p+320 mg/L连翘脂苷A),检测HCT 116细胞的增殖、迁移和侵袭。双荧光素酶活性检测分析miR-502-3p与CDCA5的靶向结合。结果低、中、高剂量连翘脂苷A作用后结肠癌HCT 116细胞的增殖能力、细胞迁移数量、细胞侵袭数量、MMP2、MMP9、CDCA5蛋白表达量均逐渐降低,miR-502-3p表达量逐渐升高,呈剂量依赖性,差异均有统计学意义(P<0.05)。NCM460组与NCM460高剂量组的NCM460细胞增殖、迁移及侵袭数量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。CDCA5低表达或miR-502-3p高表达可减弱HCT 116细胞MMP2及MMP9蛋白表达、细胞增殖、迁移及侵袭能力,差异均有统计学意义(P<0.05),而miR-502-3p低表达的结果相反。miR-502-3p靶向调控CDCA5的表达。连翘脂苷A抑制HCT 116细胞CDCA5、MMP2、MMP9蛋白表达、增殖能力、细胞迁移和细胞侵袭的作用被miR-502-3p低表达所逆转。结论连翘脂苷A通过上调miR-502-3p靶向调控CDCA5的表达,抑制结肠癌细胞HCT 116细胞的增殖、迁移和侵袭。

白桦酸通过miR-508-5p/CDCA5通路调控结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制研究

目的:研究白桦酸对结直肠癌HT29细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其潜在的分子机制。方法:用白桦酸5、10、20 mg/L分别处理结直肠癌细胞HT-29,qRT-PCR检测细胞中miR-508-5p及CDCA5 mRNA的表达,Western blot检测CDCA5、增殖相关蛋白CyclinD1和p21、迁移侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表达水平,MTT法测定HT29细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证miR-508-5p与CDCA5的调控关系。结果:白桦酸可促进结直肠癌细胞HT29中miR-508-5p表达,抑制CDCA5表达,抑制HT29的侵袭、迁移和增殖,且其作用呈现显著的浓度依赖性;过表达miR-508-5p和抑制CDCA5表达均可抑制HT29细胞增殖、迁移和侵袭;双荧光素酶报告系统结果显示,miR-508-5p靶向负调控CDCA5的表达,抑制miR-508-5p逆转了白桦酸对HT29细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:白桦酸通过miR-508-5p靶向CDCA5基因抑制HT29细胞的增殖、迁移和侵袭。白桦酸对结直肠癌具有潜在治疗作用。

miR-508-5P慢病毒过表达载体的构建及对S期激酶相关蛋白2靶向调控作用

目的构建miR-508-5p慢病毒过表达载体,探讨其对SKP2基因的靶向调控作用。方法基于化学法合成miR-508-5p茎环结构RNA,将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定,将阳性重组体转染至HEK293T细胞;同时构建与miR-508-5p互补靶基因SKP2的3'非翻译区(3'UTR),将其克隆入线性化的pMIR-Report载体中。通过相对荧光素酶活性、Western blot法及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法验证miR-508-5p与SKP2 3'UTR的靶向调控关系。结果经PCR、酶切及测序结果证明成功构建了pSicoR-miR-508-5p及pMIR-Report-SKP2-3'UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05);抑制miR-508-5p的表达,则明显上调SKP2的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05)。结论成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实通过靶向作用于SKP2-3'UTR的特异序列直接抑制SKP2基因的表达。

miR-508-5p慢病毒过表达载体构建及对MAPK1/ERK信号通路靶向抑制作用的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-508-5p小分子的慢病毒过表达载体,研究其对MAPK1/ERK信号通路靶向调控作用。方法:利用化学合成miR-508-5p茎环结构RNA,并将其克隆入线性化的pSicoR质粒中,经双酶切及测序鉴定;同时构建与miR-508-5p互补靶基因MAPK1的3'非翻译区,将其克隆入线性化的Report载体中。利用脂质体转染试剂将鉴定阳性的pSicoR-miR-508-5p重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过Relative luciferase activity、Western blot及real-time PCR试验检测MAPK1蛋白和mRNA相对表达水平。结果:酶切及测序结果证明成功构建pSicoR-miR-508-5p及Report-MAPK1 3'-UTR重组质粒,并通过实验证实miR-508-5p过表达明显抑制MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05);抑制miR-508-5p的表达,又明显上调MAPK1的蛋白表达水平及mRNA相对含量(P<0.05)。结论:成功构建pSicoR-miR-508-5p慢病毒过表达载体,证实miR-508-5p直接靶标MAPK1的表达,在转录后水平对其进行负调控,为进一步研究miRNA对细胞通路和细胞周期的调控作用奠定了基础。

miR-508-5p介导mTOR对骨肉瘤细胞自噬的影响

目的:探讨miR-508-5p对骨肉瘤细胞自噬及雷帕霉素靶向基因(mTOR)信号通路的影响。方法:收集近五年收治的59例骨肉瘤患者的癌组织与癌旁正常组织,另购买人骨肉瘤细胞株MG-63与人成骨细胞hFOB,采用RT-PCR法检测各组织与细胞中miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;将MG-63细胞分成三组:空白组不进行转染,NC组转染空载质粒,过表达组转染miR-508-5p重组质粒,采用CCK-8法检测转染培养后的三组细胞增殖情况,流式细胞仪检测三组细胞凋亡率,采用RT-PCR法检测各组miR-508-5p与mTOR mRNA的相对表达量;采用Western blot法检测细胞中mTOR、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ与LC3-Ⅱ蛋白的相对表达量。结果:相比癌旁正常组织与hFOB细胞,癌组织与MG-63细胞中miR-508-5p相对表达量均明显降低,而mTOR mRNA的相对表达量均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);相比空白组与NC组,过表达组miR-508-5p相对表达量明显上升,mTOR mRNA的相对表达量明显降低,细胞OD值明显降低,凋亡率明显增加,Bax与LC3-Ⅱ蛋白表达量均升高,而mTOR、Bcl-2与LC3-Ⅰ蛋白相对表达量均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:miR-508-5p在骨肉瘤细胞中呈现低表达趋势,过表达miR-508-5p后可通过抑制mTOR通路,引发细胞自噬,从而抑制细胞增殖与促进细胞凋亡。

三叶青乙酸乙酯提取物通过miR-508-5p/CDCA5轴调控卵巢癌增殖、侵袭及迁移机制研究

目的 观察三叶青乙酸乙酯提取物卵巢癌增殖、侵袭及迁移的影响及可能机制。方法 体外培养卵巢癌SK-OV-3细胞,然后分为对照组、不同剂量三叶青乙酸乙酯提取物处理组(10μg/mL、30μg/mL、60μg/mL)组、NC mimic组、miR-508-5pmimic组、60μg/mL三叶青乙酸乙酯提取物+NCinhibitor组和60μg/mL三叶青乙酸乙酯提取物+miR-508-5pinhibitor组,MTT法检测细胞增殖,Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,RT-PCR检测细胞中miR-508-5p的表达,Western blot法检测CDCA5的表达,双萤光素酶实验验证miR-508-5p和CDCA5的靶向调控关系。结果 与对照组比较,不同剂量三叶青乙酸乙酯提取物处理组(10μg/mL、30μg/mL、60μg/mL)处理后,卵巢癌SK-OV-3细胞增殖、侵袭和迁移以及CDCA5表达明显下降(P<0.05),miR-508-5p表达升高,miR-508-5p mimic组细胞增殖、侵袭和迁移以及CDCA5表达明显低于对照组和NCmimic组(P<0.05),miR-508-5p负向调控CDCA5,与60μg/mL三叶青乙酸乙酯提取物处理组和60μg/mL三叶青乙酸乙酯提取物+NC inhibitor组相比,60μg/mL三叶青乙酸乙酯提取物+miR-508-5p inhibitor组细胞增殖、侵袭和迁移以及CDCA5明显升高(P<0.05)。结论 三叶青乙酸乙酯提取物能够明显抑制卵巢癌SK-OV-3细胞增殖、侵袭以及迁移,其作用机制可能与调控miR-508-5p/CDCA5轴有关。