miR-544a在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的:探讨结直肠癌患者组织中微小RNA-544a(miR-544a)的表达水平及其与患者预后的关系。方法:选取2016年1月—2019年2月住院并接受手术的150例结直肠癌患者,采用实时荧光定量PCR法检测癌组织中miR-544a的表达情况,免疫组织化学法检测癌组织中Ki67、CD4、CD8表达情况。Mann-Whitney U检验、卡方检验和Fisher精确检验分析癌组织中miR-544a表达水平与患者临床病理指标的关系。单因素和多因素Cox回归分析影响结直肠癌预后的因素。Kaplan-Meier法分析结直肠癌组织中miR-544a表达水平与患者无病生存期(DFS)、总生存期(OS)的关系。结果:结直肠癌组织中miR-544a相对表达水平为1.85±0.15,高于癌旁正常组织的1.06±0.21,差异具有统计学意义(P<0.01)。miR-544a表达水平与周围神经侵犯率、T分期、N分期有关(均为P<0.01),miR-544a高表达组神经侵犯率高,T、N分期较晚。免疫组织化学检测结果显示,miR-544a高表达组Ki67评分为120.2±33.7,低表达组Ki67评分为112.4±40.8,两组差异无统计学意义(P>0.05);miR-544a高表达组患者CD4、CD8评分分别为15.5±5.3和24.8±7.6,均低于miR-544a低表达组(分别为21.3±7.2和29.6±8.9),差异均具有统计学意义(均为P<0.05)。单因素、多因素Cox回归分析显示肿瘤N、M分期及miR-544a表达水平与CRC患者根治术后DFS、OS显著相关(均为P<0.01)。结论:结直肠癌组织中miR-544a表达水平上调,miR-544a高表达与结直肠癌患者较晚的N、M分期以及不良预后有关,且miR-544a可能是反映免疫治疗效果的潜在标志物。

miR-544a对非小细胞肺癌细胞系Wnt信号通路抑制因子GSK3β表达的调控作用

目的探讨微小RNA-544a(miR-544a)对肺癌干细胞的自我更新能力影响及其可能的机制。方法通过生物信息学预测miR-544a的靶向基因,用荧光素酶报告系统及western blot验证其靶向关系;构建稳定表达miR-544a的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系95C和95D,并用荧光定量PCR验证;用肿瘤球悬浮培养实验检测miR-544a在形成肿瘤球中的作用。结果生物信息学预测发现,miR-544a可以靶向调节Wnt信号通路的抑制子GSK3β,并通过荧光素酶报告系统得到了验证(F=201.37,P<0.01);western blot结果显示,miR-544a可以下调GSK3β的表达,而β-catenin、CD133蛋白表达水平明显上调(F分别为7.73,3.37,9.43,P均<0.01);荧光定量PCR结果显示,95C、95D细胞在转染miR-544a后,miR-544a表达水平增高,分别为20.51±0.97、15.16±1.38(F=418.05,P<0.01)。肿瘤球悬浮培养实验发现,稳定表达miR-544a的细胞能够反复形成具有肿瘤干细胞特性的肿瘤球。结论 miR-544a可以通过直接下调GSK3β的表达来激活Wnt信号通路,以维持肺癌干细胞自我更新能力。

转染miR-544a对肺癌细胞侵袭和转移能力的影响

目的探讨miR-544a对肺癌细胞的侵袭和转移能力的影响及其分子机制。方法用miRNA芯片对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系95C和95D进行miRNA谱系分析,并用荧光定量PCR验证其miR-544a表达水平;用Targetscan软件预测miR-544a的靶基因;Transwell实验观察细胞的侵袭转移能力的变化;western blot验证其表达。结果 miRNA芯片及荧光定量PCR结果显示,与95C细胞(1.00±0.00)比较,miR-544a在95D细胞中表达上调(2.95±0.26,t=12.94,P<0.05);Transwell实验结果显示,95C转染miR-544a mimic后增加(32.00±1.00,q=18.67,P<0.01),95D转染miR-544a inhibitor后,侵袭和转移能力降低(11.00±1.00,q=13.67,P<0.01);Targetscan软件预测E-钙粘连素(CDH1)可能为miR-544a的靶基因;western blot显示,95C转染miR-544a mimic后,CDH1表达下调,vimentin表达上调(0.202±0.017,0.574±0.009,q分别为63.86,9.45,P均<0.01);而95D转染miR-544a inhibitor后,CDH1表达上调,而vimentin表达下调(0.769±0.014,0.320±0.020,q分别为18.67,5.99,P均<0.01)。结论 miR-544a可能通过下调CDH1和上调vimentin的表达来促进肺癌细胞的侵袭和转移。

TDRKH-AS1抑制miR-544a对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响

目的:探讨TDRKH-AS1对肺癌细胞增殖、迁移侵袭的影响及分子机制。方法:选取辽阳市中心医院30例肺癌患者的癌组织和相应的癌旁组织,实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织中TDRKH-AS1 mRNA和miR-544a的表达水平;将肺癌细胞A549分为pcDNA组、pcDNA-TDRKH-AS1组、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-NC组、pcDNA-TDRKH-AS1+miR-544a组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞存活率;克隆形成实验检测细胞克隆形成数;Transwell检测细胞迁移和侵袭;荧光素酶报告实验检测TDRKH-AS1和miR-544a的靶向关系;蛋白质印迹(Western blot)法检测蛋白表达。结果:与癌旁组织相比,肺癌组织中TDRKH-AS1 mRNA表达水平降低,miR-544a表达水平升高(P<0.05)。与pcDNA组相比,pcDNA-TDRKH-AS1组TDRKHAS1表达水平升高,miR-544a表达水平降低,细胞存活率降低,克隆形成数减少,迁移、侵袭细胞的数量减少,Ki67、N-cadherin的表达水平降低,E-cadherin的表达水平升高(P<0.05)。miR-544a逆转了TDRKH-AS1对A549增殖、迁移、侵袭的影响。TDRKH-AS1靶向调控miR-544a。结论:过表达TDRKH-AS1可能通过下调miR-544a抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭。

miR-544靶向TGF-β抑制神经胶质母细胞瘤细胞迁移、侵袭及EMT

目的探究miR-544在神经胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程中的作用及机制。方法采用RT-qPCR检测miR-544及TGF-β在GBM组织和癌旁组织、GBM转移与非转移的病人血清中的表达。在GBM细胞系U251中转染MiR-544 mimics。采用Transwell、Western boltting检测细胞迁移及侵袭,EMT相关蛋白(E-cadherin和N-cadherin)的变化。荧光素酶报告基因验证miR-544与TGF-β基因3’UTR区结合。结果miR-544在GBM组织及转移组中表达显著降低;TGF-β显著升高(P<0.05)。荧光素酶报告证实miR-544靶向调节TGF-β3’-UTR区域。miR-544 mimics组及si-TGF-β组与NC组相比,细胞迁移与侵袭数目减少(P<0.05);E-cadherin蛋白表达增加,N-cadherin蛋白表达减少(P<0.05)。miR-544mimics+pcDNA-TGF-β组部分逆转了miR-544 mimics对细胞迁移与侵袭和EMT相关蛋白的表达的作用(P<0.05)。结论miR-544靶向调控TGF-β是其参与EMT过程的作用机制之一。

miR-544靶向DUSP13抑制神经胶质瘤细胞增殖、周期分布和凋亡

目的探究miR-544在神经胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)细胞增殖中的作用及机制。方法采用RT-qPCR检测miR-544及DUSP13在GBM组织和细胞中的表达。过表达miR-544后,CCK-8检测细胞活性变化;克隆形成实验检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。DUSP13与miR-544的靶向关系通过荧光素酶报告实验来证实。结果GBM组织和细胞中miR-544表达显著低于癌旁组织和正常细胞(P<0.05),DUSP13表达水平显著高于癌旁组织和正常细胞(P<0.05)。过表达miR-544显著抑制细胞增殖和细胞活力,阻滞细胞周期,诱导细胞凋亡(P<0.05)。过表达miR-544显著降低DUSP1表达水平(P<0.05)。miR-544靶向作用与DUSP13。过表达DUSP13显著削弱过表达miR-544对U87细胞增殖、周期分布和凋亡的影响(P<0.05)。结论miR-544靶向DUSP13抑制神经胶质瘤细胞增殖、周期分布和凋亡,为临床靶向治疗提供新思路。

miR-544调控foxo1通路对胶质母细胞瘤增殖、迁移和自噬的影响

目的:探讨miR-544调控foxo1通路调控胶质母细胞瘤增殖、迁移和自噬机制。方法:分别转染miR-544模拟物和抑制物于U251胶质母细胞瘤细胞株,通过MTT增殖试验检测其对U251胶质母细胞瘤细胞增殖影响,划痕实验检测细胞迁移能力,通过RT-PCR检测转染的效果FOXO1mRNA的变化,Westernblotting检测FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的变化。结果:miR-544模拟物转染后及FOXO1mRNA表达上调、FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加,miR-544抑制物转染后FOXO1mRNA表达下调、FOXO1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达下调。结论:上调miR-544可通过调控foxo1通路抑制胶质母细胞瘤迁移、侵袭和增加胶质母细胞瘤自噬,有可能作为治疗胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。

miR-544在心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制研究

目的探讨微小RNA 544(miR-544)在心肌梗死大鼠心肌纤维化的作用机制。方法将大鼠随机分成假手术组、模型组、转染组-1和转染组-2。假手术组、模型组心脏注射磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS),转染组-1和转染组-2分别心脏注射9型重组腺相关病毒(rAAV9)-miR-544-mimics-NC病毒载体和rAAV9-miR-544-mimics病毒载体。注射30 min后,采用无菌7-0结扎线结扎大鼠的左前降支冠状动脉的方法来构建心肌梗死大鼠模型。依次使用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)染色、免疫组化染色法检测各组大鼠心肌组织miR-544表达水平、心肌梗死比例、Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的表达;荧光素酶报告基因分析miR-544与果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白3(drosophila mothers against decapentaplegic 3,Smad3)的作用关系,以蛋白质印迹法测定大鼠心肌组织中转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Smad3蛋白的表达。结果假手术组、模型组、转染组-1和转染组-2大鼠心肌组织miR-544相对表达水平依次为1.02±0.08,0.43±0.16,0.40±0.14,0.68±0.04;心肌梗死比例依次为0,(58.22±0.13)%,(56.78±0.37)%,(19.86±0.15)%;Ⅰ型胶原蛋白的相对表达水平依次为1.01±0.03,4.56±0.16,4.32±0.41,2.01±0.12;Ⅲ型胶原蛋白的相对表达水平依次为0.99±0.04,7.63±0.13,7.52±0.28,2.16±0.28;TGF-β1的相对表达水平依次为1.00±0.01,4.25±0.08,4.23±0.09,1.86±0.06;Smad3的相对表达水平依次为0.99±0.02,4.73±0.13,4.75±0.11,2.25±0.07。模型组与假手术组比较,转染组-2与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miR-544能靶向调控Smad3的表达,进而阻断TGF-β1/Smad3信号通路,以发挥其抗纤维化效应。